CN1712020A

CN1712020A - 一种羊膜提取液的制备方法及用途

Info

Publication number: CN1712020A
Application number: CNA2004100277608A
Authority: CN
Inventors: 刘祖国; 蒋爱华
Original assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Current assignee: Zhongshan Ophthalmic Center
Priority date: 2004-06-23
Filing date: 2004-06-23
Publication date: 2005-12-28
Anticipated expiration: 2024-06-23
Also published as: CN100512821C

Abstract

本发明涉及一种羊膜提取液的制备方法。该制备方法包括以下步骤：取剖腹产胎盘，清洗后分离羊膜，液氮研磨后，按重量体积比1∶5～10加入医用生理盐水，匀浆，得匀浆液；匀浆液在0～4℃放置1～7天，于100～120℃加热30～60分钟，过滤，取滤液；调节滤液pH值到3，静置，过滤，取滤液；调节滤液pH值至7.2，无菌条件下0.20－0.22um滤膜过滤，取滤液，即为胎盘组织提取液，0～4℃保存。本发明所述的制备方法工艺简单，可以得到较高浓度的提取液，且保存简便，使用安全，适于临床应用。本发明还涉及羊膜提取液用于制备抑制眼表的新生血管和炎症性疾病的药物的用途，尤其是用于制备治疗角膜碱烧伤的药物的用途。

Description

一种羊膜提取液的制备方法及用途

技术领域

本发明涉及一种羊膜提取液的制备方法，以及羊膜提取液的新用途。

背景技术

羊膜是贴附于胎盘的一层膜状组织，与胎盘仅相隔一层绒毛膜。胎盘含有丰富血管，但羊膜则是透明组织。羊膜用于临床的记载最早见于1910年，最初为羊膜和绒毛膜同时进行移植，1935年单独分离羊膜进行移植。在羊膜的制备和应用方面，合肥市第一人民医院曾于1997年申请中国发明专利“人羊膜的制备方法”，申请号97111074.3，公开号1201697，主要涉及羊膜的制备、保存及在外科手术中应用，促进伤口愈合并减少肌腱粘连。在眼科，羊膜的制备和在临床的应用于2000年由Tseng在美国申请专利，专利号6,152,142，并于2001年再次申请，专利号6,326,019。该专利涉及羊膜的制备、保存以及羊膜移植手术的方法和适应症。大量文献证实，羊膜移植可在翼状胬肉切除术中代替结膜瓣，可促进角膜溃疡的愈合，可用于角膜结膜表面肿瘤和瘢痕切除术，可减少准分子激光角膜切削术后的haze并发症，可防止带状角膜病复发等。

以上所提到羊膜在眼科的应用，都必须做羊膜移植手术，该手术虽然已在眼科得到较为广泛的应用，同时也带来了许多问题。例如，手术花费的成本较高，手术本身又是一种新创伤，且在移植后患者视力和眼睛舒适度都受到一定程度的影响。此外，羊膜植片的制备程序复杂，保存困难，需要昂贵的仪器设备，这些都限制了羊膜的应用，尤其是在基层医院的推广。

为了方便临床应用，D.S.Chang等制备羊膜提取液，加入HaCaT细胞系培养液内，发现可以降低NO水平，从而推测有抑制炎症的作用。D.S.Chang的提取方法主要包括分离羊膜，液氮研磨，匀浆和离心取上清液。提取液的浓度未见报道，最终的应用浓度为10μg/ml和50μg/ml(Photodermatol PhotoimmunolPhotomed.2002Dec；18(6)：280-6)。

Kobayashi N等发现羊膜细胞培养上清液抑制碱性纤维生长因子诱导的角膜新生血管，并发现其抑制人脐带静脉内皮细胞生长。羊膜细胞培养上清液的制备步骤主要包括羊膜分离，胶原酶消化得到羊膜上皮细胞和基质细胞，含血清培养液培养后换为无血清培养液，培养24小时后取上清(Cornea.2002 Jan；21(1)：62-7)。

D.S.Chang等制备的羊膜提取液的蛋白质浓度低，得到的液体量少，且必须在-20℃以下保存，一旦溶解便很容易失去活性，不适合临床应用。

Kobayashi N等制备的羊膜细胞培养上清液同样存在液体量少，蛋白质浓度低和保存困难的问题，也不适合临床应用。

以上方法都必须承担较高的病毒感染的风险。因为一般根据临床血清学检验为HIV、HBV等阴性的指标选择胎盘。但是血清学检验存在假阴性结果，或者孕妇已感染病毒，但做血清学检验时处于病毒感染的窗口期(已感染病毒，但是仍处于潜伏期时，血清学检查为阴性，但已具有传染性)，由此两种胎盘组织获得的羊膜移植片和羊膜提取液中可能含有病毒而成为感染源。

发明内容

本发明的目的在于提供一种羊膜提取液的制备方法，工艺简单，可以得到较高浓度的提取液，且保存简便，使用安全，适于临床应用。

本发明所述的一种羊膜提取液的制备方法，包括以下步骤：

A.取剖腹产胎盘，清洗后分离羊膜，液氮研磨后，按重量体积比1∶5～10加入医用生理盐水，匀浆，得匀浆液；

B.匀浆液在0～4℃放置1～7天，在100～120℃加热30～60分钟，过滤，取滤液；

C.调节滤液pH值到3，静置，过滤，取滤液；

D.调节滤液pH值至7.2，无菌条件下0.20-0.22um滤膜过滤，取滤液，即为羊膜提取液，0～4℃保存。

本发明所述的羊膜提取液与现有技术相比，具有以下优点：

(1)提取液的蛋白质浓度高。按1∶10加入生理盐水得到的提取液用Bio-Rad公司的DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories，2000 Alfred Nobel，CA94547)于750nm光波波长测量蛋白质浓度，得到羊膜组织提取液为2.97mg/ml。而现有文献报道的羊膜提取液的浓度仅为50μg/ml(应用浓度)。

(3)提取液易于保存。置于4℃即可，同时必须保证无菌。

(4)无需手术，直接滴眼，避免手术带来的创伤，避免了羊膜移植植片给患者带来的视力影响和不适感，更适合于临床应用。

(5)降低了病毒感染的风险。提取液制备过程中经100～120℃加热30～60分钟，可灭活临床血清学检验为假阴性或出于病毒感染窗口期的羊膜组织中可能含有的多种病毒，包括HIV病毒，甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)和戊肝病毒(HEV)。

本发明还提供了将所述的羊膜提取液用于制备抑制眼表的新生血管和炎症性疾病，如角膜碱烧伤等的药物的用途。

发明人将上述羊膜提取液制成的滴眼液用于动物模型的角膜碱烧伤治疗，发现该滴眼液具有抑制新生血管和抑制炎症的作用。已通过实验初步证实了羊膜提取液可以抑制角膜碱烧伤的新生血管生长和炎症细胞浸润，提示可用于临床治疗角膜碱烧伤以及眼表的其他新生血管和炎症性疾病。

附图说明

图1为大鼠角膜碱烧伤后不同治疗组治疗7天的统计结果示意图；其中，

图1(a)为大鼠角膜新生血管相对面积的统计结果示意图，

图1(b)为大鼠角膜切片新生血管计数和炎症细胞计数的统计结果示意图。

图2为大鼠角膜碱烧伤不同治疗组治疗7天后石蜡切片HE染色结果示意图；其中，图2(a)为羊膜提取液治疗组的角膜石蜡切片染色图，

图2(b)为生理盐水治疗组的角膜石蜡切片染色图，

图2(c)为复方地塞米松治疗组的角膜石蜡切片染色图。

具体实施方式

实施例一：羊膜提取液的制备

选择产前血清学诊断为HIV、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒均为阴性，行择期剖宫产，胎儿发育正常的胎盘，无菌条件下置于冰面迅速带回。

在超净台上按照细胞培养的无菌标准，用预冷的医用生理盐水冲洗两遍，去除残余血迹，然后将胎盘浸泡于含50u/ml青霉素，50mg/ml链霉素的医用生理盐水，从羊膜破口处开始将羊膜从绒毛膜上分离出来，干燥无菌的小块医用纱布去除羊膜基底面的残余绒毛膜组织。

液氮研磨后，按重量体积比1∶10的比例加入预冷的医用生理盐水，机械匀浆机在冰面对羊膜充分匀浆，将匀浆液收集于医用生理盐水空瓶，密封后置于0～4℃冰箱保存7天。

7天后取出匀浆液，100～120℃加热30～60分钟，冷却后，用医用脱脂纱布粗过滤，在滤液中滴入1M HCl，调节pH值到3，静置，定性滤纸过滤，在滤液中加入1M NaOH，调节pH值至7.2。100～120℃加热30～60分钟，冷却后，在超净台无菌条件下用一次性真空盖式除菌滤器(0.2um，亲水性聚醚砜滤膜，PallCorporation，USA)过滤，滤过液收集于无菌空瓶，Bio-Rad公司的DC蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories，2000 A1fred Nobel，CA 94547)于750nm光波波长测量蛋白浓度，加入医用生理盐水稀释至1mg/ml，用无菌EP管分装后置于0～4℃保存。

具体实施例中，匀浆前加入的预冷医用生理盐水的比例可以为1∶5，或选择1∶5～10之间的一个比例；匀浆液在0～4℃放置1天或数天即可取出进行提取，于100～120℃加热的时间范围是30～60分钟。

实施例二：羊膜提取液用于动物模型的实验

将上述羊膜提取液制成的滴眼液用于动物模型的角膜碱烧伤治疗，发现该滴眼液具有抑制新生血管和抑制炎症的作用。具体实验过程如下：

取30只SD大鼠，用1M NaOH灼烧大鼠双眼角膜，时间15秒，灼烧瘢圆形位于角膜中央，直径3mm。妥布霉素眼膏点眼后8个小时，随机分为羊膜提取液组，生理盐水对照组和激素对照组，每组各10只，共20只眼，用羊膜提取液(AM)、生理盐水(NS)和复方地塞米松滴眼液(H)(中山大学中山眼科中心配制，含0.1％地塞米松钠和0.5％硫酸新霉素)滴眼，每天四次(8am，12am，4pm，8pm)。第7天每组各取5只大鼠用8％明胶和10％印度墨汁的混合物灌注，取出眼球4％多聚甲醛(溶于PBS缓冲液，pH7.4)固定24小时，分离角膜，梯度酒精脱水，铺片并摄像。将图片转换为.GIF格式，像素850*673*27，去除背景，Scion Image(National Institute of Health，NIH)测量新生血管和角膜的面积和密度，得到相对面积(relative area，RA＝∑(新生血管面积)/角膜面积)。SPSS 11.0进行统计分析。余下每组5只大鼠，取眼球4％多聚甲醛(溶于PBS缓冲液，pH7.4)固定24小时，分离角膜，脱水，石蜡包埋，切片(0.3mm厚)HE染色。400倍光镜下对全角膜炎症细胞(inflammatory cell，IC)和新生血管(neovascularization，NV)数目进行计数，SPSS 11.0统计分析。P＜0.05为显著性差异。

统计结果如图1所示，图1(a)为大鼠角膜新生血管相对面积的统计结果，图1(b)为大鼠角膜切片新生血管计数和炎症细胞计数的统计结果，对于三个指标——相对面积(RA)、炎症细胞计数(IC)和新生血管内皮细胞计数(NV)，羊膜提取液治疗组(AM)显著低于生理盐水治疗组(NS)(p＜0.05)，效果接近于激素治疗组(H)。

本实验初步证实了羊膜提取液可以抑制角膜碱烧伤的新生血管生长和炎症细胞浸润。

取上述各治疗组的角膜石蜡切片HE染色后进行比较，如图2所示，图2(a)为生理盐水治疗组的角膜石蜡切片染色图，可见新生血管大量生长，炎症细胞浸润；图2(b)为羊膜提取液治疗组的角膜石蜡切片染色图，新生血管生长稀疏，少见炎症细胞；图2(c)为复方地塞米松治疗组的角膜石蜡切片染色，新生血管生长稀疏，少见炎症细胞。

图2中，所指为新生血管。

Claims

1、一种羊膜提取液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

B.匀浆液在0～4℃放置1～7天，在100～120℃加热30～60分钟，过滤，取滤液：

C.调节滤液pH值到3，静置，过滤，取滤液；

2、如权利要求1所述的羊膜提取液用于制备抑制眼表的新生血管和炎症性疾病的药物的用途。

3、如权利要求1所述的羊膜提取液用于制备治疗角膜碱烧伤的药物的用途。