CN1693469A - 一种提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种水稻贮藏蛋白的信号肽编码序列，以及利用该序列提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法。该序列来自于水稻醇溶蛋白家族的成员之一OsRP5基因，包含SEQ ID NO.1的序列共有57位碱基的核酸，该核酸编码水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信号肽，共19个氨基酸残基。借助于包含SEQ ID NO.1序列的OsRP5信号肽编码序列，将异源重组蛋白编码序列与其构建成融合基因，并导入植物中，可以显著地提高目标蛋白在转基因植物种子中的表达量。

Description

一种提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法

技术领域

本发明涉及一种可提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法，特别是水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5的信号肽编码序列以及利用该序列于转基因植物的研究与应用，将该序列与异源重组蛋白融合，可明显的提高目标蛋白在转基因植物种子中的表达量，属于生物基因工程技术领域。

背景技术

利用转基因技术在植物中表达异源重组基因，以提高抗逆性、增加产量和改善品质等已成为现代农业生物技术研究开发的重点与热点。尤其是近年来，利用植物这一廉价生产系统作为生物反应器，来大量生产重组的编码具重要功能的异源蛋白、医用活性多肽或疫苗、抗体、工业用酶或蛋白质等，是目前植物基因工程发展的一个重要领域之一，其研究与开发方兴未艾，有可能形成一个低投入、高产出的新兴生物技术产业。但是，在植物生物反应器研究中存在一个较为突出的问题，即重组蛋白的表达量极低，某些蛋白还不能稳定积累下来，如在转基因植物中表达的重组抗原的量一般只占总可溶性蛋白的0.01-1％。因此，建立高效稳定的新型植物生物反应器技术体系历来是该领域研究的重点与难点。细胞代谢合成的蛋白质在植物与动物中贮存的方式有所不同；因此，要实现重组的医用蛋白(一般都为非植物来源)在转基因植物细胞中高效表达与稳定积累，也需要遵循与植物本身蛋白一致的表达与贮存规律。除了对重组蛋白基因的密码子进行修改外，另一关键技术，便是要应用受体植物来源的基因表达调控元件和目标蛋白靶向序列。其中，使用组织特异性基因表达的启动子及其相关靶向调控元件，尤其是种子特异性表达基因的启动子及其N-端的信号肽编码序列，被认为是实现异源重组蛋白在植物特定的组织中高效表达的有效途径。

种子贮藏蛋白是植物种子中的一种富含成分，其编码基因的表达往往具有极严格的组织与时空特异性，而且还含有特定的蛋白靶向调控元件。这些基因在翻译形成蛋白前体时，其氨基末端都含有一段信号肽(signal peptide，SP)序列，长度随物种和贮藏蛋白种类的不同而有所不同，它们在贮藏蛋白及其mRNA分子的定位及运输中起重要作用。在植物贮藏蛋白基因转录出成熟mRNA后，翻译形成含信号肽的前体蛋白，此时该前体蛋白由信号肽序列牵引定向地转移到粗糙型内质网腔内，随后这一信号肽序列从前体蛋白上被剪除下来，以便贮藏蛋白能正确地加工(Coleman等1995)。除了在目标蛋白的正确定向中具有决定作用外，信号肽序列在调控基因表达水平上也具有重要的作用(Boehm等2000)。信号肽序列的上些特性已在转基因植物研究中获得了很好的应用。例如，利用水稻谷蛋白Gt3的信号肽序列可将入细胞巨化病毒的糖蛋白B成功地定位在转基因烟草种子中的蛋白贮藏囊泡中（Wright等2001)；人的溶菌酶基因在水稻谷蛋白Gt1基因启动子及其信号肽序列控制下，可特异性地在转基因水稻种子中高效表达(Huang等2002)；而菜豆肌动蛋白内质网特异的信号肽序列可明显增强大肠杆菌辅酶Q在转基因烟草中的转录与随后的表达量。由此可见，贮藏蛋白的信号肽序列对于在转基因植物中外源蛋白的表达与沉积是有积极作用的。

醇溶蛋白是禾谷类作物中主要的种子贮藏蛋白。水稻醇溶蛋白(prolamin)是水稻种子中仅次于谷蛋白的第二大类种子贮藏蛋白，占胚乳总蛋白的5-10％，在水稻种子中合成后，可定向地沉积到蛋白体II中。水稻醇溶蛋白的分子量较小，但种类较多，至少可分为三类：10KDa、13KDa和16KDa，但以13KDa的为最多。从蛋白或DNA序列上分析，同一分子量大小的醇溶蛋白多肽间有70％的同源性；不同分子量大小多肽间的同源性较小，而13KDa与16KDa多肽间有47％的同源性，但10KDa多肽与13KDa多肽之间完全不同源。虽然不同组分的水稻醇溶蛋白在序列上有较大的差异，但每个醇溶蛋白基因在合成前体蛋白时，在其氨基末端都含有由18-24个氨基酸组成的信号肽序列，该信号肽序列的存在对于醇溶蛋白表达的稳定及其定位是非常重要的。已有的研究表明，水稻醇溶蛋白mRNA上与信号肽对应的序列在将该mRNA定位到特定的内质网膜上的过程中起着决定作用(Mitsukawa和Tanaka 1991)；Choi等(2000)最近的研究指出，将水稻醇溶蛋白基因中的信号肽编码序列除去，可有正常的醇溶蛋白转录本产生，但却检测不到最后的蛋白。OsRP5是水稻醇溶蛋白家族的成员之一，其编码蛋白的分子量为13KDa，其前体蛋白的氨基末端含有由19个氨基酸组成的信号肽序列。该基因的基因组序列已被克隆(GenBank登记号为AF156714)。对该基因的表达特性研究表明，OsRP5基因只有发育的水稻胚乳中特异性地表达。发明人的前期研究已表明，该基因启动子可指导外源基因在转基因水稻的胚乳中特异性高效表达。但在本发明之前，尚没有OsRP5蛋白信号肽序列在调控异源重组蛋白在转基因植物中表达的研究。

发明内容

本发明的目的是要一种提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法，通过先制备可用于提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的信号肽编码序列，再将该序列转化进入作物或植物细胞中再生植株，从而提高异源重组蛋白在转基因植物种子中的表达量。

本发明的技术方案是这样的：一种提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法，其特征是将OsRP5基因信号肽编码序列与异源重组蛋白基因编码序列连接在一起构建成融合蛋白基因，融合蛋白基因再与种子特异性表达启动子连接并克隆到植物的载体上，转化进入植物细胞中，从该转化细胞再生出植株，结实生产种子，采用Northern blot和Western blot技术检测异源重组蛋白在转基因植物种子中的表达量。所述的信号肽编码序列有57位碱基的核酸，该核酸编码水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信号肽，共19个氨基酸残基。所述的核酸具有Seq ID No.1所示的核苷酸序列。

                信号肽编码序列表

SEQ ID NO.1

Sequence name：OsRP5_SP，水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5信号肽编码序列

Length：57bp

Type：DNA CDS

Source：水稻(Oryza sativa)

atg aag atc att ttc gta ttt gct ctc ctt

Met Arg Ile Ile Phe Val Phe Ala Leu Leu

gct att gtt gca tgc aac gct tct gca

Ala Ile Val Ala Cys Asn Ala Ser Ala

本发明利用转基因技术在植物中表达异源重组基因，提高异源重组蛋白在转基因植物种子中的表达量，方法科学简单先进。将包括SEQ IDNO.1的OsRP5基因信号肽编码序列与异源重组蛋白基因编码序列连接在一起，构建成融合蛋白基因，再与相关的种子特异性表达启动子连接并克隆到可用于转化植物的载体上；通过转基因技术将构建的嵌合基因转化进入作物或植物细胞中，从该转化细胞再生出植株，经自交或人工授粉结实生产种子；采用Northern blot和Western blot等技术检测异源重组蛋白在转基因植物种子中的表达量，相比于未使用OsRP5基因信号肽编码序列的构建，目标蛋白的表达量明显提高。

所述的转基因植物包括转基因植物细胞或将转化的植物细胞培育成植株，以及由这些转基因植株的有性或无性繁殖的后代。

所述的目标蛋白可以包括任何在生产上的有应用价值的蛋白或酶，编码该蛋白的基因可以来自植物、人、动物或微生物。

附图说明

图1为RPG和RPSG转基因水稻植株未成熟种子总RNA的Northern杂交分析。上图为Northern杂交结果，下图显示总RNA中的28S核糖体RNA。总RNA分别抽提自转基因水稻植株(RPG-1~RPG-5，RPSG-1~RPSG-7)或武香粳9号未转化植株(标记为W)的未成熟种子(~12DAP)，其中RPSG转基因水稻植株中的GUS嵌合基因含有醇溶蛋白的信号肽编码序列。杂交所用的探针为地高辛标记的反义GUS编码区片段。

图2为RPG和RPSG转基因水稻植株成熟种子总蛋白的Western杂交分析。胚乳总蛋白分别抽提自转基因水稻植株(RPG-2~RPG-9，RPSG-2~RPSG-6)或武香粳9号未转化植株(标记为W)的成熟种子，其中RPSG转基因水稻植株中的GUS嵌合基因含有醇溶蛋白的信号肽编码序列。每个泳道所加的总蛋白量一致，各为30微克，蛋白经SDS-PAGE分离后，转印到硝酸纤维素膜上，然后用抗GUS蛋白的特异抗体进行杂交分析。箭头所指即为GUS蛋白。

具体实施方式

以下分四个最佳步骤进一步阐明本发明的具体实施方式。实施例所述内容不构成对本发明权利要求范围的限制。

1、水稻醇溶蛋白OsRP5基因启动子及其信号肽编码序列的克隆根据已发表的水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5基因的核苷酸序列，设计并合成了三个引物P1(5’-TC AAGCTTTGAACGGGCAGAACCGGTC-3’)、P2(5’-CC GGATCCTTTTGTAG GATTCTACTACTATGCTTC-3’)和P3(5’-GA CCATGGCAGAAGCGTTGCATGCAACAA-3’)。其中正向引物P1位于OsRP5基因ATG上游1.1kb处(不含ATG序列)，在引物5’末端加接上了HindIII酶切位点(下划线)；反向引物P2位于ATG上游-1至-22位碱基处(以翻译起始位点为+1位，下同)，在其5’末端加接上Bam HI酶切位点；另一反向引物P3位于ATG下游+35~+57位碱基处，在其5’末端加接上Nco I酶切位点。为了能在引物P3的5末端加上一个酶切位点而又不影响其读码框，在加入Nco I位点时，将+55至+57位的GCA密码子改为GCC，但其编码的氨基酸仍未改变。以引物P1和P2配对用于扩增OsRP5基因5’末端非翻译区1.1kb长的启动子区序列(称为OsRP5_PRO片段)；引物P1和P3配对用于扩增包括5’末端非翻译区1.1kb和起始密码子下游57个bp在内的5’上游区序列(称为OsRP5_PRO+SP片段)，起始密码子下游57bp序列为OsRP5基因的信号肽(signal peptide，SP)编码序列。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50sec，55℃、50sec，72℃、1min 30sec，30个循环；72℃、10min。用于PCR的DNA模板为抽提自粳稻品种武运粳8号叶片的总DNA。经测序分析，OsRP5_PRO片段为OsRP5基因ATG上游-1075到-1位的启动子区序列，全长1075bp；OsRP5_PRO+SP片段为从-1075到+57位碱基之间的序列，全长1132bp。其中，OsRP5基因起始密码子下游57bp序列，即该基因的信号肽编码序列见序列表SEQ ID NO.1中。

2、OsRP5信号肽编码序列与GUS融合基因的构建

为检测上述所克隆两个调控无片段指导外源基因在转基因植物种子中的表达效率，并进一步研究OsRP5蛋白信号肽序列对于外源蛋白在转基因植物种子胚乳中表达后的影响，分别将OsRP5_PRO和OsRP5_PRO+SP片段与GUS(β-半乳糖苷酸酶)报告基因编码区、胭脂碱(NOS)基因终止子序列构建成嵌合基因。将OsRP5_PRO+SP片段经HindIII和Nco I双酶切，替代双元载体pCAMBIA1301中GUS编码区上游的35S启动子，即构建成双元载体p13RPSG。该载体中，在OsRP5_PRO启动子与GUS基因编码区(保留有自己的ATG序列)之间即含有OsRP5基因的信号肽编码序列，信号肽编码序列与GUS编码区序列组成一个融合基因，经测序证明两者的读码框都没有发生改变。

同时，为比较OsRP5基因信号肽编码序列对GUS基因表达的影响，又构建了只含有OsRP5基因启动子(OsRP5_PRO片段)的GUS嵌合基因，构建流程如下。首先用限制性内切酶Sac I和Eco RI从质粒pBI121上切下270bp长的NOS终止子，克隆进双元载体pCAMBIA1300的相应位点中，构建成质粒pC1300/NOS。再从双元载体pIG121Hm(Hiei等1994)上用Bam HI和Sac I切下并回收2.0kb长的GUS基因编码区序列，将其克隆进质粒pC1300/NOS的相应位点中，形成质粒pC1300/GN。进一步用Hind III和Bam HI双酶切OsRP5_PRO片段，连接入质粒pC1300/GN的相应酶切位点中，构建成含OsRP5_PRO启动子与GUS报告基因相融合的质粒p13RPG。

3、OsRP5信号肽编码序列与GUS融合基因导入水稻获转基因植株

将上述实施例2中所构建的两个双元载体经冻融法导入根癌农杆菌菌株EHA105感受态细胞中，按申请人已建立的农杆菌介导转化水稻的程序(刘巧泉等，植物生理学报，1998)将所构建的两个GUS融合基因中导入水稻中。取开花后12~15天的水稻品种武香粳9号未成熟种子经70％乙醇表面消毒2min后，于含2％活性氯的NaClO溶液中消毒90min以上，并不时摇动，用无菌水冲洗4～5次，然后用解剖刀和镊子剥出幼胚并培养于愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织，经4-7天预培养后诱导出的初生愈伤组织用于农杆菌介导的转化实验。将在超低温保存的根癌农杆菌菌种于含50mg/l卡那霉素的YEB半固体培养基上活化后，挑取单菌落接种到3ml含50mg/l Km的YEB液体培养基中，于28℃振摇培养过夜；第2天按1％接种量转接入40ml含50mg/l Km的AB液体培养基中，于28℃、250rpm继续培养6~8hr。将新鲜的培养液于6000rpm、4℃离心5min，收集菌体并重悬于10~15ml的AAM(含100~400μmol/l乙酰丁香酮)液体培养基中，立即用于与水稻受体材料的共培养转化。将各种适宜的水稻受体材料浸没在新鲜的AAM农杆菌菌液中15～30min，间或摇动几次。然后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N₆D₂C共培养培养基上，于26-28℃黑暗条件下共培养3天。3天后，切去胚芽并转入选择培养基上进行选择培养。10～14天后长出的新鲜愈伤组织再转移到新的选择培养基上继续筛选2代(10~14天/代)，然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基上分化小苗(12hr光照/天)，再生的小苗经生根壮苗后移入网室或人工气候室盆栽。两个融合基因构建中，各获得了20个以上的独立转化子，含OsRP5_PRO+GUS融合基因的转基因植株称为RPG1、RPG2和RPG20等，而含OsRP5_PRO_SP+GUS融合基因的转基因植株称为RPSG1、RPSG2和RPSG20等。每个转化子含有2-6个转基因水稻植株。转基因水稻植株移栽入大田后，绝大多数能正常生长、开花并结实。

所有转基因植株经PCR和Southern杂交分析证明GUS融合基因已整合进转基因水稻的基因组中，整合位点从1至4个不等，RPG与RPSG两类转基因水稻植株中的整合情况相似。

4、OsRP5信号肽编码序列与GUS融合基因在转基因水稻胚乳中的表达

在转基因水稻开花后12天左右，从每一植株上收取40粒左右未成熟种子，提取总RNA，并用与GUS基因编码区序列特异的反义DNA探针进行Northern杂交分析，结果显示在两类转基因水稻植株未成熟种子中都有较高的GUS基因的转录本(图1)。从杂交信号的强弱判断，虽然在不同转化子间的表达量有较大的差异，但从总体情况分析，在RPSG转基因水稻中，与OsRP5信号肽序列融合的GUS嵌合基因的表达水平明显高于RPG转基因水稻种子中GUS嵌合基因(即不含信号肽序列、只含OsRP5启动子序列的GUS嵌合基因)的转录水平，说明有信号肽序列的存在，可提高外源基因的转录能力(图1)。

在转基因水稻成熟后，收取成熟种子，从其胚乳中提取种子总蛋白，用抗GUS的特异抗体进行Western杂交分析，结果也显示在两类转基因水稻成熟种子中都有GUS蛋白的积累(图1)。与Northern杂交的结果相类似，在不同转基因水稻种子中GUS蛋白的表达量有所不同，但从总体趋势分析，在RPSG转基因水稻中GUS蛋白的积累量明显高于RPG转基因水稻种子中的(图2)。

OsRP5基因ATG上游的启动子序列可引导外源基因在转基因水稻胚乳中高表达，当在GUS基因编码区前加上其信号肽编码序列时，不仅可明显促进GUS融合基因的转录效率，而且可使最终的蛋白产物表害量也明显增多。对Northern和Western杂交中各杂交信号进行扫描定量比较分析，在RPSG转基因水稻种子中GUS蛋白的表达量比RPG转基因水稻种子中的要高5-10倍。

Claims (5)

1、一种提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法，其特征是将OsRP5基因信号肽编码序列与异源重组蛋白基因编码序列连接在一起构建成融合蛋白基因，融合蛋白基因再与种子特异性表达启动子连接并克隆到植物的载体上，转化进入植物细胞中，从该转化细胞再生出植株，结实生产种子，在该转基因植物种子中表达有目标重组蛋白，采用Northern blot和Western blot技术检测异源重组蛋白在转基因植物种子中的表达量。

2、根据权利要求1所述的一种提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法，其特征是所述的信号肽编码序列有57位碱基的核酸，该核酸编码水稻醇溶蛋白OsRP5基因的氨基末端的信号肽，共19个氨基酸残基。

3、根据权利要求2所述的一种提高异源重组蛋白在转基因植物种子中表达量的方法，其特征是所述的核酸具有的核苷酸序列：

Sequence name：OsRP5_SP，水稻13KDa醇溶蛋白OsRP5信号肽编码序列

Length：57bp

Type：DNA CDS

Source：水稻(Oryza sativa)

atg aag atc att ttc gta ttt gct ctc ctt

Met Arg Ile Ile Phe Val Phe Ala Leu Leu

gct att gtt gca tgc aac gct tct gca

Ala Ile Val Ala Cys Asn Ala Ser Ala。

4、根据权利要求1和3所述的转基因植物包括转基因植物细胞或将转化的植物细胞培育成植株，以及由这些转基因植株的有性或无性繁殖的后代。

5、根据权利要求1所述的重组蛋白可以包括任何在生产上的有应用价值的蛋白或酶，编码该蛋白的基因可以来自植物、人、动物或微生物。

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