CN1646558A - 组蛋白脱乙酰酶抑制剂及其制备方法 - Google Patents

组蛋白脱乙酰酶抑制剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

通式(1)代表的化合物对HDAC1和HDAC4具有强选择性抑制活性。因此，本发明的化合物能用作治疗或预防由HDAC1和HDAC4引起的疾病的药物。

Description

组蛋白脱乙酰酶抑制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂和其制备方法。
背景技术
真核染色质结构和基因表达通过组蛋白乙酰基转移酶(HAT)的组蛋白乙酰化以及组蛋白脱乙酰酶(HDAC)的脱乙酰化调节。已知HDAC抑制剂会诱导癌细胞分化和死亡，并预期可用作抗肿瘤药(Marks，P.A.，Richon，V.M.，和Rifkind，R.A.(2000).Histone deacetylase inhibitors：Inducers ofdifferentiation or apoptosis of transformed cells.J.Natl.Cancer Inst.92，1210-1216；Yoshida，M.，Horinouchi，S.，和Beppu，T.(1995).Trichostatin Aand trapoxin：novel chemical probes for the role of histone acetylation inchromatin structure and function.Bioessays 17，423-430；Bernhard，D.，Lffler，M.，Hartmann，B.L.，Yoshida，M.，Kofler，R.，和Csordas，A.(1999).Interactionbetween dexamethasone and butyrate in apoptosis induction：non-additive inthymocytes and synergistic in a T cell-derived leukemia cell line.Cell Death Diff.6，609-607)。
事实上，在美国已开始了对一些在动物试验中有效作为抗肿瘤药的HDAC抑制剂的临床研究(Nakajima，H.，Kim，Y.B.，Terano，H.，Yoshida，M.，和Horinouchi，S.(1998).FR901228，a potent antitumor antibiotic，is anovel histone deacetylase inhibitor.Exp.Cell Res.241，126-133；Saito，A.，Yamashita，T.，Mariko，Y.，Nosaka，Y.，Tsuchiya，K.，Ando，T.，Suzuki，T.，Tsuruo，T.，和Nakanishi，O.(1999).A synthetic inhibitor of histonedeacetylase，MS-27-275，with marked in vivo antitumor activity against humantumors.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，4592-4597)。
曲古抑菌素(Trichostatin)A(TSA)为众所周知的特异性HDAC抑制剂(Yoshida，M.，Kijima，M.，Akita，M.，和Beppu，T.(1990).Potent and specificinhibition of mammalian histone deacetylase both in vivo and in vitro bytrichostatin A.J.Biol.Chem.265，17174-17179)。实际上，已知TSA会诱导分化为白血病细胞、神经元细胞、乳腺癌细胞等(Yoshida，M.，Nomura，S.，和Beppu，T.Effects of trichostatins on differentiation of murineerythroleukemia cells.Cancer Res.47：3688-3691，1987；Hoshikawa，Y.，Kijima，M.，Yoshida，M.，和Beppu，T.Expression of differentiation-relatedmarkers in teratocarcinoma cells via histone hyperacetylation by trichostatin A.Agric.Biol.Chem.55：1491-1495，1991；Minucci，S.，Horn，V.，Bhattacharyya，N.，Russanova，V.，Ogryzko，V.V.，Gabriele，L.，Howard，B.H.，和Ozato，K.A histone deacetylase inhibitor potentiates retinoid receptor action inembryonal carcinoma cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：11295-11300，1997；Inokoshi，J.，Katagiri，M.，Arima，S.，Tanaka，H.，Hayashi，M.，Kim，Y.B.，Furumai，R.，Yoshida，M.，Horinouchi，S.，和Omura，S.(1999).Neuronaldifferentiation of Neuro 2a cells by inhibitors of cell progression，trichostatin Aand butyrolactone I.Biochem.Biophys.Res.Commun.256，372-376；Wang，J.，Saunthararajah，Y.，Redner，R.L.，和Liu，J.M.Inhibitors ofhistone deacetylaserelieve ETO-mediated repression and induce differentiation of AML l-ETOleukemia cells.Cancer Res.59：2766-2769，1999；Munster，P.N.，Troso-Sandoval，T.，Rosen，N.，Rifkind，R.，Marks，P.A.，和Richon，V.M.The histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid inducesdifferentiation of human breast cancer cells.Cancer Res.61：8492-8497，2001；Ferrara，F.F.，Fazi，F.，Bianchini，A.，Padula，F.，Gelmetti，V.，Minucci，S.，Mancini，M.，Pelicci，P.G.，Lo Coco，F.，和Nervi，C.Histonedeacetylase-targeted treatment restores retinoic acid signaling and differentiationin acute myeloid leukemia.Cancer Res.61：2-7，2001；Gottlicher，M.，Minucci，S.，Zhu，P.，Kramer，O.H.，Schimpf，A.，Giavara，S.，Sleeman，J.P.，Lo Coco，F.，Nervi，C.，Pelicci，P.G.，和Heinzel，T.Valproic acid definesa novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells.EMBO J.20：6969-6978，2001)。另外，已知当与通过不同于HDAC抑制剂的机理激活基因表达的药物联合使用时，TSA的分化诱导和细胞死亡诱导活性会协同增加。例如，通过联合能激活作为核受体的视黄酸受体的视黄酸使用HDAC抑制剂会促进癌细胞分化，从而诱导与分化有关的基因表达(Minucci，S.，Horn，V.，Bhattacharyya，N.，Russanova，V.，Ogryzko，V.V.，Gabriele，L.，Howard，B.H.，和Ozato，K.A histone deacetylase inhibitorpotentiates retinoid receptor action in embryonal carcinoma cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：11295-11300，1997；Ferrara，F.F.，Fazi，F.，Bianchini，A.，Padula，F.，Gelmetti，V.，Minucci，S.，Mancini，M.，Pelicci，P.G.，Lo Coco，F.，和Nervi，C.Histone deacetylase-targeted treatment restores retinoicacid signaling and differentiation in acute myeloid leukemia.Cancer Res.61：2-7，2001；Coffey，D.C.，Kutko，M.C.，Glick，R.D.，Butler，L.M.，Heller，G.，Rifkind，R.A.，Marks，P.A.，Richon，V.M.，和La Quaglia，M.P.Thehistone deacetylase inhibitor，CBHA，inhibits growth of human neuroblastomaxenografts in vivo，alone and synergistically with all-trans retinoic acid.CancerRes.61：3591-3594，2001；Petti，M.C.，Fazi，F.，Gentile，M.，Diverio，D.，De Fabritiis，P.，De Propris，M.S.，Fiorini，R.，Spiriti，M.A.，Padula，F.，Pelicci，P.G.，Nervi，C.，和Lo Coco，F.Complete remission through blastcell differentiation in PLZF/RARalpha-positive acute promyelocytic leukemia：invitro and in vivo studies.Blood 100：1065-1067，2002)。5-氮杂脱氧胞苷抑制DNA甲基化而减少了肿瘤抑制基因在大量癌细胞中的表达。与5-氮杂脱氧胞苷联合使用的TSA促进了癌细胞凋亡和肿瘤抑制基因表达的恢复。(Nan，X.，Ng，H.H.，Johnson，C.A.，Laherty，C.D.，Turner，B.M.，Eisenman，R.N.，和Bird，A.Transcriptional repression by the methyl-CpG-binding proteinMeCP2 involves a histone deacetylase complex.Nature 393：386-389，1998；Cameron，E.E.，Bachman，K.E.，Myohanen，S.，Herman，J.G.，和Baylin，S.B.Synergy of demethylation and histone deacetylase inhibition in there-expression of genes silenced in cancer.Nature Genet.21：103-107，1999；Li，Q.L.，Ito，K.，Sakakura，C.，Fukamachi，H.，Inoue，K.，Chi，X.Z.，Lee，K.Y.，Nomura，S.，Lee，C.W.，Han，S.B.，Kim，H.M.，Kim，W.J.，Yamamoto，H.，Yamashita，N.，Yano，T.，Ikeda，T.，Itohara，S.，Inazawa，J.，Abe，T.，Hagiwara，A.，Yamagishi，H.，Ooe，A.，Kaneda，A.，Sugimura，T.，Ushijima，T.，Bae，S.C.，和Ito，Y.Causal relationship between the lossof RUNX3 expression and gastric cance r.Cell 109：113-124，2002；Boivin，A.J.，Momparler，L.F.，Hurtubise，A.，and Momparler，R.L.Antineoplastic actionof 5-aza-2′-deoxycytidine and phenylbutyrate on human lung carcinoma cells.Anticancer Drugs 13：869-874，2002；Primeau，M.，Gagnon，J.，和Momparler，R.L.Synergistic antineoplastic action of DNA methylation inhibitor5-AZA-2′-deoxycytidine and histone deacetylase inhibitor depsipeptide onhuman breast carcinoma cells.Int J Cancer 103：177-184，2003)。
预期HDAC抑制剂不仅作为抗肿瘤药，而且可作为癌预防剂。TSA、SAHA等显著地抑制了动物模型中诱导的乳腺癌的发生。另外，使用丙戊酸进行的研究表明，HDAC抑制剂能抑制转移(Gottlicher，M.，Minucci，S.，Zhu，P.，Kramer，O.H.，Schimpf，A.，Giavara，S.，Sleeman，J.P.，Lo Coco，F.，Nervi，C.，Pelicci，P.G.，和Heinzel，T.Valproic acid defines a novel classof HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells.EMBO J.20：6969-6978，2001)。
HDAC抑制剂不仅用作肿瘤抑制药，而且例如用作治疗和改善自身免疫性疾病、皮肤病、传染病等(Darkin-Rattray等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，13143-13147，1996)，以及提高基因治疗中载体导入的效率(Dion等人，Virology 231，201-209，1997)，促进导入基因的表达(Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，5798-5803，1997)等的试剂。此外，认为HDAC抑制剂具有血管生成-抑制功能(Kim，M.S.，Kwon，H.J.，Lee，Y.M.，Baek，J.H.，Jang，J.E.，Lee，S.W.，Moon，E.J.，Kim，H.S.，Lee，S.K.，Chung，H.Y.，Kim，C.W.，和Kim，K.W.(2001).Histone deacetylases induceangiogenesis by negative regulation of tumor suppressor genes.Nature Med.7，437-443；Kwon，H.J.，Kim，M.S.，Kim，M.J.，Nakajima，H.，和Kim，K.W.(2002).Histone deacetylase inhibitor FK228 inhibits tumor angiogenesis.Int.J.Cancer 97，290-296)。
存在10种或更多的HDAC亚型，最近，识别出与癌密切相关的特定HDAC亚型。例如，发现在抑制癌发生中扮演极其重要角色的肿瘤抑制基因p53的乙酰化在p53自身的功能表达中非常重要(Ito，A.，Lai，C.H.，Zhao，X.，Saito，S.，Hamilton，M.H.，Appella，E.，和Yao，T.P.(2001).p300/CBP-mediated p53 acetylation is commonly induced by p53-activatingagents and inhibitedby MDM2.EMBO J.20，1331-1340)，并且在p53功能抑制中涉及到HDAC1和HDAC2(Juan，L.J.，Shia，W.J.，Chen，M.H.，Yang，W.M.，Seto，E.，Lin，Y.S.，和Wu，C.W.(2000).Histone DeacetylasesSpecifically Down-regulate p53-dependent Gene Activation.J.Biol.Chem.275，20436-20443)。还发现，前髓细胞白血病(APL)发作中涉及的蛋白质PML-RAR和PLZF-RAR和淋巴瘤发作中涉及的癌基因如Bcl-6通过核辅阻抑蛋白募集HDAC4等，并抑制正常分化所必需的基因的表达，从而导致癌发生(Dhordain P.，Albagli，O.，Lin，R.J.，Ansieau，S.，Quief，S.，Leutz，A.，Kerckaert，J.P.，Evans，R.M.，和Leprince，D.(1997).Corepressor SMRTbinds the BTB/POZ repressing domain of the LAZ3/BCL6 oncoprotein.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，10762-10767；Grignani，F.，De，M.S.，Nervi，C.，Tomassoni，L.，Gelmetti，V.，Cioce，M.，Fanelli，M.，Ruthardt，M.，Ferrara，F.F.，Zamir，I.，Seiser，C.，Grignani，F.，Lazar，M.A.，Minucci，S.，和Pelicci，P.G.(1998).Fusion proteins of the retinoic acid receptor-alpha recruithistone deacetylase in promyelocytic leukaemia.Nature 391，815-818；He，L.Z.，Guidez，F.，Tribioli，C.，Peruzzi，D.，Ruthardt，M.，Zelent，A.，和Pandolfi，P.P.(1998).Distinct interactions of PML-RARalpha and PLZF-RARalpha withco-repressors determine differential responses to RA in APL.Nature Genet.18，126-135；Lin，R.J.，Nagy，L.，Inoue，S.，Shao，W.，Miller，W.J.，和Evans，R.M.(1998).Role of the histone deacetylase complex in acute promyelocyticleukaemia.Nature 391，811-814)。另一方面，已知在正常组织的生长和分化中扮演非常重要角色的HDAC亚型存在于那些具有组织特异性表达的HDAC亚型中间(McKinsey，T.A.，Zhang，C.L.，Lu，J.，和Olson，E.N.(2000).Signal-dependent nuclear export of a histone deacetylase regulates muscledifferentiation.Nature 408，106-111；Verdel，A.，和Khochbin，S.(1999).Identification of a new family of higher eukaryotic histone deacetylases.Coordinate expression of differentiation-dependent chromatin modifiers.J.Biol.Chem.274，2440-2445)。为了避免抑制这些HDAC，发展亚型特异性抑制剂是必要的。
HDAC6为通过核-细胞质转运在核和细胞质之间往复穿梭的酶，其一般位于细胞质中(Verdel，A.，Curtet，S.，Brocard，M.-P.，Rousseaux，S.，Lemercier，C.，Yoshida，M.，和Khochbin，S.(2000).Active maintenance ofmHDA2/mHDAC6 histone-deacetylase in the cytoplasm.Curr.Biol.10，747-749)。HDAC6在睾丸中高度表达，并被认为与正常组织的分化有关。另外，已知HDAC6与微管去乙酰化有联系，并控制微管稳定性(Matsuyama，A.，Shimazu，T.，Sumida，Y.，Saito，A.，Yoshimatsu，Y.，Seigneurin-Berny，D.，Osada，H.，Komatsu，Y.，Nishino，N.，Khochbin，S.，Horinouchi，S.，和Yoshida，M.(2002).In vivo destabilization of dynamic microtubules byHDAC6-mediated deacetylation.EMBO J.21，6820-6831)。HDAC6还是能结合到微管上并影响细胞迁移性的脱乙酰酶(Hubbert，C.，Guardiola，A.，Shao，R.，Kawaguchi，Y.，Ito，A.，Nixon，A.，Yoshida，M.，Wang，X.-F.，和Yao，T.-P.(2002).HDAC6 is a microtubule-associated deacetylase.Nature 417，455-458)。因此，HDAC6抑制剂可为转移抑制药。TSA抑制每种HDAC亚型到大约相同的程度。但是，包括环四肽结构和环氧酮(epoxyketone)作为活性基团的trapoxins不能抑制HDAC6(Furumai，R.，Komatsu，Y.，Nishino，N.，Khochbin，S.，Yoshida，M.，和Horinouchi，S.Potent histone deacetylaseinhibitors built from trichostatin A and cyclic tetrapeptide antibiotics includingtrapoxin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：87-92，2001)。根据有关酶三维结构的信息，认为trapoxins与HDAC6的粘合性弱，因为其环四肽部分的结构与酶活性中心的弱保守外表面相互作用。这表明，改变环四肽部分可能产生对各种HDAC有选择性的抑制剂。
TSA因其异羟肟酸基团与HDAC活性口袋中的锌配位而表现出抑制活性(Finnin，M.S.，Donigian，J.R.，Cohen，A.，Richon，V.M.，Rifkind，R.A.，Marks，P.A.，Breslow，R.，和Pavletich，N.P.Structures of a histonedeacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors.Nature 401：188-193，1999)。已知的包括异羟肟酸的HDAC抑制剂的例子为Oxamflatin(Kim，Y.B.，Lee，K.-H.，Sugita，K.，Yoshida，M.，和Horinouchi，S.Oxamflatinis a novel antitumor compound that inhibits mammalian histone deacetylase.Oncogene 18：2461-2470，1999)和CHAP(Furumai，R.，Komatsu，Y.，Nishino，N.，Khochbin，S.，Yoshida，M.，和Horinouchi，S.Potent histone deacetylaseinhibitors built from trichostatin A and cyclic tetrapeptide antibiotics includingtrapoxin.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：87-92，2001.，Komatsu，Y.，Tomizaki，K.-y.，Tsukamoto，M.，Kato，T.，Nishino，N.，Sato，S.，Yamori，T.，Tsuruo，T.，Furumai，R.，Yoshida，M.，Horinouchi，S.，和Hayashi，H.CyclicHydroxamic-acid-containing Peptide 31，a potent synthetic histone deacetylaseinhibitor with antitumor activity.Cancer Res.61：4459-4466，2001)。但是，由于TSA在血液中不稳定，并且具有强的异羟肟酸螯合作用，因此它能与其它必需的金属离子螯合，所以包括异羟肟酸的HDAC抑制剂直到现在也未能实际用作抗肿瘤药。同时，最近已表明FK228二硫键还原产生的硫醇基能作为与HDAC活性口袋中的锌配位从而抑制了HDAC的活性基团。因此，FK228为一种前体药物，在被细胞还原活性还原时激活(Furumai，R.，Matsuyama，A.，Kobashi，N.，Lee，K.-H.，Nishiyama，M.，Nakajima，H.，Tanaka，A.，Komatsu，Y.，Nishino，N.，Yoshida，M.，和Horinouchi，S.(2002).FK228(depsipeptide)as a natural prodrug that inhibits class I histonedeacetylases.Cancer Res.62，4916-4921)。
此外，已从自然环境中分离出包括环四肽结构和环氧酮作为活性基团的大量HDAC抑制剂。在这些发现的基础上，认为环四肽结构在酶识别中是有用的(如上所述，Yoshida等人，1995)，但是，从不同的角度如稳定性看，已有的抑制剂没有发展到令人满意地满足药物产品的水平。因此，强烈期望已解决这些问题的药剂生产。
发明内容
本发明旨在提供新型的包括环四肽结构的HDAC抑制剂，和生产它的方法。
考虑到上述目的，本发明的发明人合成了包括含有硫醇基和其二硫键的环四肽结构的化合物，然后分析了这些化合物的HDAC抑制活性。结果发现，包括二硫键的化合物在体外对酶未能表现出非常高的HDAC抑制活性。但是，当通过与还原剂二硫苏糖醇共存转化成硫醇时，它们表现出强烈的HDAC抑制活性。另一方面，观察到二硫化物活性的细胞内水平同TSA和硫醇的一样高。因此，表明二硫化物能用作HDAC抑制剂的前体药物，其中在被吸收到细胞内后二硫键通过细胞内还原裂开，从而产生强烈的活性。另外，发现当硫醇基以这样一种方式受到保护时，化合物在血清中更稳定，并且发现，通过使保护基团(-SX)与各种官能化合物结合，化合物能与除HDAC抑制剂外的具有所需活性的化合物结合。
本发明涉及HDAC抑制剂和生产它的方法，并具体地提供下面的[1]-[9]：
[1]下式(1)代表的化合物：
Figure A0380887500131
[其中R11、R21、R31和R41独立地表示氢或甲基；R22、R23、R32、R33、R42和R43独立地表示氢、具有1至6个碳原子的直链烷基、连接有非芳族环烷基或取代或未取代芳环的具有1至6个碳原子的直链烷基、非芳族环烷基或连接有非芳族环烷基或取代或未取代芳环的非芳族环烷基；R21和R22、R22和R23、R31和R32、R32和R33、R41和R42以及R42和R43对独立地表示没有连接的无环结构或通过以下连接的环状结构：具有1至5碳主链的直链亚烷基、包括具有1至6个碳的支链的具有1至5碳主链的直链亚烷基、或包括1至6个碳的环结构的具有1至5碳主链的直链亚烷基；X表示氢、与X左侧所示相同的结构、在包括能通过二硫键与式(1)中硫原子连接的硫原子的任意结构中的取代或未取代的烷基或芳基、或通过分子内二硫键与键合到R22、R23、R32、R33、R42或R43末端且位于X左侧的硫原子连接的硫原子]。
[2]包括[1]的化合物作为活性成分的组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
[3]包括[1]的化合物作为活性成分的细胞调亡诱导剂。
[4]包括[1]的化合物作为活性成分的分化诱导剂。
[5]包括[1]的化合物作为活性成分的血管生成抑制剂。
[6]包括[1]的化合物作为活性成分的抗转移药。
[7]治疗或预防由组蛋白脱乙酰酶1或4引起的疾病的药剂，该药剂包括[1]的化合物作为活性成分。
[8]如[7]所述的药剂，其中由组蛋白脱乙酰酶1或4引起的疾病为癌、自身免疫性疾病、皮肤病或传染病。
[9]一种生产[1]的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
在成肽键合剂存在下使式(2)代表的化合物与式(3)代表的化合物反应得到式(4)代表的化合物：
Figure A0380887500141
(其中n同式(1)中的定义；Hal表示选自氯原子、溴原子或碘原子的卤原子、或可用作自由基的烯丙基或烷基磺酰氧基(sulfoxy)；P2表示氨基的保护基团)；
(其中R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42和R43同式(1)中的定义；P2表示羧基的保护基团)；
Figure A0380887500143
(其中n、R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43、P1、P2和Hal同上面定义)；
对式(4)代表的化合物进行催化氢化、酸处理或水解以除去P1和P2；
和然后在成肽键合剂存在下进行环化得到式(5)代表的化合物；
Figure A0380887500151
(其中n、R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43、P1、P2和Hal同上面定义)；
或在成肽键合剂存在下使式(6)代表的化合物与式(7)代表的化合物反应得到式(8)代表的化合物：
(其中R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43和P1同上面定义)；
Figure A0380887500153
(其中n、R11、P2和Hal同上面定义)；
Figure A0380887500154
(其中n、R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43、P1、P2和Hal同上面定义)；
对式(8)代表的化合物进行催化氢化、酸处理、氟阴离子处理或水解以除去P1和P2；
和然后在成肽键合剂存在下进行环化得到式(5)代表的化合物；
二种方法接下来都用下述步骤处理：
使式(5)代表的化合物与包含硫原子的试剂反应得到式(9)代表的化合物；
(其中n、R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42和R43同上面定义；P3表示硫氢基的保护基团)；和然后
用氧化剂和氨或其它胺处理式(9)代表的化合物。
下文中，将结合附图详细地描述实施本发明的方式。
可用上述式(1)定义本发明的化合物。这种化合物可用作HDAC抑制剂。
在上述式(1)中，R11、R21、R31和R41可各自独立地为氢或甲基。R22、R23、R32、R33、R42和R43可各自独立地为氢、具有1至6个碳原子的直链烷基、或非芳族环烷基，其中具有1至6个碳原子的直链烷基和非芳族环烷基可连接有非芳族环烷基或取代或未取代芳环。R21和R22、R22和R23、R31和R32、R32和R33、R41和R42以及R42和R43对可各自独立地在没有连接的无环结构中，或通过具有1至5碳主链的直链亚烷基、包括具有1至6个碳的支链的具有1至5碳主链的直链亚烷基或包括1至6个碳的环结构的具有1至5碳主链的直链亚烷基来连接。由于环四肽结构部分被认为是作为封住HDAC口袋(pocket)的封端，因此这种封端结构可任意地选自上述具有1至6个碳原子的直链烷基、芳族环烷基和能取代它们的芳基。
此外，氢可作为式(1)中的X与表现出HDAC抑制活性的相邻硫原子直接形成硫醇基。但是，如果使用氢作为X形成的硫醇基暴露，则得到的化合物在体内变得不稳定。因此，如果X为氢，则本发明的化合物优选与稳定输送它们到所需部位的方式如药物输送系统结合。为了提高包含HDAC抑制活性的硫醇基的稳定性，优选X为能在体内代谢并在活体内无害的取代基。这类取代基优选为包括能与邻接X的硫原子形成二硫键的硫原子的基团，并可为自身表现出一些疗效的基团，还可为能简单作为保护基团的基团。这类包括硫原子的取代基可为：
与X左侧所示相同的结构；烷基或芳基，在任一结构中包括能通过二硫键与上述式(1)中硫原子连接的硫原子；或通过分子内二硫键与键合到上述R22、R23、R32、R33、R42或R43末端且位于X左侧的硫原子连接的硫原子。在这种情况下，如果取代基具有同X左侧结构相同的结构，就形成二聚体结构，则二硫键会被体内代谢断开并分离成包括二个分子活性的HDAC抑制剂。此外，任何包括硫原子的烷基或芳基还可具有取代基，或可为能表现出与HDAC抑制剂作用相同或不同的结构。
本发明的SS-杂合X原子基团的例子为烷基硫醇如甲硫醇、苄硫醇和环己硫醇，和芳硫醇如苯硫酚和巯基吡啶，以及在天然生理学活性物质如5-氮杂脱氧胞苷和视黄酸结构中一部分原子基团被硫醇基取代的烷基硫醇和烯丙基硫醇。优选的例子为甲硫醇、乙硫醇、巯基乙醇、半胱胺、半胱氨酸、苯硫酚、2-巯基吡啶、4-巯基吡啶、5′-巯基-5-氮杂脱氧胞苷、3′-巯基-5-氮杂脱氧胞苷和硫代松香油(thioretinol)。
另外，在本发明中，对式(1)中的环n没有限制，只要它具有HDAC抑制活性即可，例如，n优选为4-7，更优选为5。从环四肽结构到硫原子的包括n个碳原子的碳链，被假定进入活性HDAC口袋，并通过使碳链末端的活性硫醇基与HDAC孔穴中的锌分子接触来抑制HDAC。
本发明化合物的典型例子如图1至3所示，但不限于这些化合物。
下文中，将描述生产本发明的化合物的方法。如下面所示，可由2-氨基-n-卤代链烷酸生产这种实施方式的化合物。由于R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43和n按照上面说明书定义，因此省略了它们的说明。
本发明化合物的生产方法的第一种实施方式为使用式(2)的化合物作为原料的方法，其中保护基团P1连接到2-氨基-n-卤代链烷酸的氨基上。具体地说，在成肽键合剂存在下使下面式(2)定义的化合物与下面式(3)定义的化合物反应得到下面式(4)定义的化合物：
Figure A0380887500171
在上述式中，Hal可为选自氯原子、溴原子或碘原子中任意一个的卤原子、或还可为离去基团的烯丙基或烷基磺酰氧基。P2为氨基的保护基团。
然后，对上述式(4)定义的化合物进行催化氢化、酸处理或水解以除去P1和P2，然后在成肽键合剂存在下进行环化，得到式(5)定义的化合物；
然后，使式(5)定义的化合物与包含硫原子的试剂反应得到式(9)定义的化合物；
然后用氧化剂和氨或其它胺处理式(9)定义的化合物得到包括二硫键的(二聚体或杂合型)前体药物化合物。在式(9)中，P3表示硫氢基的保护基团。可利用还原剂或能消解二硫键的酶进行处理以分离活性硫醇型化合物。
本发明的生产方法的第二种实施方式为使用下面式(7)定义的化合物作为原料的生产方法，其中保护基团P2连接到2-氨基-n-卤代链烷酸的羧基上。具体地说，在成肽键合剂存在下使式(6)定义的化合物与式(7)定义的化合物反应得到下面式(8)定义的化合物：
然后，对式(8)定义的化合物进行催化氢化、酸处理、氟阴离子处理或水解以除去P1和P2，然后在成肽键合剂存在下进行环化，得到式(5)定义的化合物。然后，使式(5)定义的化合物与包含硫原子的试剂反应得到式(9)定义的化合物；
Figure A0380887500192
然后用氧化剂和氨或其它胺处理式(9)定义的化合物得到包括二硫键的(二聚体或杂合型)前体药物化合物。对于上述第一种实施方式，可通过用还原剂或能消解二硫键的酶处理来分离活性硫醇型化合物。
已知HDAC抑制化合物会诱导癌细胞、白血病细胞和神经细胞分化，诱导细胞凋亡和抑制癌细胞转移(Yoshida，M.，Nomura，S.，和Beppu，T.Effects of trichostatins on differentiation of murine erythroleukemia cells.Cancer Res.47：3688-3691，1987；Hoshikawa，Y.，Kiiima，M.，Yoshida，M.，和Beppu，T.Expression of differentiation-related markers interatocarcinoma cells via histone hyperacetylation by trichostatin A.Agric.Biol.Chem.55：1491-1495，1991；Minucci，S.，Horn，V.，Bhattacharyya，N.，Russanova，V.，Ogryzko，V.V.，Gabriele，L.，Howard，B.H.，和Ozato，K.A histone deacetylase inhibitor potentiates retinoid receptor action inembryonal carcinoma cells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：11295-11300，1997；Inokoshi，J.，Katagiri，M.，Arima，S.，Tanaka，H.，Hayashi，M.，Kim，Y.B.，Furumai，R.，Yoshida，M.，Horinouchi，S.，和Omura，S.(1999).Neuronaldifferentiation of Neuro 2a cells by inhibitors of cell progression，trichostatin Aand butyrolactone I.Biochem.Biophys.Res.Commun.256，372-376；Wang，J.，Saunthararajah，Y.，Redner，R.L.，和Liu，J.M.Inhibitors ofhistone deacetylaserelieve ETO-mediated repression and induce differentiation of AML1-ETOleukemia cells.Cancer Res.59：2766-2769，1999；Munster，P.N.，Troso-Sandoval，T.，Rosen，N.，Rifkind，R.，Marks，P.A.，和Richon，V.M.The histone deacetylase inhibitor suberoylanilide hydroxamic acid inducesdifferentiation ofhuman breast cancer cells.Cancer Res.61：8492-8497，2001；Ferrara，F.F.，Fazi，F.，Bianchini，A.，Padula，F.，Gelmetti，V.，Minucci，S.，Mancini，M.，Pelicci，P.G.，Lo Coco，F.，和Nervi，C.Histonedeacetylase-targeted treatment restores retinoic acid signaling and differentiationin acute myeloid leukemia.Cancer Res.61：2-7，2001；Gottlicher，M.，Minucci，S.，Zhu，P.，Kramer，O.H.，Schimpf，A.，Giavara，S.，Sleeman，J.P.，Lo Coco，F.，Nervi，C.，Pelicci，P.G.，和Heinzel，T.Valproic acid definesa novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells.EMBO J.20：6969-6978，2001)。因此，本发明的化合物可用作细胞凋亡诱导剂、分化诱导剂和癌转移抑制剂。
另外，预期抑制HDAC的化合物能抑制血管生成(Kim，M.S.，Kwon，H.J.，Lee，Y.M.，Baek，J.H.，Jang，J.E.，Lee，S.W.，Moon，E.J.，Kim，H.S.，Lee，S.K.，Chung，H.Y.，Kim，C.W.，和Kim，K.W.(2001).Histonedeacetylases induce angiogenesis by negative regulation of tumor suppressorgenes.Nature Med.7，437-443；Kwon，H.J.，Kim，M.S.，Kim，M.J.，Nakajima，H.，and Kim，K.W.(2002).Histone deacetylase inhibitor FK228 inhibits tumorangiogenesis.Int.J.Cancer 97，290-296)。因此，本发明的化合物还可用作血管生成抑制剂。
在各种HDAC中，本发明的化合物对HDAC1和HDAC4表现出特异的强烈抑制活性。因此，本发明的化合物可用作治疗或预防由HDAC1和HDAC4引起的疾病的药剂。这类疾病的例子除癌症外包括自身免疫性疾病、皮肤病和与HDAC1和HDAC4有关的传染病。另外，本发明的化合物不仅可应用于治疗或预防上述疾病的药剂，而且应用于基因治疗佐剂或能提高载体导入效率、促进导入基因表达的促进剂等。
本发明的化合物还可与视黄酸和DNA甲基化抑制剂联合使用。本发明还提供了这种伴随药。
当将本发明的化合物制成制剂时，可根据需要使用填充剂、增充剂、粘合剂、增湿剂、崩解剂、表面活性剂、稀释剂如润滑剂和赋形剂。另外，可向药物制剂中加入着色剂、防腐剂、芳香剂、调味剂、甜味剂和其它药物。可根据治疗或预防用途选择每种药物制剂的剂型。剂型可为例如片剂、丸剂、散剂、溶液、混悬剂、乳剂、颗粒剂、胶囊、注射剂和栓剂。
加入到片剂和胶囊中的添加剂的例子包括粘合剂如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶；赋形剂如结晶纤维素；溶胀剂如玉米淀粉、明胶和藻酸；润滑剂如硬脂酸镁；甜味剂如蔗糖、乳糖和糖精；和芳香剂如薄荷、白株树油(gaultheria adenothrix oil)和樱桃。在单元剂型为胶囊时，除了上述材料，可加入液体载体如油或脂肪。
对于注射用水溶液，包括盐水、葡萄糖和其它佐剂的例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇或氯化钠的等张溶液也可根据需要与适当的溶解助剂如醇(具体地说乙醇)、多元醇如丙二醇和聚乙二醇或非离子表面活性剂如聚山梨酯80TM和HCO-50联合使用。
油质溶液的例子为芝麻油和大豆油，根据需要可与溶解助剂如苯甲酸苄酯和苄醇联合使用。另外，与缓冲液如磷酸盐缓冲液或醋酸钠缓冲液、抚慰剂如盐酸普鲁卡因、稳定剂如苄醇和苯酚或抗氧化剂混合也是可接受的。配制的注射剂通常装入到合适的安瓿中。
可为患者口服或肠胃外给药制剂。肠胃外剂型的例子包括注射以及经鼻、经肺和经皮给药。可利用注射剂型如静脉注射、肌内注射、腹膜内注射和皮下注射进行全身或局部给药。另外，还可利用本领域中那些技术人员已知的方法进行鼻内、经支气管、肌内、皮下或口服给药。
对于肠胃外给药，本发明化合物的单位剂量取决于需要给药的患者、靶器官、症状和给药方式。例如，以约0.01-30mg/天，优选约0.1-20mg/天，更优选约0.1-10mg/天的剂量对成人(60kg体重)静脉内给药注射剂。当为其它种类动物给药时，剂量可按每60kg体重，或每单位躯体表面积进行换算。
对于口服给药，本发明化合物的单位剂量取决于需要给药的患者、靶器官、症状和给药方式，并对成人(60kg体重)优选例如约100μg-20mg/天。
附图简述
图1示出了至活性硫醇基具有5碳链的SCOP的LDLD或LDLL异构体的结构列表。
图2示出了至活性硫醇基具有4至7碳链的SCOP的结构。注意这里SCOP 152(C5)同图1。
图3示出了同型二聚体型SCOP的结构。SCOP数目为单体数目的二倍。
图4示出了杂合物型SCOP的结构，通过键合各种化合物到SCOP 152得到。
图5示出了天然Cyl-1和Cyl-2的立体构象。
图6示出了使用抗乙酰化赖氨酸抗体通过Western印迹分析测量细胞内组蛋白乙酰化水平的图片。
图7示出了SCOP 152、SCOP 304和SCOP 402在血清中的稳定性评价结果。
图8示出了SCOP 152、SCOP 304和SCOP 402在细胞水平上稳定性评价结果的图片。
实施本发明的最佳方式
下文中，图1和2显示了合成这些实施例所示化合物的整个工艺流程。下面详细描述用H-L-Ab7-OH作为原料的每个合成步骤。在下文中，2-氨基-7-溴庚酸缩写为“Ab7”，2-氨基-7-乙酰基巯基庚酸(acetyltioheptanoic acid)为“Am7(Ac)”；2-氨基-7-巯基庚酸为“Am7”；2-氨基-7-巯基庚酸的硫化物为“Am7(-)”；2-氨基-8.9-二巯基(S9-2′-硝基-N，N′-二甲基苯甲酰胺)为“Am7(E11)”；2-氨基-8，9-二巯基-11-羟基十一烷酸为“Am7(SMEt)”；2-氨基-8.9-二巯基(S9-2′-吡啶基)壬酸为“Am7(S2Py)”；2-氨基-8.9-二巯基(S9-4′-吡啶基)壬酸为“Am7(S4Py)”；2-氨基-8，9-二巯基癸酸为“Am7(SMe)”。另外，合成化合物含硫的环肽缩写为“SCOP”。
[实施例1]Boc-L-Ab7-OH的合成
将H-L-Ab7-OH(7.3g，32.4mmol)溶解到水∶二氧杂环己烷＝1∶1的溶液(30ml，v/v)中。在冰上冷却同时，向混合物中加入(Boc)2O(7.68g，35.6mmol)和三乙胺(6.72ml，48.6mmol)，然后搅拌5小时。在蒸发掉反应溶液后，用醚洗涤残余物。用柠檬酸酸化水相，并用乙酸乙酯反相萃取。用MgSO4干燥萃取物，然后通过蒸发除去乙酸乙酯。真空干燥后，得到油状的题示化合物(10.4g，32.4mmol，100％产率)。
[实施例2]Boc-L-Ab7-NHMe的合成
在冰上冷却同时，向含有Boc-L-Ab7-OH(326mg，1.0mmol)、盐酸一甲胺(81mg，1.2mmol)和HoBt·H2O(184mg，1.2mmol)的3ml DMF中加入三乙胺(0.17ml，1.2mmol)和DCC(247mg，1.2mmol)。搅拌15小时后，通过蒸发除去DMF。将残余物溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。然后用MgSO4干燥并浓缩。通过快速硅胶色谱法(3.6×15cm，氯仿)纯化得到的油状物质，并通过加入醚/石油醚(1∶10)固化得到题示化合物的白色粉末(250mg，0.74mmol，74％产率)。TLC：Rf＝0.58(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例3]Boc-L-Am7(Ac)-NHMe的合成
向含有Boc-Ab7-NHMe(125mg，0.37mmol)的DMF(2ml)中加入硫代醋酸钾(64mg，0.56mmol)，并反应3小时。通过蒸发除去DMF后，将残余物溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物，浓缩，并通过加入醚/石油醚(1∶10)固化得到题示化合物的白色粉末(120mg，0.36mmol，97％产率)。TLC：Rf＝0.57(CHCl3/MeOH=9/1)。
[实施例4]Boc-L-Am7(-)-NHMe SS-二聚体的合成
向含有Boc-Am7(Ac)-NHMe(60mg，0.18mmol)的DMF(0.5ml)中加入氨的甲醇溶液(20当量)，并搅拌24小时。浓缩反应溶液后，通过快速硅胶色谱法(1.5×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的SS-二聚体得到题示化合物的白色粉末(43mg，0.11mmol，61％产率)。HPLC保留时间：8.5分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，579.3293[M+H]，C26H51O6N4S2(579.3250)。
[实施例5]Boc-L-Am7(S4Py)-NHMe的合成
向含有Boc-Am7(Ac)-NHMe(60mg，0.18mmol)的DMF(0.5ml)中加入4，4′-二硫代二吡啶(79mg，0.36mmol)和氨的甲醇溶液(20当量)，并搅拌5小时。浓缩反应溶液后，通过快速硅胶色谱法(1.5×30cm，氯仿)纯化得到的油状产物并冻干得到题示化合物(43mg，0.11mmol，61％产率)。HPLC保留时间：5.6分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，400.1766[M+H]，C18H29O3N3S2(400.1729)。
[实施例6]Boc-L-Ab7-OBzl的合成
将Boc-L-Ab7-OH(4.05g，12.5mmol)溶解到DCM(20ml)中。在冰上冷却同时，向混合物中加入苄醇(1.55ml，15.0mmol)、4-二甲基氨基吡啶(153mg，1.25mmol)和DCC(3.09g，15.0mmol)，然后搅拌8小时。在蒸发掉反应溶液后，将残余物溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。然后用MgSO4干燥，浓缩，并通过快速硅胶色谱法(5×20cm，20％乙酸乙酯/己烷)纯化得到的油状物质得到油状的题示化合物(4.29g，10.4mmol，83％产率)。TLC：Rf＝0.49(乙酸乙酯/己烷＝1/4)。
[实施例7]Boc-L-Ile-L-Pro-OBzl的合成
在冰上冷却同时，使Boc-L-Pro-OH(1.08g，5.0mmol)和苄基溴(0.893ml，75mmol)在三乙胺(10.5ml，75mmol)存在下在DMF(10ml)中反应，得到Boc-L-Pro-Obzl油状产物。使该产物在冰冷下与2N HCl/二氧杂环己烷(5当量)反应3小时得到H-L-Pro-OBzl·HCl。
在冰上冷却同时，向含有Boc-L-Ile-OH·1/2 H2O(1.39g，6.0mmol)、H-D-Pro-OBzl·HCl(956mg，4.0mmol)和HOBt·H2O(613mg，4.0mmol)的DMF(10ml)中加入DCC(1.24g，6.0mmol)和三乙胺(0.70ml，4.0mmol)。搅拌8小时后，通过蒸发除去DMF，将残余物溶解到乙酸乙酯中，然后依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥后，浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的油状物质得到油状的题示化合物(1.63g，3.38mmol，85％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例8]Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-OBzl的合成
将Boc-L-Ile-L-Pro-OBzl(1.63g，3.38mmol)溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。反应完成后，通过蒸发除去TFA，并真空干燥残余物得到H-L-Ile-L-Pro-OBzl·TFA。将化合物溶解到DMF(8ml)中，然后加入Boc-D-Tyr(Me)-OH(1.50g，5.07mmol)。再加入HBTU(1.92g，5.07mmol)、HOBt·H2O(518mg，3.38mmol)和三乙胺(2.37ml，16.9mmol)，并在冰冷下搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状的题示化合物(1.44g，2.42mmol，72％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例9]Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-L-Ab7-Obzl的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-OBzl(1.44g，2.42mmol)溶解到甲醇(12ml)中，并在5％Pd-C(150mg)存在下进行催化氢化。5小时后，滤出催化剂Pd-C，并通过蒸发除去反应溶液得到Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-OH·TFA。
将Boc-L-Ab7-OBzl(1.29g，3.12mmol)溶解到TFA(10ml)中并放在冰上静置30分钟。反应完成后，通过蒸发除去TFA，并真空干燥残余物得到H-L-Ab7-OH·TFA。将化合物溶解到DMF(16ml)，然后加入Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-OH(1.21g，2.40mmol)。再加入HBTU(1.18g，3.12mmol)，HOBt·H2O(368mg，2.40mmol)和三乙胺(1.34ml，9.6mmol)，并在冰冷下搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，2％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状的题示化合物(1.20g，1.47mmol，61％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例10]H-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-L-Ab7-OH·TFA的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-L-Ab7-OBzl(1.20g，1.47mmol)溶解到甲醇(7.5ml)中，并在催化剂Pd-C(130mg)存在下进行催化氢化。5小时后，滤出催化剂Pd-C，并通过蒸发除去反应溶液得到Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-L-Ab7-OH。将化合物溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。通过蒸发除去反应溶液后，向残余物中加入醚/石油醚(1∶10)以固化。然后真空干燥得到题示化合物(770mg，1.02mmol，69％产率)。
[实施例11]环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-)的合成
将H-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-L-Ab7-OH·TFA(770mg，1.02mmol)、HATU(388mg，1.53mmol)和DIEA(0.71ml)分成5份等分试样。每30分钟向每份等分试样中加入DMF(1000ml)，进行环化反应。2小时后，通过蒸发除去溶剂。将残余物溶解到乙酸乙酯中，依次用10％柠檬酸水溶液、4％NaHCO3和饱和盐水洗涤，然后用MgSO4干燥。通过蒸发除去乙酸乙酯后，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，2％甲醇/氯仿)纯化残留的油状物质得到泡沫状物质130mg(21％)。HPLC保留时间：8.20分钟；FAB-MS(二硫代二乙醇)，593[M+H]，(593.2)。
[实施例12]环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-)的合成
向含有环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-)(25mg，0.042mmol)的DMF(0.5ml)中加入硫代醋酸钾(9.59mg，0.084mmol)并反应3小时。通过蒸发除去DMF。将残余物溶解到乙酸乙酯中，然后依次用10％柠檬酸水溶液、4％NaHCO3和饱和盐水洗涤。分离纯化环化反应后类似产生的硫酯得到19mg(76％)油状产物。HPLC保留时间：8.20分钟；FAB-MS(二硫代二乙醇)，589[M+H]，(589.3)。
[实施例13]环(-L-Am7(-)-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-)(SS-二聚体：SCOP296)的合成
将环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-)(19mg，0.0322mmol)溶解到热DMF(2ml)中，并与氨的甲醇溶液(10当量)反应以除去乙酰基。通过蒸发除去溶剂后，将残余物溶解到DMF(2ml)中，并向溶液中加入1MI2(乙醇)(0.04ml)用于氧化。通过Sephadex LH-20(DMF)柱纯化产生的SS-二聚体，然后与水混合得到白色粉末。产量为7.4mg(42％)。HPLC保留时间：14.1分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，1091.5648[M+H]，C56H83O10N8S2(1091.5674)。
[实施例14]Boc-L-Ile-DL-Pip-OBzl的合成
在三乙胺(2.1ml，15mmol)存在下使Boc-DL-Pip-OH(2.29g，10mmol)和苄基溴(1.79ml，15mmol)在DMF(20ml)中反应得到Boc-DL-Pip-Obzl油状产物。使该产物与2N HCl/-二氧杂环己烷(5当量)反应3小时得到H-DL-Pip-OBzl·HCl。
在冰上冷却同时，向含有Boc-L-Ile-OH·1/2 H2O(2.47g，10.7mmol)、H-D-Pro-OBzl·HCl(2.28g，8.9mmol)和HOBt·H2O(1.36mg，8.9mmol)的DMF(20ml)中加入DCC(2.20g，10.7mmol)和三乙胺(1.25ml，8.9mmol)。搅拌8小时后，通过蒸发除去DMF，将残余物溶解到乙酸乙酯中，然后依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥并浓缩后，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的油状物质得到油状的题示非对映体混合物(3.33g，7.70mmol，87％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例15]Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-DL-Pip-OBzl的合成
将Boc-L-Ile-DL-Pip-OBzl(3.33g，7.70mmol)溶解到TFA(10ml)中并放在冰上静置30分钟。反应完成后，通过蒸发除去TFA，并真空干燥残余物得到H-L-Ile-DL-Pip-OBzl·TFA。将化合物溶解到DMF(16ml)中，然后加入Boc-D-Tyr(Me)-OH(3.41g，11.6mmol)。再加入HBTU(4.38g，11.6mmol)、HOBt·H2O(1.18g，7.70mmol)和三乙胺(7.01ml，50.1mmol)并在冰冷下搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状的题示非对映体混合物(3.46g，5.67mmol，74％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例16]Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-DL-Pip-L-Ab7-Obzl的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-DL-Pip-OBzl(3.46g，7.37mmol)溶解到甲醇(30ml)中，并在5％Pd-C(230mg)存在下进行催化氢化。8小时后，滤出催化剂Pd-C并蒸发反应溶液得到Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-DL-Pip-OH。
将Boc-L-Ab7-OBzl(3.05g，3.12mmol)溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。反应完成后，通过蒸发除去TFA，并真空干燥残余物得到H-L-Ab7-OBzl·TFA。将化合物溶解到DMF(16ml)中，然后加入Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-DL-Pip-OH(2.80g，5.39mmol)。再加入HBTU(2.66g，7.01mmol)、HOBt·H2O(825mg，5.39mmol)和三乙胺(3.02ml，21.6mmol)并在冰冷下搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，2％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状的题示非对映体混合物(4.07g，4.91mmol，91％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例17]H-D-Tyr(Me)-L-Ile-DL-Pip-L-Ab7-OH·TFA的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pro-DL-Pip-OBzl(4.07g，4.91mmol)溶解到甲醇(10ml)中，并在催化剂Pd-C(300mg)存在下进行催化氢化。8小时后，滤出催化剂Pd-C，并通过蒸发除去反应溶液得到Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-DL-Pip-OH。将这种化合物溶解到TFA(10ml)中并放在冰上静置30分钟。在通过蒸发浓缩反应溶液后，向残余物中加入醚/石油醚(1∶10)用于固化。然后真空干燥得到题示非对映体混合物(2.60g，3.51mmol，72％产率)。
[实施例18]环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pip-)和环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pip-)的合成
将直链四肽H-D-Tyr(Me)-L-Ile-DL-Pip-L-Ab7-OH(1.28g，2.0mmol)、HATU(1.14g，3.0mmol)和DIEA(1.0ml)分成5份等分试样。每30分钟向每份等分试样中加入DMF(1000ml)，进行环化反应。2小时后，浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥并浓缩后，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，2％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pip-)(372mg，61％；HPLC保留时间：8.94分钟；FAB-MS(二硫代二乙醇)，607[M+H]，(607.2))和泡沫状环(-L-Am7(-)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pip-)(238mg，39％；HPLC保留时间：10.5分钟；FAB-MS(二硫代二乙醇)，607[M+H]，(607.2))。
[实施例19]环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pip-)的合成
向含有环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pip-)(130mg，0.21mmol)的DMF(1ml)中加入硫代醋酸钾(69mg，0.315mmol)并反应3小时。通过蒸发浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，然后依次用10％柠檬酸水溶液和饱和盐水洗涤。分离纯化环化反应后类似产生的硫酯得到109mg(86％)油状产物。HPLC保留时间：8.94分钟；FAB-MS(二硫代二乙醇)，603[M+H]，(603.3)。
[实施例20]环(-L-Am7(-)-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pip-)(SS-二聚体：SCOP298)的合成
使含有环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-L-Pip-)(114mg，0.198mmol)的甲醇溶液(0.5ml)与氨的甲醇溶液(10当量)反应以除去乙酰基。通过蒸发除去溶剂后，将残余物溶解到DMF(2ml)中，并向溶液中加入1MI2(乙醇)(0.25ml)用于氧化。通过Sephadex LH-20(DMF)柱纯化产生的SS-二聚体，然后与水混合得到白色粉末。产量为82mg(78％)。HPLC保留时间：11.6分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，1063.5391[M+H]，C54H79O10N8S2(1063.5361)。
[实施例21]环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pip-)的合成
向含有环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pip-)(240mg，0.40mmol)的DMF(0.5ml)中加入硫代醋酸钾(69mg，0.60mmol)，并进行反应3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥并浓缩后，以与环化反应后相同的方式分离并纯化得到的硫酯得到油状物质(160mg)(66％)。HPLC保留时间：10.5分钟；FAB-MS(二硫代二乙醇)，603[M+H]，(603.3)。
[实施例22]环(-L-Am7(-)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pip-)(SS-二聚体：SCOP300)的合成
使含有环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pip-)(160mg，0.27mmol)的DMF(10ml)与氨的甲醇溶液(10eq.)反应以除去乙酰基。在通过蒸发除去溶剂后，将残余物溶解到DMF(2ml)中，并向溶液中加入1MI2(乙醇)(0.31ml)用于氧化。通过Sephadex LH-20(DMF)柱纯化产生的SS-二聚体，然后与水混合得到白色粉末。产量为54mg(36％)。HPLC保留时间：13.4分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，1119.5939[M+H]，C58H87O10N8S2(1119.5986)。
[实施例23]Boc-L-Ile-D-Pro-OBzl的合成
在冰上冷却的同时，使Boc-D-Pro-OH(17.2g，80mmol)和苄基溴(14.3ml，120mmol)在三乙胺(16.8ml，120mmol)存在下在DMF(160ml)中反应得到Boc-D-Pro-OBzl油状产物。使该产物与2N HCl/二氧杂环己烷(5当量)反应3小时得到H-D-Pro-OBzl·HCl。
在冰上冷却的同时，向含有Boc-L-Ile-OH·1/2 H2O(24.0g，100mmol)、H-D-Pro-OBzl·HCl(19.3g，80mmol)和HOBt·H2O(15.3g，100mmol)的DMF(200ml)中加入DCC(8.3g，30mmol)和三乙胺(3.5ml，25mmol)。搅拌8小时后，通过蒸发除去DMF，将残余物溶解到乙酸乙酯中，然后依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥并浓缩后，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的油状物质得到油状题示化合物(21.5g，51mmol，72％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例24]Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl的合成
将Boc-L-Ile-D-Pro-OBzl(21.5g，51.4mmol)溶解到TFA(50ml)中并放在冰上静置1小时。反应完成后，通过蒸发除去TFA，并真空干燥残余物得到H-L-Ile-D-Pro-OBzl·TFA。将该化合物溶解到DMF(100ml)中，然后加入Boc-D-Tyr(Me)-OH(16.7g，56.5mmol)。再加入HBTU(29.4g，77mmol)、HOBt·H2O(7.87g，51mmol)和三乙胺(25.2ml，180mmol)并在冰冷下搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状题示化合物(22.0g，37mmol，72％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例25]Boc-L-Ab6-OTmse的合成
在4-二甲基氨基-吡啶(24.4mg，0.2mmol)存在下在DCM(6ml)中搅拌Boc-L-Ab6-OH(620mg，2.0mmol)和三甲基甲硅烷基乙醇(0.572ml，4.0mmol)6小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，10％乙酸乙酯/己烷)纯化得到的油状物质得到油状题示化合物(820mg，1.62mmol，81％产率)。TLC：Rf＝0.97(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例26]Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-L-Ab6-OTmse的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl(1.01g，1.70mmol)溶解到甲醇(20ml)中，并在5％Pd-C(150mg)存在下进行催化氢化。8小时后，滤出催化剂Pd-C并蒸发反应溶液得到Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH。
将Boc-L-Ab6-OTmse(1.51g，3.0mmol)溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。反应完成后，蒸发反应溶液并真空干燥残余物得到H-L-Am6-OTmse·TFA。将该产物溶解到DMF(3.5ml)。在冰冷下，将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH(819mg，1.62mmol)、HATU(776mg，2.0mmol)和三乙胺(0.24ml，1.7mmol)分成4份等分试样，并加入到上述DMF溶液中，然后搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用无水MgSO4干燥得到的产物并浓缩得到泡沫状物质，然后通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到题示化合物(888mg，1.09mmol，64％产率)。TLC：Rf＝(CHCl3/MeOH＝9/1)。
[实施例27]Boc-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl(1.19g，2.0mmol)溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。反应完成后，通过蒸发除去TFA，并真空干燥残余物得到H-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl·TFA。将该化合物溶解到DMF(4.0ml)中，然后加入Boc-L-Ab7-OH(652mg，2.0mmol)。再加入HBTU(1.14g，3.0mmol)、HOBt·H2O(306mg，2.0mmol)和三乙胺(1.4ml，10mmol)并在冰冷下搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，然后通过快速硅胶色谱法(4×30cm，2％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状题示化合物(1.51g，1.89mmol，94％产率)。HPLC保留时间：9.15分钟。
[实施例28]Boc-L-Ab8-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl(1.19g，2.0mmol)溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。反应完成后，通过蒸发除去TFA，并真空干燥残余物得到H-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl·TFA。将该化合物溶解到DMF(4.0ml)中，然后加入Boc-L-Ab8-OH(676mg，2.0mmol)。再加入HBTU(1.14g，3.0mmol)、HOBt·H2O(306mg，2.0mmol)和三乙胺(1.4ml，10mmol)并在冰冷下搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，2％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状题示化合物(1.44g，1.76mmol，88％产率)。HPLC保留时间：10.9分钟。
[实施例29]Boc-L-Ab9-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl(1.19g，2.0mmol)溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。反应完成后，通过蒸发除去TFA，并真空干燥残余物得到H-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl·TFA。将该化合物溶解到DMF(4.0ml)中，然后加入Boc-L-Ab9-OH(775mg，2.2mmol)。再加入HBTU(1.14g，3.0mmol)、HOBt·H2O(306mg，2.0mmol)和三乙胺(1.4ml，10mmol)并在冰冷下搅拌3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，2％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫状题示化合物(1.31g，1.58mmol，79％产率)。HPLC保留时间：11.7分钟。
[实施例30]H-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-L-Ab6-OH·TFA的合成
将Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-L-Ab6-OTmse(888mg，1.11mmol)溶解到乙醇(10ml)中。在冰冷下，将1N NaOH水溶液(1.32ml，1.33mmol)分成3份等分试样加入到溶液中，并放在冰上静置3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥后，浓缩产物得到Boc-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-L-Ab6-OH。将该化合物溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。蒸发反应溶液，并真空干燥残余物得到油状题示化合物(778mg，1.07mmol，96％产率)。
[实施例31]H-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH·TFA的合成
将Boc-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl(1.51g，1.89mmol)溶解到甲醇(5ml)中，并在5％Pd-C(150mg)存在下进行催化氢化。5小时后，滤出催化剂Pd-C并蒸发反应溶液得到Boc-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH。将得到的化合物溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。蒸发反应溶液后，真空干燥残余物得到油状题示化合物(1.15mg，1.84mmol，97％产率)。
[实施例32]H-L-Ab8-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH·TFA的合成
将Boc-L-Ab8-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl(1.44g，1.76mmol)溶解到甲醇(5ml)中，并在5％Pd-C(150mg)存在下进行催化氢化。5小时后，滤出催化剂Pd-C并蒸发反应溶液得到Boc-L-Ab8-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH。将得到的化合物溶解到TFA(5ml)中并放在冰上静置30分钟。蒸发反应溶液后，真空干燥残余物得到油状题示化合物(1.15mg，1.84mmol，97％产率)。
[实施例33]H-L-Ab9-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH·TFA的合成
将Boc-L-Ab9-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OBzl(1.31g，1.58mmol)溶解到甲醇(2ml)中，并在5％Pd-C(150mg)存在下进行催化氢化。12小时后，滤出催化剂Pd-C并蒸发反应溶液得到Boc-L-Ab9-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH。将该化合物溶解到TFA(5ml)并放在冰上静置30分钟。蒸发反应溶液后，向残余物中加入醚/石油醚(1∶10)用于固化。然后真空干燥得到题示化合物(905mg，1.42mmol，90％产率)。
[实施例34]环(-L-Ab6-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)的合成
将H-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-L-Ab6-OH·TFA(778mg，1.07mmol)、HATU(616mg，1.62mmol)和DIEA(0.75ml)分成5份等分试样并每隔30分钟加入到DMF(110ml)中以进行环化反应。2小时后，通过蒸发除去溶剂。将残余物溶解到乙酸乙酯中，依次用10％柠檬酸、4％NaHCO3和盐水洗涤。用MgSO4干燥产物并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到无色油状化合物(146mg)(23％)。HPLC保留时间：9.06分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，579.21 97[M+H]，C27H41O5N4 79Br(579.2182)。
这次，含有通过取代Ab6侧链终端Br用HOAt取代的加合物的环四肽，环(-L-A(OAt)6-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(167mg)(27％)，以泡沫形式得到。HPLC保留时间：8.16分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，635.3312[M+H]，C32H43O6N8(635.3306)。
[实施例35]环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)的合成
将H-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH·TFA(1.15g，1.84mmol)、HATU(1.05g，2.76mmol)和DIEA(1.28ml)分成5份等分试样并每隔30分钟加入到DMF(180ml)中以进行环化反应。按照与上述相同的方式纯化产物，得到泡沫(700mg)(64％)。HPLC保留时间：9.90分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，593.2300[M+H]，C28H42O5N4 79Br(593.2339)。
[实施例36]环(-L-Ab8-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)的合成
将H-L-Ab8-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH·TFA(512mg，0.80mmol)、HATU(455mg，1.20mmol)和DIEA(0.56ml)分成5份等分试样并每隔30分钟加入到DMF(80ml)中以进行环化反应。2小时后，浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。然后用MgSO4干燥并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫(267mg)(55％)。HPLC保留时间：9.95分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，607.2501[M+H]，C29H44O5N4 79Br(607.2495)。
[实施例37]环(-L-Ab9-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)的合成
将H-L-Ab9-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-OH·TFA(905mg，1.41mmol)、HATU(833mg，2.12mmol)和DIEA(0.64ml)分成5份等分试样并每隔30分钟加入到DMF(150ml)中以进行环化反应。2小时后，浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。然后用MgSO4干燥并浓缩，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到的泡沫状物质得到泡沫(533mg)(61％)。HPLC保留时间：10.9分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，621.2625[M+H]，C30H46O5N4 79Br(621.2652)。
[实施例38]环(-L-Am6(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)的合成
向含有环(-L-Ab6-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(146mg，0.252mmol)的DMF(0.5ml)中加入硫代醋酸钾(57.6mg，0.504mmol)，并进行反应3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，依次用10％柠檬酸水溶液和饱和盐水洗涤。在用MgSO4干燥并浓缩后，按照环化反应后相同的方式分离并纯化得到的硫酯得到油状物质(114mg)(79％)。HPLC保留时间：9.06分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，575.2879[M+H]，C29H43O6N4S(575.2903)。
[实施例39]环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)的合成
向含有环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(133mg，0.226mmol)的DMF(0.5ml)中加入硫代醋酸钾(52mg，0.452mmol)，并进行反应3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，依次用10％柠檬酸水溶液和饱和盐水洗涤。在用MgSO4干燥并浓缩后，分离并纯化得到的硫酯得到油状物质(118mg)(89％)。HPLC保留时间：9.90分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，589.3605[M+H]，C30H45O6N4S(589.3060)。
[实施例40]环(-L-Am8(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)的合成
向含有环(-L-Ab8-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(267mg，0.439mmol)的DMF(1ml)中加入硫代醋酸钾(100mg，0.878mmol)，并进行反应3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，依次用10％柠檬酸水溶液和饱和盐水洗涤。在用MgSO4干燥并浓缩后，分离并纯化得到的硫酯得到油状物质(222mg)(84％)。HPLC保留时间：9.95分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，603.3244[M+H]，C31H47O6N4S(575.2903)。
[实施例41]环(-L-Am9(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)的合成
向含有环(-L-Ab9-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(250mg，0.402mmol)的DMF(0.5ml)中加入硫代醋酸钾(91.4mg，0.804mmol)，并进行反应3小时。浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，依次用10％柠檬酸水溶液和饱和盐水洗涤。在用MgSO4干燥并浓缩后，分离并纯化得到的硫酯得到油状物质(190mg)(77％)。HPLC保留时间：10.9分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，617.3364[M+H]，C32H49O6N4S(617.3373)。
[实施例42]环(-L-Am6(-)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)SS-二聚体(SCOP302)的合成
使含有环(-L-Am6(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(114mg，0.198mmol)的甲醇(0.5ml)与氨的甲醇溶液(10当量)反应以除去乙酰基。通过蒸发除去溶剂后，将残余物溶解到DMF(2ml)中，向其中加入1MI2(乙醇)(0.2ml)用于氧化。通过Sephadex LH-20(DMF)柱纯化产生的SS-二聚体，然后与水混合得到白色粉末。产量为82mg(78％)。HPLC保留时间：11.6分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，1063.5391[M+H]，C54H79O10N8S2(1063.5361)。
[实施例43]环(-L-Am7(-)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)SS-二聚体(SCOP304)的合成
使含有环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(118mg，0.201mmol)的甲醇(0.5ml)与氨的甲醇溶液反应以除去化合物中的乙酰基。通过加入1MI2(乙醇)氧化化合物的末端硫氢基(sulfohydryl)。纯化后，得到白色粉末状SS-二聚体。98mg(89％)产量。HPLC保留时间：12.3分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，1091.5684[M+H]，C56H83O10N8S2(1091.5674)。
[实施例44]环(-L-Am8(-)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)SS-二聚体(SCOP306)的合成
使含有环(-L-Am8(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(222mg，0.368mmol)的甲醇(0.5ml)与氨的甲醇溶液反应以除去化合物中的乙酰基。通过加入1MI2(乙醇)氧化化合物的末端硫氢基(sulfohydryl)。纯化后，得到白色粉末状SS-二聚体。167mg(81％)产量。HPLC保留时间：13.0分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，1119.5961[M+H]，C58H86O10N8S2(1119.5987)。
[实施例45]环(-L-Am9(-)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)SS-二聚体(SCOP308)的合成
使含有环(-L-Am9(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(95mg，0.154mmol)的甲醇(0.5ml)与氨的甲醇溶液反应以除去化合物中的乙酰基。通过加入1MI2(乙醇)氧化化合物的末端硫氢基。纯化后，得到白色粉末状SS-二聚体。84mg(98％)产量。HPLC保留时间：14.2分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，1147.6307[M+H]，C60H91O10N8S2(1147.6300)。
[实施例46]环(-L-Am7(SMEt)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(SS杂合物：SCOP 404)的合成
使含有环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(270mg，0.45mmol)的DMF(0.5ml)与氨的甲醇溶液(10当量)反应以除去化合物中的乙酰基。在通过蒸发除去氨后，向残余物中加入2-巯基乙醇(10当量)然后加入1MI2(乙醇)0.2ml，进行氧化。通过Sephadex LH-20(DMF)柱纯化得到的SS-杂合物(hybrid)并冻干得到白色粉末状题示化合物。产量为30mg(11％)。HPLC保留时间：8.9分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，622.2877[M]，C30H46O6N4S2(622.2859)。
[实施例47]环(-L-Am7(S2Py)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(SS杂合物：SCOP 401)的合成
使含有环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(40mg，0.07mmol)的DMF(1ml)与2，2′-二硫代吡啶(31mg，0.14mmol)和氨的甲醇溶液混合(10当量)并搅拌8小时。浓缩反应溶液后，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化粉末产物得到题示化合物。产量为15mg(38％)。HPLC保留时间：9.6分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，656.2952[M+H]，C33H45O5N5S2(656.2940)。
[实施例48]环(-L-Am7(S4Py)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(SS杂合物：SCOP 402)的合成
使含有环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(100mg，0.17mmol)的DMF(1ml)与4，4′-二硫代吡啶(75mg，0.34mmol)和氨的甲醇溶液(20当量)混合并搅拌8小时。浓缩反应溶液后，通过快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化粉末产物得到题示化合物。产量为13mg(13％)。HPLC保留时间：6.5分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，656.2934[M+H]，C33H45O5N5S2(656.2940)。
[实施例49]环(-L-Am7(SEll)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(SS杂合物：SCOP 403)的合成
使含有5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(515mg，1.4mmol)的DMF(2.8mL)与二甲胺(343mg，3.0mmol)、DCC(867mg，3.0mmol)和HOBt·H2O(214mg，1.4mmol)混合，然后在冰上冷却同时搅拌8小时。反应完成后，浓缩反应溶液，溶解到乙酸乙酯中，并依次用10％柠檬酸水溶液、4％碳酸氢钠水溶液和饱和盐水洗涤。用MgSO4干燥后，通过蒸发除去乙酸乙酯。真空干燥残余物并使用快速硅胶色谱法(4×30cm，1％甲醇/氯仿)纯化得到5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸二甲基酰胺)。
使含有环(-L-Am7(Ac)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(130mg，0.22mmol)的DMF(2ml)与5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸二甲基酰胺)(198mg，0.44mmol)和氨的甲醇溶液(10当量)混合，然后搅拌6小时。浓缩反应溶液，溶解到少量DMF中，并通过HPLC(柱：YMC-Pack ODS-A 10×250mm)纯化得到题示化合物。产率为13mg(9.3％)。HPLC保留时间：9.5分钟；HRMS(FAB，二硫代二乙醇)，771.3201[M+H]，C37H50O8N6S2(771.3210)。
[实施例50]环(-L-Am7(SMe)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(SCOP 405)的合成
使含有环(-L-Ab7-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)(118mg，0.2mmol)的DMF(1ml)与4-甲氧基苄基硫醇(0.056ml，0.4mmol)和三乙胺(0.07ml，0.5mmol)混合并在室温下反应2小时。用乙酸乙酯萃取产生的环(-L-Am7(Mb)-D-Tyr(Me)-L-Ile-D-Pro-)，纯化，然后与四氟硼酸二甲基(甲硫基)锍(0.9mmol，176mg)在甲醇(18ml)中和室温下反应2小时。浓缩反应溶液，溶解到氯仿中，并通过硅胶色谱法(2×25cm，2％甲醇/氯仿)纯化得到目标产物。产量为69mg(65％)。TLC Rf：0.90(CHCl3/MeOH＝19/1)。HPLC保留时间：12.28分钟；HR-FAB+MS：593.2777(计算值：592.2753，组成：C29H44O5N4S2，基质：2，2′-二硫代二乙醇)。
[实施例51]HDAC抑制活性的测量
在这个实施例中，测量了SCOP的HDAC抑制活性。图1至图4显示了已测量活性的含硫环肽(SCOP)的结构列表。基于以如图5所示的天然HDAC抑制剂Cyl-1和Cyl-2(Furumai等人，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，98，87-92)，考察了至环四肽结构活性基团的碳链的构象和数目。
天然Cyl-1和Cyl-2的立体构象为LDLL，但也考察具有LDLD构象的那些化合物。在下面的实验结果中，为了断开二硫键，DTT与X＝H共存。
为了测量HDAC抑制活性，按下面所述制备HDAC溶液。将1×107个293T细胞铺板到100-mm平皿上，24小时后，使用LipofectAmine 2000试剂(Life Technologies，Inc.Gaithersburg，MD)转然表达人HDAC1和HDAC4或小鼠HDAC6的载体(1μg)。使用上述pcDNA3-HD1作为表达人HDAC1的载体(Yang，W.M.，Yao，Y.L.，Sun，J.M.，Davie，J.R.& Seto，E.(1997)J.Biol.Chem.272，28001-28007)。使用pcDNA3.1(+)-HD4作为表达人HDAC4的载体(Fischle，W.，Emiliani，S.，Hendzel，M.J.，Nagase，T.，Nomura，N.，Voelter，W.&Verdin，E.(1999)J.Biol.Chem.274，11713-11720)。使用pcDNA-mHDA2/HDAC6作为表达小鼠HDAC6的载体(Verdel，A.&Khochbin，S.(1999)J.Biol.Chem.274，2440-2445)。在OPTI-MEM中导入载体5小时。然后用Dulbecco改性Eagle培养液(DMEM)替换培养液，并孵育19小时。用PBS洗涤细胞，悬浮到裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH7.5)，120mM NaCl，5mM EDTA和0.5％Nonidet P-40)中，并用超声波处理。通过离心收集上清液，并用Protein A/G plus琼脂糖珠(Santa CruzBiotechnologies，Inc.)除去非特异性蛋白。向表达HDAC1或HDAC4的细胞上清液中加入抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich，Inc.)。向表达HDAC6的细胞上清液中加入抗HA抗体(克隆3F10，Roche Molecular Biochemicals)。各自混合物中的反应在4℃下进行1小时。将得到的反应混合物独立地与琼脂糖珠混合并继续在4℃下反应1小时。用裂解缓冲液洗涤琼脂糖珠3次，然后用HD缓冲液(20mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl，10％甘油和完全蛋白酶抑制剂混合液(Boehringer Mannheim，Germany))洗涤1次。通过用FLAG肽(40μg)(Sigma-Aldrich，Inc.)或HA肽(100μg)在HD缓冲液(200μl)中在4℃下孵育1小时回收已结合到琼脂糖珠的称为“HDAC反应溶液”的蛋白质溶液。使用HDAC反应溶液按下面所示测定HDAC抑制活性。
按如下评测体外HDAC抑制活性：将试验化合物溶解到DMSO中并调整到10mM。使用其作为抑制剂储备溶液。作为阳性对照，将通常所说的HDAC抑制剂曲古抑菌素A(TSA)溶解到DMSO中得到10mM储备溶液。通过在试验化合物或对照TSA存在下分别在37℃下孵育上述HDAC溶液和用[3H]标记的乙酰化组蛋白底物溶液15分钟(100μl反应体积)进行测量。通过加入10μl HCl停止这些反应。用乙酸乙酯萃取通过酶反应切除的[3H]乙酸，并进行放射性剂量测量。作为阴性对照，在不向反应系统中加入抑制剂的情况下进行同样步骤。在阴性对照中，抑制活性表达为HDAC活性的50％抑制浓度(“IC50(nM)”)(表1至4)。
如下面所示，使用p21启动子诱导活性作为指标测量体内HDAC抑制活性。用于实验的MFLL-9细胞稳定地保留了人类野生型p21启动子和萤光素酶的融合基因(Dr.B.Vogelstaein)。使用不含酚红并包括10％FBS的DMEM培养液，在蒸汽饱和的培育箱中和37℃下用5％二氧化碳进行培养。将MFLL-9细胞以85000个细胞/孔的密度铺板在96孔微量滴定板上，每孔中有99μl上述培养液。然后将它们培养6小时。向每孔中加入1μl试验化合物溶液，然后再培养18小时。使用TSA作为具有p21启动子诱导活性的阳性对照化合物，其中诱导活性由HDAC抑制活性引起。
使用Luc Lite(Packard BioScience Company)测量用于细胞内萤光素酶表达的酶反应的产物产生的发光强度。使用不加试验化合物的组作为阴性对照组。使用这组的测量值作为标准。相对于上述标准值为1来表示加入试验化合物每种浓度的活性。使用相应于TSA最大活性值50％的浓度(“EC50(nM)”)比较试验化合物的活性强度(表1至4)。
                                       表1
                                  X＝H(与DTT共存)
  抑制剂            IC50(nM)             P21启动子
  SCOP编号 HDAC1 HDAC4 HDAC6 EC50(nM) 构象 碳链数
    148   81.4   17.0   ＞500000   6720   Cyl1(LDLL)   C5
    149   2.37   5.22   44300   596   Cyl2(LDLL)   C5
    150   2.10   4.26   5560   504   Cyl2(LDLD)   C5
    151   932   7340   28500   ＞100000   Cyl1(LDLD)   C4
    152   4.60   2.06   1400   309   Cyl1(LDLD)   C5
    153   9.13   91.0   8050   9850   Cyl1(LDLD)   C6
    154   38.1   99.2   2470   31400   Cyl1(LDLD)   C7
就表1中所示的体外抑制活性和体内P21启动子活性而言，发现LDLD异构体比处于天然构象的LDLL异构体具有更高的活性。另外，对于直到活性硫醇基的碳链数目，显示C5是最优选的。
                                       表2
                          X＝包括左构象的化合物(同型二聚体)
  抑制剂              IC50(nM)               P21启动子
  SCOP编号 HDAC1 HDAC4 HDAC6     EC50(nM) 构象 碳链数
  296   763   222   ＞500000     7730   Cyl1(LDLL)    C5
  298   114   33.7   418000     5800   Cyl2(LDLL)    C5
  300   61.1   36.2   255000     7370   Cyl2(LDLD)    C5
  302   7200   ＞500000   ＞500000     ＞100000   Cyl1(LDLD)    C4
  304   142   145   ＞500000     341   Cyl1(LDLD)    C5
  306   153   319   1320000     847100000   Cyl1(LDLD)    C6
  308   983   505   745000     235000   Cyl1(LDLD)    C7
对于X＝H的情况和同型二聚体，显示LDLD异构体比处于天然构象的LDLL异构体具有更高的活性，并且C5为至活性硫醇基的碳链的最优选数目。
                                       表3
                             X＝低分子量化合物(杂合物)
  抑制剂              IC50(nM)              P21启动子
  SCOP编号   HDAC1   HDAC4   HDAC6   EC50(nM)     构象
  401   NT   NT   NT   1360     152+2-吡啶
  402   6.76   68.3   1610   1310     152+4-吡啶
  403   21.5   18.9   6080   1800     152+Ellman试剂
  404   217   355   201000   1360     152+巯基乙醇
  405   119   405   191   3260     152+甲硫醇
  401/DTT   NT   NT   NT   815
  402/DTT   0.553   1.12   2010   470
  403/DTT   1.15   1.53   4730   748
  404/DTT   2.44   13.0   15400   754
“NT”是指未进行试验。
即使SCOP152和低分子量化合物的杂合体也显示具有抑制活性。
                            表4
                        阳性对照(TSA)
  抑制剂                 IC50(nM)   P21启动子
  TSA   HDAC1   HDAC4   HDAC6   EC50(nM)
  TSA   19.2   68.3   27.2   445
根据上述结果，LDLD异构体比处于天然构象的LDLL异构体具有更高的活性。另外，发现C5为至活性硫醇基碳链的最优选数目。此外，由于HDAC6抑制活性明显低，所以化合物被证实具有酶亚型选择性抑制活性。在酶水平上，目前的化合物当为与DTT共存的硫醇(X＝H)时显示出高HDAC抑制活性。但是，在细胞水平上，甚至那些X＝左侧结构或X＝低分子量化合物的化合物也显示出高活性。这表明硫醇基被暴露并因此通过使用细胞内还原力还原混合到细胞中的二硫化物而被活化。
下文中，由于DTT可能具有某些影响，因此在不含DTT的条件下使用纯化SCOP152进行实验。
                     表5
         IC50(nM)     P21启动子
  抑制剂   HDAC1   HDAC4   HDAC6     EC50(nM)
  152   NT   NT   NT     3510
“NT”是指未进行试验。
与存在DTT时相比，EC50值增加。DTT的存在被认为降低了培养基的pH，从而导致单体稳定性的变化。或者，也可能DTT被用作保护基团。在不含DTT的条件下使用纯化SCOP152进行下面的实验。
[实施例52]体内HDAC抑制活性的测量
按如下方法测量组蛋白乙酰化水平：(i)使试验化合物与HeLa细胞反应；和(ii)使用抗乙酰化赖氨酸抗体通过Western印迹确认组蛋白乙酰化水平。具体地说，在蒸汽饱和的培育箱中在5％二氧化碳存在和37℃下在包括10％FBS的DMEM培养液中培养人子宫癌细胞(HeLa)。以15000细胞/ml的浓度将2ml细胞放到6孔板上，并培养18小时。向每个培养物中加入试验化合物溶液，并接着再培养6小时。用PBS洗涤细胞，悬浮到裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，120mM NaCl，5mM EDTA，0.5％ Nonidet P-40)中，然后用超声波处理。通过离心收集上清液，与SDS缓冲液混合，并在100℃下放置5分钟。在15％SDS凝胶上对得到的样品进行电泳处理，并转移到薄膜上。用第一抗体“AKL5C1”(Japan Energy)和第二抗体“抗鼠”(LIFESCIENCE)对其处理，然后用ECL(amersham pharmacia biotech)探测乙酰化带(图6)。图6中所示化合物的浓度单位为“nM”。
如图6所示，抑制趋势显示同P21启动子诱导活性的结果(EC50)相同。C5为至活性硫醇基的碳链的最优选数目。
[实施例53]细胞毒性试验
使用正常人肺细胞(TIG-3)和人子宫癌细胞(HeLa)试验SCOP细胞毒性。在蒸汽饱和的培育仪中在5％二氧化碳存在和37℃下在包括10％FBS的DMEM培养液中培养这些TIG-3和HeLa细胞。以100μl/孔上述培养液将TIG-3和HeLa细胞放到96孔微量滴定板上，密度分别为30000细胞/孔和10000细胞/孔。然后培养18小时。向每个孔中加入用培养液稀释的试验化合物溶液，并继续培养48小时。
将每个孔中30μl的上清液转移到另一个96孔微量滴定板(A)，丢弃剩余的上清液。向每个孔中加入100μl 0.5％Triton-X/PBS以裂解细胞，然后转移30μl到另一个96孔微量滴定板(B)的各个孔中。向这些96孔微量滴定板A和B的每个孔中加入30μl LDH-细胞毒性试验(Wako)底物溶液，引起显色反应。一旦显色反应充分地进行，通过加入60μl淬灭溶液使反应停止。使用微量培养板读出器(Softmax)测量光密度560nm处的色彩强度。计算[A/(A+B)]作为不含乳酸脱氢酶(LDH)的比例。当不含乳酸脱氢酶的比例为50％时，抑制活性为LD50。癌细胞选择性细胞损害的活性值越高(正常细胞的LD50/癌细胞的LD50)，诱导的癌细胞选择性凋亡越多。
                             表6
                        LD50(nM)                   癌细胞选择性
抑制剂            HeLa            TIG-3             细胞毒性
TSA               41.4            1580              38.2
SCOP 152          370             6780              18.3
SCOP 304          151             3471              23.0
SCOP 402          1170            13300             11.4
SCOP 405          179             7900              44.1
SCOP 304/DTT      47.1            1190              25.2
SCOP 402/DTT      161             4460              27.8
如表6所示，本发明的化合物被证实具有与TSA同样有效的强癌细胞选择性细胞毒性。
[实施例54]稳定性评价
通过下面所示的方法评价SCOP152、SCOP304和SCOP402在血清中的稳定性：将1μl的10mM SCOP152、SCOP304和SCOP402加入到99μl FCS中，并在37℃下孵育。每一小时内，向每一混合物中加入用于饱和的足量NaCl和1ml乙酸乙酯。萃取后，从800μl乙酸乙酯相中蒸去乙酸乙酯，然后向残余物中加入100μl DMSO。再用DMSO将得到的溶液稀释10倍，并用于测量p21启动子诱导活性。取孵育时间0时的活性为100％，并比较活性(图7)。
如图7所示，SCOP304和SCOP402能比SCOP152更长地在血清中稳定地保持活性。这种稳定性被认为是由于硫醇基的保护而被提高的。
接着，基于组蛋白乙酰化水平考察体内稳定性。用每种化合物处理HeLa细胞，然后使用抗乙酰化赖氨酸抗体通过Western印迹法分析组蛋白乙酰化水平(图8)。具体地说，在蒸汽饱和的培育器中在5％二氧化碳存在和37℃下在包括10％FBS的DMEM培养液中培养人子宫癌细胞(HeLa)。以15000细胞/ml的密度将2ml细胞接种6孔板上，并培养18小时。加入200nM包括TSA、SCOP152和SCOP304的试验化合物溶液和1μM试验化合物SCOP402溶液，并继续培养适当的时间。用PBS洗涤细胞，悬浮到裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 7.5)，120mM NaCl，5mM EDTA和0.5％NonidetP-40)中，然后用超声波处理。通过离心收集每一上清液，与SDS缓冲液混合，并在100℃下处理5分钟。在15％SDS凝胶上对得到的样品进行电泳处理，并转移到薄膜上。用第一抗体“AKL5C1”(Japan Energy)和第二抗体“抗鼠”(LIFE SCIENCE)处理后，进行ECL(amersham pharmacia biotech)处理并检测乙酰化带。
本发明的化合物对HDAC1和HDAC4表现出强烈的抑制活性，但对HDAC6几乎没有任何抑制活性。HDAC6在睾丸等中高度表达，并预测与正常组织分化有关。但是，未发现HDAC6与癌发生有关。因此，抑制HDAC6可能会导致副作用。由于本发明的化合物具有极弱的HDAC6抑制活性和TSA不具有的亚型选择性，因此它们能用作新型的抑制剂。此外，可容易地改变本发明化合物的四肽骨架结构，意味着还能赋予更多的选择性。
工业适用性
如上所述，本发明的化合物对HDAC1和HDAC4表现出强烈的选择性抑制活性。因此，本发明的化合物可用作治疗或预防与HDAC尤其是HDAC1和HDAC4相关疾病的药剂。通过使用2-氨基-n-卤代链烷酸作为原料实现生产本发明化合物的方法，能容易地合成各种类型的化合物。因此，预期本发明生产方法的应用将对具有更高选择性的HDAC抑制剂的发展作出贡献。

Claims (9)

1.下式(1)代表的化合物：
[其中R11、R21、R31和R41独立地表示氢或甲基；R22、R23、R32、R33、R42和R43独立地表示氢、具有1至6个碳原子的直链烷基、连接有非芳族环烷基或取代或未取代芳环的具有1至6个碳原子的直链烷基、非芳族环烷基或连接有非芳族环烷基或取代或未取代芳环的非芳族环烷基；R21和R22、R22和R23、R31和R32、R32和R33、R41和R42以及R42和R43对独立地表示没有连接的无环结构或通过以下连接的环状结构：具有1至5碳主链的直链亚烷基、包括具有1至6个碳的支链的具有1至5碳主链的直链亚烷基、或包括1至6个碳的环结构的具有1至5碳主链的直链亚烷基；X表示氢、与X左侧所示相同的结构、在包括能通过二硫键与式(1)中硫原子连接的硫原子的任意结构中的取代或未取代的烷基或芳基、或通过分子内二硫键与键合到R22、R23、R32、R33、R42或R43末端且位于X左侧的硫原子连接的硫原子]。
2.包括权利要求1的化合物作为活性成分的组蛋白脱乙酰酶抑制剂。
3.包括权利要求1的化合物作为活性成分的细胞调亡诱导剂。
4.包括权利要求1的化合物作为活性成分的分化诱导剂。
5.包括权利要求1的化合物作为活性成分的血管生成抑制剂。
6.包括权利要求1的化合物作为活性成分的抗转移药。
7.治疗或预防由组蛋白脱乙酰酶1或4引起的疾病的药剂，该药剂包括权利要求1的化合物作为活性成分。
8.如权利要求7所述的药剂，其中由组蛋白脱乙酰酶1或4引起的疾病为癌、自身免疫性疾病、皮肤病或传染病。
9.一种生产权利要求1的化合物的方法，该方法包括以下步骤：
在成肽键合剂存在下使式(2)代表的化合物与式(3)代表的化合物反应得到式(4)代表的化合物：
Figure A038088750003C1
(其中n同式(1)中的定义；Hal表示选自氯原子、溴原子或碘原子的卤原子、或可用作自由基的烯丙基或烷基磺酰氧基；P2表示氨基的保护基团)；
(其中R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42和R43同式(1)中的定义；P2表示羧基的保护基团)；
(其中n、R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43、P1、P2和Hal同上面定义)；
对式(4)代表的化合物进行催化氢化、酸处理或水解以除去P1和P2；
和然后在成肽键合剂存在下进行环化得到式(5)代表的化合物；
(其中n、R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43、P1、P2和Hal同上面定义)；
或在成肽键合剂存在下使式(6)代表的化合物与式(7)代表的化合物反应得到式(8)代表的化合物：
(其中R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43和P1同上面定义)；
Figure A038088750004C3
(其中n、R11、P2和Hal同上面定义)；
(其中n、R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42、R43、P1、P2和Hal同上面定义)；
对式(8)代表的化合物进行催化氢化、酸处理、氟阴离子处理或水解以除去P1和P2；
和然后在成肽键合剂存在下进行环化得到式(5)代表的化合物；
二种方法接下来都用下述步骤处理：
使式(5)代表的化合物与包含硫原子的试剂反应得到式(9)代表的化合物；
Figure A038088750005C1
(其中n、R11、R21、R22、R23、R31、R32、R33、R41、R42和R43同上面定义；P3表示硫氢基的保护基团)；
和然后用氧化剂和氨或其它胺处理式(9)代表的化合物。
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