CN1688332A - 成骨生长肽对红系造血组细胞的促增殖作用及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了OGP对红系造血祖细胞的明显的促增殖作用，并对实验性再生障碍性贫血(EAA)有有效的治疗作用。本发明还提供了利用OGP在体外促进红系造血祖细胞生长的方法，将OGP或相关肽用于制备治疗再生障碍性贫血等疾病的药物组合物方面的用途。

Description

成骨生长肽对红系造血祖细胞的促增殖作用及应用

技术领域

本发明涉及成骨生长肽（Osteogenic Growth Peptide, OGP)及其相关肽对红 系造血祖细胞促增殖作用及其应用， 尤其是 0GP在治疗实验性再生障碍性贫血 (EAA)方面的应用。 背景技术

1988年， Itai Bab等人在人和动物体内发现了一种能够促进骨细胞生长的 14氨基酸多肽， 命名为成骨生长肽 (0GP)。进一步的研究表明， 0GP是来源于组蛋 白 H4 C末端的 14肽， 氨基酸序列为 ALKRQGRTLYGFGG, 分子量为 1523. 5， 其进 化高度保守， 广泛存在于人和哺乳动物的血清中， 人、 鼠血清中的 0GP序列完全 一致， 且生物学作用特性相同。

生理状态下， 0GP主要以结合物的形式， 即 0GP-0GP结合蛋白（0GPBP)复合物 的形式存在， 约占 0GP总量的 80%-97%。 0GP的 C端 5肽， 可能是在 0GP与 0GPBP 解离的过程中产生的酶解产物， 同样天然存在并具有与 0GP许多相似的活性， 因 而被认为是 0GP的活性部分。

二十世纪八十年代和九十年代早期， 对 0GP的研究主要集中在它的成骨效应 方面。 后来， 由于在越来越多不同类的动物血清中发现 0GP的存在， 进化上的高 度保守性， 提示 0GP可能具有重要的生理功能。 另外， 由于骨髓造血与骨形成之 间的密切关系， 因而进入九十年代后期后， 有人开始对 0GP在造血方面的功用进 行研究。 Gurevitch等发现 0GP能促进正常小鼠的骨髓造血， 对骨髓移植的小鼠， 则能促进外源骨髓的植入和造血重建， 提高小鼠的存活率， 并需要在照射移植前 一周就开始应用 OGP [Gurevitch 0, et al, (1996) Blood 88 (12) : 4719-4724] ₀ 另外， 失血也会引起血清中总 OGP含量的上升， 一般于失血 5天后开始增高， 第 10天时达到高峰， 随后开始迅速下降， 至第 12天时即已回复到基础水平。 失血 量为体重的 3%时， 0GP的高峰浓度可为基础水平的 5倍之多。 [Lucas TS， Bab I， et al. (1997) Clin Orthop 340： 267-275]。 环磷酰胺造成小鼠骨髓损伤后， 给 予 0GP的 C端 5肽， 可以加快小鼠外周血白细胞的恢复， 并可以动员小鼠干细胞 进入外周血 [Rita F， et al. (2002) leukemia Reaearch 19-27]。 但是， OGP在 造血方面的作用效果弱于粒细胞集落刺激因子（G-CSF)， 也弱于粒细胞-巨噬细胞 集落剌激因子（GM- CSF)， 加上 0GP的作用机理不甚清楚， 因此， 0GP并没有应用 于临床促进造血， 更没有用于促进红系造血祖细胞的增殖。

红细胞疾病泛指红细胞数量、 形态、 性能、 组分（主要是膜、 血红蛋白、 酶和 水分等）的变化而引起的各种异常， 其种类繁多、 病因各异， 治疗上也各有千秋。 总体而言， 目前的医学水平对于各种红细胞疾病的病因、 病理、 转归等都已比较 清楚， 但治疗手段则非常有限。 除了少数的几种， 如肾性贫血可用 rhEPO治疗， 营养性贫血可用铁剂、 叶酸等补充剂外， 对于遗传性贫血、 溶血性贫血、 再生障 碍性贫血等则较难治疗， 很多时候只能使用免疫抑制剂。 当然， 红细胞疾病病因 复杂， 不可能会有一种万能药能够治疗所有的红细胞贫血， 但是， 能够促进正常 红细胞增殖的药物则是临床上迫切需要的对症治疗良药。

再生障碍性贫血（Aplastic Anemia, AA)曾被认为是 "不治之症" 。 目前临床 上用于重型再生障碍性贫血的两大标准疗法是联合免疫抑制疗法（1ST)与异基因 骨髓移植（allo-BMT)。另外，重组人造血细胞生长因子（rhuHGFs)亦得到广泛应用。 但是， 患者仍有较高的死亡率， 而且， 所有这些治疗方案共同的缺点是副反应众 多， 风险较高， 价格昂贵。 重型再障依然是临床的棘手问题， 迫切需要效 /价比优 良的新的治疗药物或治疗方案。

因此， 本领域迫切需要开发有效促进红细胞增殖的方法， 尤其是有效治疗再 生障碍性贫血的方法。 发明内容

本发明的目的是提供一种对红系造血祖细胞有明显的促增殖作用的促造血因 子， 并且该因子对小鼠的实验性再生障碍性贫血有有效的治疗作用。

本发明的另一目的是提供一种能够在体外促进红系造血祖细胞生长的方法。 本发明的另一目的是提供一种能够用于制备促进红系造血祖细胞增殖的药物 组合物。 在本发明的第一方面， 提供了一种 OGP和 /或 OGP相关肽的用途， 用于制备 促进红系造血祖细胞增殖的药物组合物。

在优选例中， 所述的药物组合物用于治疗以下病症或状况：

a) 原发性和继发性的再生障碍性贫血；

b) 在正常生理下增加红细胞的数量；

c) 在病理状态下增加红细胞的数量。

在另一优选例中， 所述药物组合物用于治疗或辅助治疗再生障碍性贫血。 在另一优选例中， 所述的药物组合物除含有 OGP和 /或 OGP相关肽外， 还含 有选自下组的成分： 造血生长因子、 免疫促进剂、 免疫抑制剂、 化疗药物或其混 合物。

在另一优选例中， 所述的药物组合物在放疗、 化疗、 骨髓移植、 干细胞移植 的之前、 之中、 或之后使用。

在另一优选例中， 所述的 OGP是具有如下氨基酸序列的天然人 OGP: Ala- Leu-Lys-Arg-Glu-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Gly。

在另一优选例中， 所述组合物的施用剂量为 Ing-lmg OGP/kg体重， 更佳地 为 lOng— O.lmg OGP/kg体重。

在本发明的第二方面， 提供了一种体外促进红系造血祖细胞生长的方法， 包 括步骤： 在培养基中培养红系造血祖细胞， 其中在该培养基含有 10-¹⁶-10-⁸tnol/L 的成骨生长肽。 较佳地， 在该培养基含有 10-¹⁴-10-^1Qmol/L的成骨生长肽。

在本发明的第三方面， 提供了一种治疗或辅助治疗再生障碍性贫血的方法， 它包括步骤：给对象施用剂量为 lng-lmg /kg体重的 OGP，更佳地为 lOng— O.lmg /kg体重的 OGP。 附图说明

图 1显示了 sOGP作用于正常人类红系造血祖细胞 CFU-E集落的培养结果。 EP0 组为阳性对照组， 0组为阴性对照组， 0GP各组的组别以 sOGP的摩尔浓度表示。 可见 sOGP对 CFU-E的促增殖作用浓度范围为 10-¹⁶- 1(Γ⁸Μ， 最佳浓度组为 10-¹²Μ 。 并且表现出高浓度时的抑制作用。 ***: 与空白对照 0组相比， Ρ<0. 001。

图 2 显示了 sOGP作用于正常人类红系造血祖细胞 BFU- Ε集落的培养结果。 可见 sOGP对 BFU-E的促增殖作用浓度范围为 10-¹⁶- 10-^1{)M， 该 4组间无明显差异， sOGP对 BFU-E的作用同样表现出高浓度时的抑制现象。与空白对照 0组相比， **: P<0. 01； Ρ<0· 001。

图 3显示了正常人类 4天 CFU-E集落（倒置显微镜 10x10)

图 4 显示了正常人类 4天 CFU-E集落（倒置显微镜 10x10)

图 5 显示了正常人类 14天 BFU-E集落， 松散型（倒置显微镜 10x10)。 可见 集落颜色已微显桔黄， 表明已有少量的血红蛋白表达。

图 6显示了正常人类 14天 BFU- E集落， 致密型（倒置显微镜 10x10)。集落颜 色亦已显微桔黄色， 血红蛋白已有初步表达。

图 7显示了正常人类 14天 BFU- E集落（倒置显微镜 4x10)。 可见集落已呈现 明显的桔红色， 表明有较多的血红蛋白表达。

图 8显示了正常人类 14天 BFU- E集落（倒置显微镜 4x10)。 同样可见明显的 血红蛋白表达。

图 9显示了 sOGP对正常小鼠红系造血祖细胞 CFU- E集落培养结果。 EP0组为 阳性对照组， 0组为阴性对照组， 0GP各组的组别以 sOGP的摩尔浓度表示。 与空 白对照 0组相比： * P〈0. 05， ** P〈0. 01。

图 10显示了正常小鼠培养 48小时后的 CFU- E集落（倒置显微镜 10x10)。 图 Γ1显示了正常小鼠培养 48小时后的 CFU-E集落 (倒置显微镜 10x10)。 图 12显示了正常小鼠的骨髓涂片。可见骨髓增生活跃， 细胞密度高、三系增 生正常， 粒红比值 1. 03— 1. 36: 1， 粒系成熟正常（Wright染色， 10 X 20)。

图 13显示了模型组小鼠的骨髓涂片。可见骨髓增生呈全系重度抑制，细胞密 度低、 粒系增生差、 成熟低， 粒红比值 0. 45- 0. 69: 1 (Wright染色， 10x20)。

图 14显示了低剂量 sOGP治疗组的骨髓涂片。 骨髓增生仍呈重度抑制， 粒系 增生仍差、 成熟仍低， 粒红比值 0. 49- 1. 12: 1 (Wright染色， 10x20)。

图 15显示了中剂量 sOGP治疗组的骨髓涂片。 骨髓增生呈中至重度抑制， 细 胞密度已稍高， 粒系增生稍差， 粒红比值 0. 73- 0. 81 : 1， 粒红比值已基本正常

(Wright染色， 10x20) ₀

图 16显示了高剂量 sOGP治疗组的骨髓涂片。 骨髓增生呈中至重度抑制， 较 模型组已有明显改善， 并可见粒系细胞已经开始增生， 粒红比值 0. 58- 1. 05: 1， 已基本正常 （Wright染色， 10x20)。

图 17显示了正常小鼠的胸骨切片。 可见骨髓增生活跃。

图 18显示了模型组小鼠的胸骨切片。 可见骨髓增生呈全系重度抑制。

图 19显示了低剂量 sOGP治疗组的胸骨切片。 骨髓增生仍呈重度抑制， 与模 型组相比无改善。

图 20显示了中剂量 sOGP治疗组的胸骨切片。 骨髓增生呈中至重度抑制， 较 模型组已有所改善。

图 21显示了高剂量 sOGP治疗组的胸骨切片。 骨髓增生呈中至重度抑制， 较 模型组已有明显改善。

图 22显示了 sOGP治疗 EAA各组 CFU-GM检测结果。 可见随 sOGP治疗剂量的 提高， CFU- GM的数量亦逐步增加， 呈现明显的线性剂量效应关系。 *** C与 B相 比 P<0. 001 ; # D与 C相比 P〈0. 001 ; * E与 D相比 P〈0. 05。 具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究， 通过体外实验研究显示， sOGP能促进正常 人类和小鼠骨髓红系造血祖细胞的增殖， 并且表现出明显的剂量效应关系。 在此 基础上完成了本发明。 如本文所用， 术语 "成骨生长肽"包括 0GP的天然多肽， 人工合成多肽， 所 有类似物， 0GP相关肽，以及医药上可接受的盐。

可用于本发明的成骨生长肽包括上述各种形式的 0GP， 尤其是人工合成的或 重组表达的 0GP。

一种优选的 0GP是天然序列的 0GP， 其氨基酸序列如下：

ALKRQGRTLYGFGG;

此外， 0GP相关肽也可用于本发明， 优选的 0GP相关肽是来源于 0GP的 C末 端， 具有式（I)氨基酸序列的肽：

X1-X2-Y-X3-F-X4-X5-X6-X7 (I)

其中 XI为氨基、 乙酰基、 乙酰化氨基酸或去氨基的氨基酸； X2、 X6可以不 存在或是单个氨基酸， 也可以是多个氨基酸或肽； X3 、 X4 、 X5是单个氨基酸； X7为氨基、羧基或羟基，其中 Π至 X6中所述的氨基酸选自： Gly， Ala, Asp, Glu, Asn, Gin, Ser, Thr, Leu, lie, Lys, Arg, Phe, Tyr, Trp, Pro, Cys, Met, His, Val ;

Y为酪氨酸， F为苯丙氨酸，且 0GP相关肽的长度为 5-15个氨基酸。

在本文中， 术语 "氨基酸" 除非特指， 均指以下 20种天然氨基酸（以三字母 符表示）： Gly, Ala, Asp, Glu, Asn, Gin, Ser, Thr, Leu, He, Lys, Arg, Phe, Tyr, Trp, Pro, Cys, Met, His, Val。 该术语包括 D型和 L型氨基酸。 此外， 该 术语还包括非天然氨基酸、 甲基化氨基酸、 alio氨基酸。

以前的研究已经表明，只要保留 Y和 F两个活性位点， 式（I)结构的 0GP相关 肽就具有 0GP活性（参见美国专利 5， 814， 610和 Chen YC等人， J Med Chem 2002 Apr 11 ;45(8): 1624-32)。

至于获得 0GP及其相关肽的方法， 没有任何特别限制。 它们可以是固相或液 相化学合成技术、 或是基因工程方法、 或用酶切加工方法制得的。

一种优选的方法是使用常规肽化学合成技术， 以固相法或液相法合成本发明 的 0GP及其相关肽， 但较好是使用固相合成方法。

此外， 可用已知方法将用上述技术或以重组 DNA技术制得的 0GP制成其医药 上可接受的盐。 例如， 可按本领域技术人员熟知的方法， 用适当的酸、 碱处理这 些肽得到合适的盐。

在本发明中， 成骨生长肽的安全有效量通常为 0. lug-10mg/kg体重， 较佳地 为 0. 5ug- 5mg/千克体重。 当用于促进造血祖细胞增殖或治疗 EAA时， 0GP的优选 用量约为 lng— lmg/千克体重， 较佳地为 10ng— 0. 5mg/千克体重， 更佳地为 10ng 一 0. lmg/千克体重。 本发明体外培养实验表明， 正常人类红系造血祖细胞在第 4天计数红系集落 形成单位 (CFU- E)时， 即表现出明显的剂量效应关系， 在第 14天计数早期的红系 爆式集落形成单位 (BFU-E)时， 也表现出同样的结果。体外培养小鼠红系造血祖细 胞在第 2天计数 CFU- E时， 亦表现出明显的剂量效应关系。 而且， 在不同的培养 条件下， sOGP对红系造血祖细胞的促增殖作用都表现出高浓度时的抑制现象。

本发明 0GP的促增殖作用有两种可能的作用途径： 其一是直接作用于造血干 细胞， 其二是通过骨髓基质细胞或者其他类型的细胞影响造血干细胞， 从而促进 其增殖与分化。

高浓度时的抑制现象一方面表明 sOGP不会引起干细胞的无限制增殖，从而没 有引发类白血病样变化的危险， 对于未来临床用药的安全性是一种潜在的保证； 另一方面， 假若确实存在 0GP受体的话， 则高浓度抑制有可能是高浓度时受体钝 化的表现； 当然， 也不能排除其他细胞分泌抑制因子或者 0GP结合蛋白， 从而引 发负反馈抑制的可能性。

此外， 本发明的体内实验研究显示， 合成的成骨生长肽（sOGP)对实验性再生 障碍性贫血 (EAA)有有效的治疗作用。 先建立 EAA动物模型， sOGP于造模前一周 即开始腹腔注射， 至检测时在骨髓涂片和胸骨切片中， 可见治疗组较对照组有明 显的骨髓增生改善现象， 但两者间外周血的差别不大。 在另一组骨髓抑制程度稍 轻的小鼠 EAA模型中， 经 sOGP治疗后， 对骨髓 CFU- GM集落进行培养检测， 结果 显示集落数量与 sOGP治疗剂量呈现显著的正相关线性关系。

本发明的这些研究表明， 0GP可在体外合理地促进正常红系造血祖细胞增生， 因此是一种治疗实验性再生障碍性贫血的有效药物。

0GP的促增殖作用非常温和， 也非常安全， 因而有临床应用的广泛前景。 0GP 增加的是干细胞池的释放量， 在骨髓移植中不会引起祖细胞的耗竭， 既可以保护 供者， 使其减少骨髓供应量， 加速术后的恢复， 又可以縮短干细胞在宿主体内的 归巢（homing)时间， 同时增加其存活率。 在外周血干细胞移植中， 0GP也以同样 的方式可以使供受者双方同时受益。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件， 例如： Sambrook et al 《分子克隆： 实验室手册》 （New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所 建议的条件。 实施例一

0GP对正常骨髓红系造血祖细胞的促增殖作用

本实施例的目的是观察 sOGP能否在体外促进正常人和小鼠骨髓红系造血祖 细胞的集落形成， 为 sOGP促进造血细胞增殖提供进一步的依据。

一、 0GP对正常人红系造血祖细胞的促增殖作用：

方法：

采用骨髓细胞半固体集落培养法，培养人类红系造血祖细胞时采用 StemCel l

Technologies公司的 MethoCult H4533作为基础培养基， 其组成如下：

1. 0% 甲基纤维素 IMDM溶液

30% 胎牛血清

1% 牛血清白蛋白

10— ⁴M 2-巯基乙醇

2mM L-谷胺酰氨

5% 植物血凝素淋巴细胞条件培养液（PHA-LCM)

培养计划如表 1，其中 A组至 H组为不同的 0GP浓度组别， EP0组为 EP0阳性 对照组， 0组为既不加 EP0也不加 0GP的空白对照组。 体系总体积为 2. 256ml， 将 每组平行 4皿，每皿 0. 5 ml ,置 37°C、 5%0)₂培养箱内培养，至第 4天时计数 CFU-E 集落数（8个细胞以上为一个集落）， 至第 15天时计数 BFU- E集落数（50个细胞以 上为一个集落）。 sOGP对正常人红系造血祖细胞的作用培养计划

注： A组至 H组为不同的 OGP浓度组别， EPO组为 Epo阳性对照组， 0组为空 白对照组。

FC: 终浓度 WC: 工作浓度。 结果：

对于表 1的培养计划于第 4天时计数 CFU-E集落的生长情况， 由图 1可见， 0 组的空白对照组亦有约 150个集落生长， 而 sOGP自 10-¹⁶- 10- ¾的浓度范围内， 生长的 CFU-E集落数均明显高于空白对照组，该 5组的 CFU- E数量与 0组相比， P 值均 <0. OOl o sOGP最佳的促增殖效应表现在 1(Γ¹²Μ组，该组的 CFU- E数量约为 300 个左右， 但没有超过 EP0组的数量。 当 sOGP浓度继续升高时， CFU- E集落的数量 反而渐次下降， 增殖曲线表现出一定的剂量效应关系。 当其浓度达 10-⁶M时， 集 落生长与空白对照组相似，说明 sOGP高浓度时对 CFU-E集落的生长反而存在抑制 作用。 S0GP对正常人类骨髓红系造血祖细胞 CFU-E的最佳促增殖浓度范围为 10 - ¹⁴ 10- ¹⁽⁾M。

对于表 1的培养计划于第 4天时计数 CFU-E集落后， 继续在 37°C、 5%( 0₂培 养箱内培养， 至第 14天时计数 50个细胞以上细胞团所组成的 BFU- E集落数量， 结果见图 2。

由图 2可见， 0组的空白对照组亦有约 45个集落生长，而 sOGP自 10_¹⁶-10—^1QM 的浓度范围内， 生长的 BFU-E集落数均明显高于空白对照组， 该 4组的 BFU-E数 量相类似， 与 0组相比， P值均〈0. 01。 sOGP各组的 BFU- E数量均远低于 EP0组的 数量（P<0. 001)。 sOGP对 BFU-E的促增殖作用并没有表现出相应的剂量效应关系， 但仍然存在高浓度抑制的现象。 sOGP对正常人骨髓红系造血祖细胞 BFU- E的最佳 促增殖浓度范围为 10_¹⁶-1(T^1QM。

图 3、 所示为正常人类培养 3-4天时的 CFU-E集落； 图 5-8所示为正常人类 14天 BFU-E集落， 可见集落内已有明显的血红蛋白的表达。 二、 0GP对正常小鼠骨髓红系造血祖细胞的促增殖作用：

方法：

培养正常小鼠红系造血祖细胞时采用 Stemcell Technologies公司的

MethoCult M3234作为基础培养基， 其组成如下：

1. 0% 甲基纤维素 IMDM溶液

15% 胎牛血清

1% 牛血清白蛋白

10μ_§/πι1 重组人胰岛素

200μ_§/ιη1人转铁蛋白

10— ⁴Μ 2-巯基乙醇

2mM L-谷氨酰胺

培养计划如表 2，其中 A组至 H组为不同的 0GP浓度组别， EP0组为 EP0阳性 对照组， 0组为既不加 EP0也不加 0GP的空白对照组。 体系总体积为 2. 0 ml , 将 之每组平行 3皿， 每皿 0. 5 ml， 置 37°C、 5%( 0₂培养箱内培养， 至 48小时后计数 CFU-E集落数（8个细胞以上为一个集落）。

S0GP对正常小鼠红系造血祖细胞 CFU-E的作用

终浓度 WC: 工作浓度 结果：

对表 2的培养计划于培养 48小时后计数小鼠 CFU- E集落数量， 如图 9所示， EP0阳性对照组有 155个左右集落生长， 0组的空白对照组亦有 75个左右集落生 长， 而 sOGP自 10- ¹⁶-10- ¹⁽⁾M的浓度范围内， 生长的 CFU- E集落数均明显高于空白 对照组， 最佳的促增殖浓度范围为 1(Γ¹⁴Μ组和 1(Γ¹²Μ组， 但均没有超过 EP0阳性 对照组的数量。 与 sOGP对人类红系造血祖细胞的促增殖作用特性相似， sOGP对 小鼠红系造血祖细胞的作用同样表现出高浓度时的抑制作用。 S0GP对正常小鼠骨 髓红系造血祖细胞 CFU-E的最佳促增殖浓度范围为 10- ¹⁶- 10- ^1QM。

图 10、 11所示为正常小鼠培养 48小时后的 CFU-E集落。 结论：

体外试验证实在 10- ¹⁶- 10-⁸M的浓度范围内， sOGP对正常人类和小鼠的红系 造血祖细胞 CFU-E和 BFU- E有明显的促增殖作用， 其最佳的促增殖作用浓度范围 在 10— ¹⁴- 10- ^1QM， 并且表现出高浓度时的抑制现象。 实施例 2

成骨生长肽对实验性再生障碍性贫血 (EAA)的治疗作用

本实施例的目的是观察 sOGP对骨髓增生障碍性疾病的治疗作用，为临床治疗 再生障碍性贫血寻找价廉物美的药物。 方法：

1. EAA动物模型的建立方法：

采用两种条件建立小鼠的实验性再生障碍性贫血动物模型。 第一种条件是取 DBA/2小鼠胸腺及肠系膜等各处淋巴结， 剪碎过滤， 根据苔盼蓝拒染率计算活性 淋巴细胞浓度， 将胸腺和淋巴结活性细胞以 1 : 2混合， 配成 lxlOVO. 2ml浓度备 用。 取 Balb/c小鼠经 ¹³⁷Cs 6Gy Y射线亚致死量全身照射后， 4小时内由尾静脉 输入 DBA/2混合淋巴细胞 IxlO⁶个 /鼠。 第二种条件为辐射剂量 ¹³⁷Cs 5Gy Y射线， 输注混合淋巴细胞数为 IxlO⁵个 /鼠， 其余条件均同上述。 两种方法都可造成小鼠 的实验性再生障碍性贫血， 但前一种方法的骨髓呈现严重抑制状态， 而后者的骨 髓抑制要稍轻一些。

2. sOGP对严重抑制型 EAA的治疗作用：

采用 Balb/c小鼠， 8周齢， έ， 体重 17- 20g， 随机分组， 每组 7只， 造模条 件采用辐射 6Gy， 输注混合淋巴细胞 IxlO⁶个 /鼠。 分组及处理情况如下：

A组： 正常对照组， 不造模， 只给予载体生理盐水。

B组： 模型组， 造模前后， 只给予载体生理盐水。 C组： 低剂量组， 造模前后， ip sOGP 0. 02 nmol/鼠 /天。

D组： 中剂量组， 造模前后， ip sOGP 0. 2 nmol/鼠 /天。

E组： 高剂量组， 造模前后， ip sOGP 2. 0 nmol/鼠 /天。

sOGP提前一周给药， 给药方式为腹腔注射（ip)， 造模后再治疗 10天， 然后 杀鼠检测。 sOGP以含 1%人类白蛋白的生理盐水（即载体生理盐水)配制， 加入 1% 人类白蛋白的目的是为减少 sOGP降解的可能性， 以增加其稳定性， 配制后置 -20

°C冰箱内备用。 结果：

(1)各组外周血及骨髓有核细胞数 (BMNC)均未观察到疗效与趋势。

(2)骨髓涂片与胸骨切片均可见 B组呈骨髓增生重度抑制， C组与 B组相类似， D、 E两组骨髓增生已有所恢复， 其中 E组恢复迹象明显。 详见图 12-21。

3. sOGP对中度抑制 EAA模型的治疗作用：

同样采用 Balb/c小鼠， 8周龄， έ， 体重 17- 20_g， 随机分组， 每组 7只， 造 模条件采用辐射 5Gy， 输注混合淋巴细胞 lxlO⁵个 /鼠。 分组及处理情况如下： A组： 正常对照组， 不造模， 只给予载体生理盐水。

B组： 模型组， 造模后， 只给予载体生理盐水。

C组： 低剂量组， 造模后， ip sOGP 0. 05 nmol/鼠 /天。

D组： 中剂量组， 造模后， ip sOGP 0. 5 nmol/鼠 /天。

E组： 高剂量组， 造模后， ip sOGP 5. 0 nmol/鼠 /天。

自造模后第 2天开始 ip sOGP, 至第 13天杀鼠检测。 检测时除各常规项目 夕卜， 另每组取三只小鼠各取一根股骨， 合并成一组， 以 StemCell Technologies 公司的 MethoCult M3534为培养基， 作各组的 CFU-GM集落培养， 检测 sOGP治疗 后对骨髓造血干细胞增殖能力的影响。

MethoCult M3534为完全培养基， 用以检测小鼠 CFU-GM、 CFU-G和 CFU- M集 落增殖的情况， 其组成情况如下:

1. 0% 甲基纤维素 IMDM溶液 10一 ⁴M 2-巯基乙醇

15% 胎牛血清 2mM L -谷氨酰胺

1% 牛血清白蛋白 50ng/ml 重组小鼠 SCF

lO g/ml 重组人胰岛素 10ng/ml 重组小鼠 IL - 3

200 g/ml 人转铁蛋白 10ng/ml 重组人类 IL- 6 CFU-GM的培养计划见表 3。

表 3. sOGP治疗 EAA各组 CFU- GM检测的培养计划

结果：

(a)各组外周血及骨髓有核细胞数 (BMC)等常规检测指标基本上看不出疗效 与趋势。

(b)各治疗组 CFU-GM增殖能力表现出显著差别， 治疗效果与剂量有明显的正 相关线性关系。 见图 22。 结论

由此可见， sOGP对 EAA有有效的治疗作用。外周血象及骨髓有核细胞数无变 化的原因可能在于两种造模方法所致模型的骨髓抑制仍然过于严重， 而治疗时间 仍不够长久。另一方面， 实验数据也表明 sOGP在骨髓严重抑制的情况下， 单独作 用促使骨髓恢复的能力有限， 结合体外实验的推断结果， 可以进一步证实 sOGP 是通过骨髓基质细胞等的作用改善骨髓造血微环境， 从而影响造血干细胞的增殖 和分化。骨髓涂片、胸骨切片以及骨髓 CFU-GM集落的检测是最直接反映骨髓增生 情况的证据，外周血象和 BMNC的阴性结果并不能抹杀 sOGP对 EAA治疗的有效性。 在本发明中提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申 请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1. OGP和 /或 OGP相关肽的用途， 其特征在于， 用于制备促进红系造血祖细 胞增殖的药物组合物。

2. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的药物组合物用于治疗以下 病症或状况：

a) 原发性和继发性的再生障碍性贫血；

b) 在正常生理下增加红细胞的数量；

权

c) 在病理状态下增加红细胞的数量。

3. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述药物组合物用于治疗或辅助 治疗再生障碍性贫血。

4. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的药物组合物除含有 OGP 和 /或 OGP相关肽外， 还含有选自下组的成分：求造血生长因子、 免疫促进剂、 免 疫抑制剂、 化疗药物或其混合物。

5. 如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物在放疗、化疗、 骨髓移植、 干细胞移植的之前、 之中、 或之后使用。

6. 如权利要求 1所述的用途， 其特征在于， 所述的 OGP是具有如下氨基酸 序列的天然人 OGP: Ala-Leu-Lys-Arg-Glu-Gly-Arg-Thr-Leu-Tyr-Gly-Phe-Gly-Glyc

7. 如权利要求 1所述的用途，其特征在于，所述组合物的施用剂量为 lng-lmg OGP/kg体重。

8. 一种体外促进红系造血祖细胞生长的方法， 其特征在于， 包括步骤： 在培 养基中培养红系造血祖细胞， 其中在该培养基含有 10-¹⁶-10-⁸mol/L的成骨生长肽。

9. 如权利要求 8所述的方法， 其特征在于， 在该培养基含有 l(T¹⁴-l(T^1Qm₀l/L 的成骨生长肽。