CN1697605A - 对兰类未受粉花进行生长素处理的兰类单倍体制成方法及兰类的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供制作兰类种子繁殖品种所必要的纯系植物。将生长素水溶液滴落在兰类未受粉花上，在单性生殖的基础上形成种子，判别该种子发芽而育成的兰类植物中的单倍体植物，将判别为单倍体植物的发芽的种子进行培育，形成染色体加倍的纯系植物，制成兰类的种子繁殖品种。

Description

对兰类未受粉花进行生长素处理的 兰类单倍体制成方法及兰类的培养方法

技术领域

本发明涉及通过生长素处理兰类未受粉花，制成单倍体的方法。

背景技术

作为观赏用花，兰花一直有很高的人气，近年来，为满足这种需要，进行了大量的栽培。作为维持这种高人气的主要原因，顺应消费者嗜好，正在持续开发可以大量栽培经济性高的兰类品种。这些品种是通过传统的杂交育种开发的物质，这种杂交育种是指从通过交配得到的幼苗组群中选拔优良的个体。得到的优良个体必须繁殖达到顺应大量消费的水平为止。作为大量繁殖法可利用通过组织培养的克隆增殖。

利用组织培养的克隆增殖技术尚具有不稳定、不同品种难易不同、组织培养中的突变等问题。为避免这些问题，采取了进行每个品种的试验增殖、较低地抑制增殖率等策略，但不论哪个方法，都不能完全抑制突变的发生，通过组织培养的克隆增殖的兰类，确认有畸形花的发生。

这种突变是由组织培养中发生的并非自然状态下的细胞增殖等引起的。与此相比，过去使用的通过植物的自然增殖的株分法等，突变发生非常少。然而株分法增殖率非常低，难以顺应近年来的大量消费。

利用一般的种子繁殖，不存在突变等问题，虽然能够得到很高的增殖率进行繁殖，但由于兰类植物杂种性高，在种子繁殖组群的均一性是显著的可见性问题。作为提高这种种子繁殖组群均一性的方法，有利用单倍体植物的方法。

单倍体植物，通过秋水仙碱等处理，可使基因加倍，基因加倍的植物是纯系植物。通过这些纯系植物的自家交配，得到均一性的种子繁殖组群。此外，纯系植物间交配得到的杂种第一代(F1植物)，个体间基因无差别，可得到均一的后代，因此可以得到来自该杂种第一代的并且均一的种子繁殖组群。

这些种子繁殖组群不但具有均一性，而且因为不经过组织培养的克隆增殖，突变的危险性低，还期待从杂种第一代得到种子繁殖组群的杂种优势等的优选附加特性。而且，在通过组织培养的克隆增殖中，从同一培养组织进行大量增殖，由于培养周期长，突变危险性也高，而种子繁殖组群可在短期间进行大量的繁殖。

作为制作单倍体方法，只对特定植物有效，但应先确立花药培养法或种间杂交法。利用花药培养法制作单倍体在烟草、水稻、小麦等的育种中利用。用种间杂交法制作单倍体在马铃薯、大麦等的育种中利用(小林仁1987，《新植物育种技术》，养贤堂110-112)，在兰类植物中，还未知这种单倍体的制作方法。

另一方面，生长素是植物成长调节物质(植物激素)的一种，其作用之一是促进结果和果实的肥大成长。已知生长素处理，即使未受精也可以产生果实肥大成长的单性生殖，并持续生育(仓石晋，1988《植物激素》(第2版)东京大学出版会，45-46)。在西红柿栽培中利用这种作用，通过生长素处理西红柿未受精花，不进行受粉，果实也能生长、肥大。这是通过生长素处理，诱发无受精生殖，未受精的子房发育的结果。不过，高浓度的生长素诱导产生乙烯，促使果实离脱，不适度的处理浓度时，未受精子房脱落，不能得到种子。

兰的一种“白及”与虾脊兰或兰类的花粉交配，容易得到多量的种子。但试验播种这些种子时，从其发芽、苗的性状来看，单性生殖的可能性是极大的。据认为是通过花粉的激素刺激，子房发达，通过卵细胞的倍数性单性生殖或通过来自胎座等母体营养组织中的胚的无交配生殖，形成种子(伊藤五彦唐泽耕司。1969，《虾脊兰及其组群》，诚文堂新光社，206-207)。

此外，报道表明兰的一种轭瓣兰的柱头给予生长素之一的萘乙酸，能诱导单性生殖(森源次郎，山冈浩一，今日英雄，1989，《关于多种兰中的单性生殖产生的种子》，园艺学会杂志，58卷增刊2；森源次郎，山冈浩一，今日英雄，1991，《关于Zygopetalum mackayi通过单性生殖的种子形成》，园艺学会杂志，60卷增刊2，466-467)

发明内容

本发明目的在于，通过生长素处理兰类未受精花，在发生无受精的基础上形成种子，从这种种子中得到单倍体植物和纯系植物。

首先，为实现未受精花的种子形成，进行生长素处理，优选开花日开始到开花30日后的期间内进行处理。

作为处理部位，在合蕊柱或含有合蕊柱的部分喷洒、涂布或滴加生长素水溶液。图1表示一般的兰花形态图(自内田一仁，1982，洋兰The Orchid，讲谈社，99)。

根据兰类的种类或开花状况，花往往是向下，为防止生长素水溶液由于重力落下，通过在水溶液中混入琼脂或淀粉等、加热而提高粘性，或者通过羊毛脂悬浊糊化等，使生长素留在处理部位也非常有效。

生长素水溶液的生长素浓度为0.1～5.0％。

作为生长素，可以利用吲哚乙酸(IAA)、4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6-二氯苯甲酸、吲哚丁酸(IBA)、4-氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、2，4，5-三氯苯氧乙酸。

一处理之后就开始看见花被片枯萎，确认在一周左右子房肥大。

子房的发育和种子形成，根据兰类植物种类而异，处理后2个月到6个月，可观察到种子成熟。这期间，必须充分注意种子的掉落。此外，与通常的交配、结实相比，种子有时早熟1个月到2个月左右。

采集成熟的种子，进行无菌状态下的播种。播种按照常规方法进行。种子的发芽率比通常的交配种子低。

一见到发芽、生育到一定大时，迅速确认是否为单倍体植物，单倍体植物确认，是取出发芽个体的组织的一部分，测定染色体数或DNA含量，可通过将这些值和来自自花受粉的植物进行比较来进行，发芽开始经过一定期间后，因为单倍体植物有染色体自然加倍的可能性，单倍体植物的确认必须在发芽开始的1～5个月内进行。

附图说明

图1表示一般的兰花形态。

图2表示通过流式细胞计的分析结果。

图3表示通过显微镜观察染色体的结果。

具体实施方式

以下，作为本发明的实施形态，说明一实施例

作为实施例，用了白及Bletilla brigantes“H5-11”，供试株用常规方法培养，确认开花，除去花粉，用点滴器将2％α-萘乙酸的加温的羊毛脂糊10μl滴落在合蕊柱进行处理，因为同一个体生有多个花，每个个体反复上述处理5次以上。

子房肥大的物质从完全成熟开始(从处理开始6～7个月后)采取，0.5％次氯酸溶液表面杀菌5分钟，在无菌容器中播种促进发芽。

播种后，观察播种的种子数和有胚种子数，相对共播种种子数7037，确认有胚种子数11个。

表1表示播种时使用的培养基的组成

             [表1]

在实施例中无菌播种使用的培养基成分表

Hyponex(6.5∶6.0∶19.0)	3g/l
		蔗糖	20g/l
琼脂	10g/l

播种2周后，从这些有胚种子中确认生长素处理过的植物8个个体发芽。

生长素处理过的植物在生育到适当大后采样(发芽开始1～2个月后)，用流式细胞计测定这些生长素处理过的植物的DNA含量，同时观察染色体，检测染色体数。

检测采取幼苗的幼叶来进行，将通过本发明α-萘乙酸处理过的植物，对比来自自花受粉的植物来实施。图2表示通过流式细胞计的分析结果，图3表示通过显微镜观察染色体的结果。如图2所示，在用流式细胞计检测DNA含量时，相对于来自自花受粉的植物所见的峰，发现生长素处理过的植物的峰约在一半的位置。

在染色体观察中，如图3所示，生长素处理过的植物的染色体观察为16条，确认是白及的染色体数32条的一半。

发芽开始5～6个月后，再次用流式细胞计测定生长素处理过的植物的DNA含量，确认这个峰与来自自花受粉的植物的峰位置大致相同，因此确认发芽2～5个月后的期间内生长素处理过的植物的染色体数自然加倍。

从这些观察结果确认生长素处理过的植物是单倍体。此外，同时观察到这些生长素处理过的植物随着其后的时间变化，染色体数自然加倍。必须从发芽开始后2个月以内确认染色体数。

如上所述，通过本发明的兰类的单倍体的培养，可以提供制成兰类的种子繁殖品种所必需的纯系植物，由此，突变等的危险性降低，有可能长期提供稳定而优良的品种。

Claims (7)

1.兰类的单倍体的制作方法，其特征在于，将生长素水溶液滴加在兰类未受粉花，在单性生殖基础上形成种子，使该种子发芽生育，得到单倍体植物的兰类。

2.如权利要求1所述的兰类的单倍体的制作方法，其特征在于，将生长素水溶液滴加在兰类未受粉花的期间为兰类的开花日开始到开花30日后。

3.如权利要求1所述的兰类的单倍体的制作方法，其特征在于，将生长素溶液滴加在未受粉花的合蕊柱或含有合蕊柱的部位。

4.如权利要求1所述的兰类的单倍体的制作方法，生长素溶液浓度为0.1％～5.0％。

5.如权利要求1所述的兰类的单倍体的制作方法，生长素溶液为选自吲哚乙酸(IAA)、4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6-二氯苯甲酸、吲哚丁酸(IBA)、4-氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯和2，4，5-三氯苯氧乙酸的水溶液。

6.制作兰类种子繁殖品种的兰类的种子繁殖品种的制作方法，将生长素水溶液滴落在兰类未受粉花上，在单性生殖基础上形成种子，从来自该种子发芽、培养的兰类植物中判别出单倍体植物，将判别为单倍体的植物发芽、育成种子。

7.如权利要求6所述的制成兰类的种子繁殖品种的兰类种子繁殖品种的制作方法。其特征在于，单倍体植物的判别通过测定在发芽后1～5个月期间采集的试样的DNA含量或染色体数来进行。

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