CN1717484A - 反义寡核苷酸的分离 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从生物溶液中分离完全硫代化的单链反义寡核苷酸的方法，该方法包含下述步骤：使生物溶液与固定化的金属离子吸附色谱法(IMAC)树脂相接触，以将反义寡核苷酸吸附到所述树脂上，并随后在能使反义寡核苷酸从所述树脂解吸的条件下，使树脂与洗脱剂接触，其中完全硫代化的反义寡核苷酸从所述溶液中的未正确地硫代化的反义寡核苷酸中分离出来。本发明还涉及固定化的金属离子吸附色谱法(IMAC)树脂在从生物溶液中分离完全硫代化的单链反义寡核苷酸中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及从生物溶液的其它组分中分离反义寡核苷酸的方法。
背景
为了研究目的以及为了制备新种类的药物，使用生物技术方法来提高蛋白、肽、核酸和其它生物化合物的生产。在该背景下，由于其对化合物的通用性和敏感性，色谱法经常是优选的纯化方法。术语“色谱法”包括一系列密切相关的分离方法，它们都是基于同一原理，即，使2个互不混溶的相彼此接触。更具体地，将目标化合物导入流动相，该相与固定相接触。然后，随着流动相携带其穿过系统，目标化合物会经历一系列的固定相和流动相之间的相互作用。该相互作用利用了样品中的组分的物理或化学性质的差异。
目标化合物和固定相上的金属螯合基团之间的相互作用用在名称为固定化的金属离子吸附色谱法(IMAC)的色谱纯化方法中，其也称作金属螯合亲和色谱法(MCAC)，其经常用于蛋白的纯化。IMAC的原理是下述事实，即许多过渡金属离子可以与磷酸盐基团和氮原子配位，例如在氨基酸组氨酸、半胱氨酸和色氨酸中，通过氨基酸侧链上的电子供体基团。为了将该相互作用用于色谱目的，必须将金属离子固定化在不溶的支持物上。这可以通过将螯合基团附着到色谱基质上来完成。更重要的是，为了有用，选择的金属对基质的亲和力必须比对要纯化的化合物的亲和力更高。合适的配位离子的实例是Cu(II)、Zn(II)、Ni(II)、Ca(II)、Co(II)、Mg(II)、Fe(III)、Al(III)、Ga(III)、Sc(III)等。已知多种用于IMAC的螯合基团，例如三配位基的螯合剂亚氨基二乙酸(IDA)和四配位基的螯合剂氨三乙酸(NTA)。关于蛋白的IMAC树脂洗脱通常是通过加入咪唑来进行的。或者，常规地通过降低pH来进行洗脱。
近年来，IMAC已经成功地用于纯化蛋白和肽，其中已经通过重组技术导入了His-标记物，以有利于它们通过IMAC进行的有效纯化。为此原因，IMAC已经在大规模的蛋白和/或肽生产中起更重要的作用。另外，IMAC还已经用于从胰蛋白酶的蛋白消化物中纯化磷酸化的蛋白和肽。随后可以通过ESI/MS/MS分析这样的磷酸化的蛋白和肽，以确定其中的磷酸化的位点。
而且，在IMAC还是相对较新的时期，提出了它在纯化多种化合物中的应用。例如，Porath等(USP 4,677,027)在1985年公开了如何使用由固相组成的产品来分离生物大分子和微粒，所述固相在其表面具有固定化的金属离子，其通过金属螯合键被聚合物取代。关注的生物分子是病毒和细胞，但是也可以提及多糖、蛋白和寡核苷酸。但是，此后，由于最新的科学成就发现了寡核苷酸的新的应用，又反过来使得其新的改进成为必要。
最新开发的领域(其中修饰了寡核苷酸)的一个实例是药物发现中的反义技术。反义药物在基因水平发挥作用，打断造成疾病的蛋白的生成过程。这是合理的，因为已经证实了蛋白实际上在人代谢的每个方面都起中心作用。几乎所有的人类疾病都是不适当的蛋白生成或紊乱的蛋白性能的结果。这对于宿主病(host diseases)(例如癌症)和感染性疾病(例如AIDS)都是正确的。传统药物是设计成在整个身体内与支持或造成疾病的蛋白分子相互作用。反义药物是设计成抑制造成疾病的蛋白的生成。它们可以设计为用于治疗广范围的疾病，包括感染性的、炎性的和心血管的疾病以及癌症，且具有更选择性的潜力，结果，比常规药物具有更高的有效性和更低的毒性。已经广泛地描述了反义技术的机制，参见例如Uhlmann等AntisenseOligonucleotides：A New Therapeutic Principle，Chemical Reviews，Vol.90，Number 4，1990年6月。简而言之，如众所周知的，在DNA转录成RNA的过程中，DNA的2条互补链部分地解螺旋，由此称作有义链的链与称作反义链的链分离。然后，反义链在称作转录的过程中用作能装配mRNA的转录酶的模板。然后，mRNA迁移到细胞中，在那里，核糖体在称作翻译的过程中解读编码的信息，并将氨基酸串连到一起形成特定的蛋白。现在，反义药物是mRNA小片段的互补链，它们可以是DNA或RNA。为了生成反义药物，将核苷酸连到一起形成称作寡核苷酸的短链。每种反义药物设计为用于结合其mRNA目标中的特异性的核苷酸序列，以抑制目标mRNA编码的蛋白的生成。
对于临床研究和商业药物供应商而言，在任意种类的市场上可买到的用于在cGMP条件下合成寡核苷酸的自动固相合成仪中，可以将寡核苷酸连接到一起。在这样的合成中，能容易地生成寡核苷酸，其中天然核酸中的每个碱基的磷酸酯基团的一个氧原子已经替换为硫原子。但是，合成这样的硫代寡核苷酸(在本文中名称为反义寡核苷酸)的一个固有问题是下述事实，即实践中不可能得到100％收率的正确地硫代磷酸化的寡核苷酸。相反，通常得到约70-75％的收率。因此，在制备出其任何反义药物之前，合成的产物需要后续的纯化，以确保充分的质量。
反相HPLC通常用于纯化反义寡核苷酸。但是，对于这类过程而言，通常不认为使用高压是有利的条件，因为它对使用的装置提出了更高的要求，并且使得该过程难以按比例放大，且因而成本昂贵。另外，在该技术中通常使用的有机溶剂对于一些用途是不合需要的。
Deshmukh等(Deshmukh，R.R.，Miller，J.E.，De Leon，P.，Leitch，W.E.，Cole，D.L.，和Sanghvi，Y.S.in“Process Development forPurification of Therapeutic Antisense Oligonucleotides by Anion-Exchange Chromatography”，Organic Process Research &Development 2000，4，205-213)描述了用于纯化硫代磷酸化的反义寡核苷酸的阴离子交换色谱法的发展。更具体地，合成了20-聚物，其是细胞粘附分子ICAM-1的反义抑制剂，并随后在阴离子交换器上进行了纯化，所述阴离子交换器在基于聚苯乙烯的基质上带有季铵官能团(Source 15和Source Q 30，均来自Amersham Biosciences AB，Uppsala，瑞典)。在更高的测试pH值观察到了最有利的洗脱分辨率，它是pH11。但是，仍然需要显示完全硫代化的20-聚物是否能从其中一个或多个目标氧尚未被硫取代的20-聚物中分离出来。因而，从用于纯化反义寡核苷酸的离子交换可以得到的选择性仍然是不能令人完全满意的。另外，另一个缺点是，这样通过阴离子交换色谱法纯化反义寡核苷酸还需要后面的脱盐步骤，其包括进一步的加工步骤，结果造成更高的总工艺成本。
类似地，Deshmukh等(Deshmukh，R.R.，Warner，T.N.，Hutchison，F.，Murphhy，M.，Leitch，W.E.，De Leon，P.，Srivatsa，G.S.，Cole，D.L.，和Sanghvi，Y.S.in“Large-scale purification of antisenseoligonucleotides by high-performance membrane adsorberchromatography”，Journal of Chromatography A，890(2000)179-192)已经提出，使用强阴离子交换膜来纯化反义寡核苷酸。但是，如同上述的方法，可得到的选择性仍然是不能令人完全满意的(如果确实如此，我们还可以补充任何其它的缺点/差异)。另外，膜的使用造成了较低的能力，因此为了实现合理有效的工艺，将需要大尺寸的膜。最后，该方法像上面讨论的阴离子交换一样，也需要后面的脱盐步骤。
WO 99/09045(Somagenics，Inc.)涉及具有改进的结合性质的反义和抗基因(antigene)治疗剂和它们的使用方法。更具体地，该发明涉及反义和抗基因寡核苷酸，其能以提高翻译和转录抑制性能的方式拓扑地连接到目标核酸。在一个实施方案中，公开了核酸的硫代磷酸酯类似物，其以硫替代非桥联氧结合在末端或核苷酸间的磷酸酯上的亚磷上。据称该修饰比未修饰的等同物能更强地结合到金属-亲和色谱法介质上。但是，其中没有提示或教导金属-亲和色谱法可以用于分离具有不同硫代程度的寡核苷酸。而且，在另一个实施方案中，寡核苷酸已经铂酸盐化。通过制备电泳，或者通过离子交换柱色谱法，可以将这样铂酸盐化的寡核苷酸容易地从反应混合物中分离出来。它还提示使用在汞化了的柱上的金属-亲和色谱法作为纯化铂酸盐化的寡核苷酸的一步法，但是这仅仅是提示。该文件中的任何内容都不能证明，这样的纯化是有效的或甚至可行的，也没有定义所述的“反应混合物”的组分。
因而，仍然需要纯化反义寡核苷酸的替代方法，尤其是敏感度足以将具有不同硫代程度的反义寡核苷酸彼此分离的方法。
发明概述
本发明的一个目的是，提供从生物溶液中的相应的不正确地合成的寡核苷酸和/或不完全硫代化的寡核苷酸中分离反义寡核苷酸的方法。这可以通过如权利要求中所定义的方法实现。
本发明的一个具体目的是，提供从生物溶液中分离反义寡核苷酸的方法，与现有技术中的方法相比，该方法表现出提高的选择性。
本发明的另一个目的是，提供从生物溶液中分离反义寡核苷酸的方法，与现有技术中的方法相比，该方法减少了对有机溶剂和/或高压的需要。
本发明的另一个目的是，提供从生物溶液中分离反义寡核苷酸的方法，与现有技术中的方法相比，该方法更容易按比例放大，因此更经济。
从下面的详细公开内容中，能明白本发明的其它目的和优点。
附图简述
图1显示了(a)7个碱基的全长的、完全硫代化的硫代磷酸酯的一个实例；(b)其单磷酸二酯类似物，和(c)单一缺失的序列。
图2显示了如下面实施例1所述使用Fe3+作为金属离子的IMAC，并对比了具有相同碱基序列的2种不同寡核苷酸的洗脱。
图3显示了如下面实施例2所述使用Zr2+作为金属离子的IMAC，并对比了具有相同碱基序列的2种不同寡核苷酸的洗脱。
图4显示了使用IMAC将完全硫代化的(20S)寡核苷酸从含有2个磷酸二酯键(“2P”)的寡核苷酸中有效地分离的一个实例。
图5显示了使用IMAC将完全硫代化的(20S)寡核苷酸从含有2个磷酸二酯键(“2P”)的寡核苷酸中清楚地分离，这次通过分步洗脱。
定义
在本说明书中，术语“寡核苷酸”以其常规含义使用，即指核苷酸序列，术语“多核苷酸”是指比寡核苷酸更长的核苷酸序列。
术语“核苷酸”是指由3个部分组成的残基，即无机磷酸酯、简单的糖和嘌呤或嘧啶碱基。在每种核苷酸中，这3个部分以-磷酸酯-糖-碱基-的次序相互连接。在寡核苷酸中，酯键连接糖和相邻的核苷酸单体的磷酸酯组分。由于核苷酸单体中的糖和磷酸酯也是通过酯键连接的，所以沿着多-或寡核苷酸链的主链的糖-磷酸酯-糖连接称作磷酸二酯键。
术语“色谱法”包括在填充柱中、在膨胀床或悬浮床中和在膜上进行的色谱分离方法。
术语“树脂”是指在色谱法中使用的固相，即捕获目标物质的吸附剂。“树脂”可以制成有孔的或无孔的球形的或基本上球形的微粒、珠子的形式，例如用于膨胀床吸附的珠子和整块的形式。而且，通过在支持物上提供树脂，可以提供膜，其也用于从液体中分离物质。在该领域中，树脂也称作基质。
术语“吸附”在这里是指物质与树脂上的配体的结合。
术语“洗脱剂”在这里以其常规含义使用，即能干扰固相(树脂)和产物(目标物质)之间的相互作用、并促进产物选择性地从固相离解的溶液。
因此，术语“解吸”是指干扰如上所述的相互作用。
术语“缓冲液”或“缓冲的溶液”是指酸和碱的混合物，当存在于溶液中时，其能减小或调节加入酸或碱时溶液会产生的pH变化。
术语“分离”在这里是指从其它组分中分离出来，并提供基本上纯的目标化合物，例如基本上纯的反义寡核苷酸。
发明详述
本发明的第一方面是，从生物溶液中分离完全硫代化的单链反义寡核苷酸的方法，其包含下述步骤：使生物溶液与固定化的金属离子吸附色谱法(IMAC)树脂相接触，以将反义寡核苷酸吸附到所述树脂上，并随后在能使反义寡核苷酸从所述树脂解吸的条件下，使树脂与洗脱剂接触，其中完全硫代化的反义寡核苷酸从所述溶液中的未正确地硫代化的反义寡核苷酸中分离出来。因此，本发明能从生物溶液的其它组分中纯化出完全硫代化的单链反义寡核苷酸，并由此得到基本上纯的形式的所述寡核苷酸。
如本领域的技术人员所熟知的，在合成反义寡核苷酸的过程中，除了不正确的长度的寡核苷酸外，最常见的污染是未完全硫代化的寡核苷酸。因此，本发明满足了生产用于治疗或其它用途的反义寡核苷酸的重要需求。
因此，据我们所知，本发明在反义寡核苷酸的纯化中首次利用了金属与核酸的主链硫代磷酸酯基团之间的相互作用。不希望将本发明限制到任何具体的相互作用，还假设寡核苷酸的一种或多种碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶的氮原子也可能参与该结合。
在本发明的上下文中应当理解，术语“完全”硫代化的是指在相应的天然寡核苷酸中存在的100％磷酸酯主链基团中，磷酸酯主链中的一个非桥联氧原子已经被置换为硫原子。
在本方法中使用的IMAC树脂可以是任意的树脂，例如在“背景”部分列举的那些。简而言之，金属螯合基团包括例如亚氨基二乙酸(IDA)基团、三(羧甲基)-乙二胺(TED)基团、N-(羟乙基)乙二胺三乙酸基团和衍生物，例如N-(甲基)和N-(羟甲基)IDA基团。通过标准的脂族醚键和试剂，这些基团可以与天然的或合成的聚合支持物相交联，所述试剂例如双环氧乙烷(bisoxirane)、表氯醇和1，4-二-(2，3-环氧丙氧基)丁烷。天然聚合支持物材料的实例是例如琼脂糖、藻酸盐、角叉菜聚糖、明胶等。合成的聚合物例如任选地与任意的常规交联剂(例如二乙烯基苯、二-或多功能的(甲基)丙烯酸酯、二-或多功能的(甲基)丙烯酰胺、异氰脲酸三烯丙酯、二乙烯基酰胺)相交联的苯乙烯或衍生物、二乙烯基苯、丙烯酰胺、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、乙烯基酯、乙烯基酰胺等。为了清楚，在上下文中应当理解，如本方法中使用的IMAC树脂由支持物组成，其上面已经附着了螯合基团，并带有配位离子。合适的配位金属离子的实例是例如Al、Ce、Cu、Co、Fe、In、Ga、Ge、Lu、Ni、Ru、Sb、Sc、Sn、Yc、Zn、Zr、Ta和Th离子。在本发明的一个实施方案中，金属离子是Zr2+或Fe3+。根据本发明，该实施方案提供了与桥的磷之间的键，它比与相应的硫之间的键更强。IMAC树脂也是市场上可以获得的，例如HiTrapTM螯合HP柱和螯合SepharoseTM Fast Flow，均来自Amersham Biosciences AB，Uppsala，瑞典。
在上下文中应当理解，术语“树脂”用于包括微粒和珠子，以及整块和膜。
所需的反义寡核苷酸可以从生物溶液的许多种类的组分，例如蛋白或未正确地合成的寡核苷酸中分离出来，很大程度上取决于生物溶液的性质。因而，在一个实施方案中，生物溶液来自自动合成的反义寡核苷酸。因此，在该实施方案中，生物溶液是合成溶液。在类似的实施方案中，生物溶液是这样的溶液，其中已经使用非自动化的方法合成了反义寡核苷酸。因此，根据众所周知的方法，或者在任何市场上可以获得的类型的装置、例如KTATM oligopilot(AmershamBiosciences AB，Uppsala，瑞典)中，可以在溶液中进行合成。在另一实施方案中，生物溶液是血清，例如人血清，这时该方法的目的是对其中存在的反义寡核苷酸进行定量。该实施方案可以是治疗方案的一部分，其中需要测试患者的血液中的药物(即反义寡核苷酸)的存在。
在一个实施方案中，分离的单链(ss)反义寡核苷酸的大小为10-30个碱基，例如15-25个碱基，更具体地18-21个碱基。在一个具体的实施方案中，反义寡核苷酸的大小为约18-20个碱基。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸由高达约25个碱基、例如高达20个碱基组成。在另一个实施方案中，反义寡核苷酸由至少5个碱基、例如至少约10个碱基组成。但是，在本上下文中，由于众所周知要使用反义技术治疗的状况的类型会决定反义寡核苷酸的性质，例如碱基序列和大小，应当理解本发明还包括更短的或更长的寡核苷酸，如果它们在基于反义技术的药物中是有用的话。这样的药物可以用于治疗宿主病(例如癌症)和感染性疾病，如在上面的“背景”部分所详细讨论的。
但是，还如在上面的“背景”部分所述的，反义寡核苷酸的合成经常部分地产生未正确地合成的反义寡核苷酸。这样合成得到的生物溶液中的最常见的杂质是缺失序列，即比所需产物短一个或多个碱基的反义寡核苷酸。这样的缺失的寡核苷酸可以描述成(n-1)聚物、(n-2)聚物、(n-3)聚物等，其中n代表所需全长产物的核苷酸数目。因此，在本方法的一个实施方案中，完全硫代化的反义寡核苷酸是从未正确地合成的寡核苷酸中分离出来的。未正确地合成的寡核苷酸的其它实例是添加序列，即比所需产物更长的反义寡核苷酸，和分支的产物。
从反义寡核苷酸合成得到的生物溶液中的不希望的组分的另一个实例是未正确地硫代化的序列，即不完全硫代化的寡核苷酸。如上所述，它们是合成溶液中最常见的污染之一。最常见的形式是其中有1个或2个键没有硫代化的寡核苷酸。因此，在本方法的一个实施方案中，完全硫代化的反义寡核苷酸是从含有1至5个、例如1或2个没有硫代化的键的未正确地硫代化的反义寡核苷酸中分离出来的。未正确地硫代化的寡核苷酸的其它实例是，例如，20-聚物的寡核苷酸，其中一个磷酸二酯基团没有被正确地硫代化，因此约95％硫代化的寡核苷酸从完全硫代化的寡核苷酸中分离出来。类似地，其中一个碱基没有被正确地硫代化的19-聚物的、18-聚物的或17-聚物的寡核苷酸被硫代化至约94％。因此，在一个实施方案中，本发明的完全硫代化的反义寡核苷酸是从硫代化至约90％、例如约94％和优选地至约95％的寡核苷酸中分离出来的。在另一个实施方案中，本发明的完全硫代化的反义寡核苷酸是从硫代化至约40％、优选地至约60％、更优选地至约80％和最优选地至约90％的寡核苷酸中分离出来的。
在现有技术中，当蛋白和/或肽已经使用IMAC分离出来时，使用了中性的或接近中性pH的条件，例如约7.5-8.0。本发明的发明人意外地发现，当使用IMAC分离反义寡核苷酸时，更低的pH是更有利的。因此，在本方法的一个实施方案中，将吸附条件限定为低于中性的pH值。在一个具体的实施方案中，将pH改变为低于约7，例如约5。因此，与树脂接触的生物溶液的pH可以是在0-7、0-6或0-5的范围内。通过加入合适的缓冲液或酸，例如稀释的乙酸，本领域的技术人员能容易地调节pH。在一个有利的实施方案中，将pH调节为约5.0，使用的缓冲液是15mM的乙酸钠。如容易地认识到的，由于寡核苷酸对极端pH值是敏感的，应当小心地调节pH，使其不会以任何方式损害反义寡核苷酸。
根据标准方法，使用递增的pH和/或磷酸盐梯度，例如使用磷酸钾，可以从树脂洗脱所需的反义寡核苷酸。示例性的梯度如在下面的实验部分所使用的，即从用于吸附的pH开始，例如从0.1％乙酸至0.5M磷酸钾。在一个替代实施方案中，梯度是从pH 3.0至0.2M磷酸钾。其它众所周知的盐和缓冲液也可以用于洗脱，本领域的技术人员能容易地设定合适的洗脱条件。如本领域的技术人员能认识到的，加入盐会提高离子强度，因此反义寡核苷酸周围的pH会轻微地变化。但是，在吸附反义寡核苷酸的过程中，pH通常会仍然低于已知用于蛋白分离的IMAC所使用的条件。
在具体的实施方案中，本发明的方法另外包括精加工(polish)分离的反义寡核苷酸的后续步骤。本领域的技术人员能容易地完成这样的精加工，例如通过凝胶过滤、脱三苯甲基作用沉淀、脱盐、改变缓冲液等。
尽管下述的实施例使用了较小的实验室规模，应当明白，本领域的技术人员可以将本方法容易地按比例放大到适用于生产工厂的大小。因此，本方法的一个优点是，它比例如前面提到的反相色谱法(RPC)方法需要更廉价的溶剂和装置。
本发明的第二个方面是通过上述方法分离的反义寡核苷酸。因此，得到了纯度为至少约80％、更优选地至少约90％和最优选地至少约95％、例如接近100％的根据本发明完全硫代化的单链反义寡核苷酸。
本发明的第三个方面是固定化的金属亲和色谱法(IMAC)树脂在从生物溶液中的相应寡核苷酸分离反义寡核苷酸中的应用。该IMAC树脂可以是如关于根据本发明的方法所讨论的，且上面讨论的考虑因素也可以适用于该应用。
最后，本发明还涉及用于从生物溶液中纯化完全硫代化的单链反义寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒包含填充了固定化的金属离子吸附色谱法(IMAC)树脂的色谱柱和关于从未完全硫代化的寡核苷酸分离所述完全硫代化的寡核苷酸的书面说明书。本试剂盒可以包含实验室规模的柱或适用于大规模生产反义寡核苷酸的大小的柱。而且，该试剂盒可以包含适用于洗脱和任选地也适用于洗涤分离室的缓冲液。
附图详述
图1显示了(a)7个碱基的全长的、完全硫代化的硫代磷酸酯的一个实例，(b)其单磷酸二酯类似物，和(c)产生(n-1)聚物的单一缺失的序列。
图2显示了如下面实施例1所述使用Fe3+作为金属离子的IMAC，并对比了具有相同碱基序列的2种不同寡核苷酸的洗脱。X-轴显示了保留体积(ml)，而Y-轴显示了在260nm的紫外吸光度(mAU)。一个寡核苷酸是完全硫代化的(在图2中表示为20S)，而另一个则是未修饰的(在图2中表示为20P)。可以清楚地看出，反义寡核苷酸可以从寡核苷酸的磷酸二酯(未修饰的)形式分离出来，硫代化形式作为相对狭窄的峰在7.3ml处洗脱，先于未修饰的形式。在色谱图中较早洗脱的2个小峰是推测地与合成有关的，并且由样品中的杂质造成，其不含有任何硫代磷酸酯或磷酸二酯基团。
图3显示了如下面实施例2所述使用Zr2+作为金属离子的IMAC，并对比了具有相同碱基序列的2种不同寡核苷酸的洗脱。X-和Y-轴如上所述。一个寡核苷酸是完全硫代化的(在图3中表示为20S)，而另一个则是未修饰的(在图3中表示为20P)。可以清楚地看出，反义寡核苷酸可以从寡核苷酸的磷酸二酯(未修饰的)形式分离出来，硫代化形式仍然作为相对狭窄的峰在约9.4ml处洗脱，先于未修饰的形式。对色谱图中较早洗脱的2个小峰的解释如上面关于图2所述。对比图2和图3，发现寡核苷酸对Zr-离子的亲和力比对Fe-离子的亲和力更强，但是应当指出，没有优化使用的条件。
图4显示了有效地分离具有相同序列的2个寡核苷酸的一个实例，如实施例3所详细描述的。更具体地，该图显示，使用IMAC完全可能从具有2个磷酸二酯键(“2P”)的寡核苷酸中分离出完全硫代化的(20S)寡核苷酸。峰在色谱图中是清楚地分离的。为了洗脱，使用了从15mM乙酸钠至0.2M磷酸钾的10CV线性梯度。
图5又显示了清楚地分离具有相同序列的2个寡核苷酸，如实施例4所描述的。更具体地，该图显示了与完全硫代化的寡核苷酸(20S)相对应的峰离开具有2个磷酸二酯键(“2P”)的寡核苷酸的峰的完整的基线处分辨度。因此，本发明显示使用IMAC和分步洗脱可能从具有2个磷酸二酯键的寡核苷酸中分离出完全硫代化的寡核苷酸。为了洗脱，使用了分步梯度：第1步在0.1M磷酸钾进行，且第2步在0.2M磷酸钾进行。如图4和5所示，在实施例3和4中得到的结果提供了证据来支持磷酸酯基团、而不是碱基在本发明结合中的显著重要性。因此，这与上面讨论的WO 99/09045所述相矛盾，后者声称，更高的硫代化程度会产生更强的与IMAC树脂的结合。
实验部分
这些实施例仅仅用于解释目的，不应当理解为限制所附权利要求限定的本发明的范围。在下面和本说明书中的任何地方给出的所有参考文献都在这里引入作为参考。
实施例1：使用Fe3+作为金属离子通过IMAC纯化单链反义寡核苷酸
在该研究中使用的寡核苷酸是具有序列GCC CAA GCT GGCATC CGT CA的20-聚物。使用了2个不同的寡核苷酸，一个是完全硫代化的，一个是没有任何修饰的(磷酸二酯形式)。
为了研究，使用了具有IDA化学性质的小IMAC柱HiTrapTM螯合HP柱(1ml体积)(购自Amersham Biosciences AB，Uppsala，瑞典，Prod#17-0408-01)。
在该实施例中使用的溶剂/缓冲液是很少用于IMAC的。使用0.1％乙酸水溶液作为结合“缓冲液”。使用从0.1％乙酸水溶液至0.05M磷酸钾的10柱体积的线性梯度完成了洗脱。但是，应当指出，这些条件没有优化过，无论是对于结合(吸附)还是对于洗脱。
洗脱剂的流速是1ml/min，用紫外线在260nm检测。
因而，测试了Fe3+，并发现其在根据本发明的方法中可以用作金属离子。该实施例的结果如图2所示。
实施例2：使用Zr2+作为金属离子通过IMAC纯化单链反义寡核苷酸
在该研究中使用的寡核苷酸是上面实施例1所述的20-聚物。为了研究，使用了具有IDA化学性质的小IMAC柱HiTrapTM螯合HP柱(1ml体积)(购自Amersham Biosciences AB，Uppsala，瑞典，Prod#17-0408-01)。
在该实施例中，结合“缓冲液”与实施例1中的0.1％乙酸水溶液一样。在这里使用从0.1％乙酸水溶液至0.2M磷酸钾的10柱体积的线性梯度完成了洗脱。但是，应当指出，这些条件也没有优化过。
洗脱剂的流速是1ml/min，用紫外线在260nm检测。
因而，测试了Zr2+，并发现其在根据本发明的方法中可以用作金属离子。该实施例的结果如图3所示。
实施例3：通过线性梯度洗脱，使用IMAC从未完全硫代化的寡核苷酸中纯化合成的(反义)寡核苷酸
该实施例显示根据本发明的方法能从仅仅部分地硫代化的寡核苷酸中分离出完全硫代化的寡核苷酸。
在该研究中使用的寡核苷酸是具有序列GCC CAA GCT GGCATC CGT CA的20-聚物。使用了2个不同的寡核苷酸，一个是完全硫代化的，一个具有2个没有任何修饰的键(磷酸二酯形式)。磷酸二酯键分别在位点10和15处(从5′端定义)。
为了研究，使用了具有IDA化学性质的小IMAC柱HiTrapTM螯合HP柱(1ml体积)(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典，Prod#17-0408-01)。研究的金属离子是Zr2+。
在这里使用的溶剂和缓冲液是很少用于IMAC的。使用15mM乙酸钠作为结合缓冲液且pH为5.0。使用磷酸钾(0.2M，pH6.5)完成了洗脱。流速是1ml/min，用紫外线在260nm检测。
结果如图4所示，它还对比了完全硫代化的(20S)和具有2个磷酸二酯键(“2P”)的寡核苷酸。
实施例4：通过分步梯度洗脱，使用IMAC从未完全硫代化的寡核苷酸中纯化合成的(反义)寡核苷酸
这是阐明根据本发明的方法能从部分地硫代化的寡核苷酸中分离出完全硫代化的寡核苷酸的第2个实施例。原材料和仪器如上面实施例3所述，缓冲液是pH5.0的15mM乙酸钠，并且在该实施例中，通过分步梯度进行洗脱。第1步是2CV在0.1M磷酸钾进行，第2步是应用2CV在0.2M磷酸钾进行。结果如图5所示，其显示了对2种寡核苷酸(完全硫代化的(20S)和具有2个磷酸二酯键(“2P”)的寡核苷酸)混合物的分离。
Claims (11)
1.从生物溶液中分离完全硫代化的单链反义寡核苷酸的方法，该方法包含下述步骤：使生物溶液与固定化的金属离子吸附色谱法(IMAC)的树脂相接触，以将反义寡核苷酸吸附到所述树脂上，并随后在能使反义寡核苷酸从所述树脂解吸的条件下，使树脂与洗脱剂接触，其中完全硫代化的反义寡核苷酸从所述溶液中的未正确地硫代化的反义寡核苷酸中分离出来。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的生物溶液来自反义寡核苷酸的合成。
3.根据权利要求1或2的方法，其中完全硫代化的反义寡核苷酸是从未正确地合成的寡核苷酸中分离出来的。
4.根据前述权利要求中的任一项的方法，其中完全硫代化的反义寡核苷酸是从含有1-5个、例如1或2个没有硫代化的键的未正确地硫代化的反义寡核苷酸分离出来的。
5.根据前述权利要求中的任一项的方法，其中金属离子是Zr2+或Fe3+。
6.根据前述权利要求中的任一项的方法，其中反义寡核苷酸的大小为5-30个、优选15-25个碱基对。
7.根据前述权利要求中的任一项的方法，其中在吸附反义寡核苷酸的过程中，生物溶液的pH低于约7。
8.根据前述权利要求中的任一项的方法，其另外包含精加工分离的反义寡核苷酸的后续步骤。
9.通过权利要求1-8中的任一项的方法分离的反义寡核苷酸。
10.用于从生物溶液中纯化完全硫代化的单链反义寡核苷酸的试剂盒，该试剂盒包含填充了固定化的金属离子吸附色谱法(IMAC)的树脂的色谱柱和关于从生物溶液中的未完全硫代化的寡核苷酸中分离所述完全硫代化的寡核苷酸的书面说明书。
11.固定化的金属离子吸附色谱法(IMAC)的树脂在从生物溶液中的未正确地硫代化的反义寡核苷酸中分离完全硫代化的单链反义寡核苷酸中的应用。
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