CN1645140A

CN1645140A - 一种转印蛋白质的狭缝电转印技术

Info

Publication number: CN1645140A
Application number: CN 200410089432
Authority: CN
Inventors: 黄云坚; 袁国亮; 项春梅; 王贻杰; 吕小玉; 张梦华; 朱旭辉; 邹龙盛; 金妙坚
Original assignee: AOYA BIO-ENGINEERING INST Ltd ZHEJIANG
Current assignee: Hangzhou AoYa Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2004-12-08
Filing date: 2004-12-08
Publication date: 2005-07-27
Anticipated expiration: 2024-12-08
Also published as: CN1304842C

Abstract

本发明公开了一种转印蛋白质的狭缝电转印技术。本发明的技术方案是：首先制备狭缝滤膜；在1×电转缓冲液中浸泡海绵垫、滤纸和电转印用膜到充分湿润；制备凝胶条，并在1×电转缓冲液中漂洗；将海绵垫、滤纸、凝胶条、狭缝滤膜、电转印用膜、滤纸、海绵垫依次平放于电转印装置夹板上，凝胶条在阴极端，电转印用膜在阳极端，组成夹层组合；将电转印夹层组合放入转印槽中，电转印用膜端紧靠正极；然后于1V/cm转印60－70分钟左右；转印结束后立即断开电源，小心拆开装置，在膜上做好所需的标记。这样蛋白质定向定位得比较好，并提高了蛋白质吸附量，提高了免疫印迹检测的灵敏度与特异性，更易判读检测结果，还避免检测结果的错判。

Description

一种转印蛋白质的狭缝电转印技术

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种条带免疫印迹技术，尤其是涉及一种转印蛋白质的狭缝电转印技术。

背景技术

狭逢印迹技术在基因工程领域应用比较广泛，主要应用于膜杂交技术中，它利用狭缝点样器将核酸分子(如：核酸探针等)加载于膜(如：硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上，然后进行分子杂交检测和分析。其优点是简单、迅速，可同时做多个样品，该技术在一般核酸分子杂交应用中基本可以获得比较理想的试验结果，但将其用于蛋白印迹往往不能达到理想的结果。主要缺点是由于蛋白分子对膜的吸附能力不如核酸分子，往往是吸附蛋白量不够，检测灵敏度不好；另一个问题是点样器在固定膜时加压较大常常留有痕迹，影响检测结果的判断。

而电转印技术常应用于蛋白质免疫印迹技术中，是通过电转印迹法将蛋白质从凝胶中转移到印迹膜(如：硝酸纤维素膜、PVDF膜等)上的方法。现在电转印迹已成为了较为常用的蛋白印迹方法。其主要优点是电转印速度快、完全。电转印迹技术有两种方法：一种是半干转印法，即将凝胶-膜夹层组合置于两个平板电极之间，通过电转印方法将蛋白质从凝胶中转印至印迹膜上；另一种是湿转印法，即将凝胶-膜夹层组合完全浸入盛有大量转印缓冲液的转印槽内，使电流从转印槽的一侧通向另一侧，通过电转印的方法可将蛋白质从凝胶中转印至印迹膜上。载有蛋白质的印迹膜用于蛋白检测与分析，湿转印法比半干转印法稍费时，也需要用较多的缓冲液，但它的转印效果较好。

上述两种技术方案在实际应用中存在着以下不足：1)目前，国外较多的条带免疫印迹试剂条制作均采用点膜机，是将蛋白质通过微量喷嘴喷印于印迹膜上，大量实验证明，容易产生交叉反应，即检测特异性不好，或需要设置临界显色条带来滤去交叉反应；2)狭缝印迹法制作的条带免疫试剂条，一方面是由于蛋白吸附量不够，检测灵敏度不好；另一方面由于存留有狭缝的痕迹，影响检测结果的判读；3)电转印技术是目前最好的蛋白印迹技术，特异性与灵敏性均佳，缺点是蛋白质需要通过电泳分离后才能转印于印迹膜上，如果蛋白质分子量相近的蛋白不能用此法转印，另由于电泳时不能进行人为控制蛋白泳动行为，转印于膜时蛋白质位置难以确定，对商品而言即为商品性能较差。

发明内容

本发明结合狭缝印迹和湿转印法的特点，提供了一种狭缝电转印技术，在条带免疫印迹技术中，本发明可以确保免疫检测的特异性和灵敏性。

本发明的技术方案是这样的：用75％的酒精将狭缝模板擦洗干净，自然干燥后，将0.45μm厚度的滤膜衬于模板下面，用刀在狭缝模板的狭缝中切割滤膜，在滤膜上切割出边缘整齐的狭缝，该狭缝的长度小于电转印用膜的宽度；滤膜的孔径为0.45μm，所述狭缝的宽度为0.5-1.0mm，所述狭缝的间距为1.0-1.5cm；电转印用膜可以选用硝酸纤维素膜，或聚偏二氟乙烯膜PVDF膜，或尼龙膜均可。

其操作方法是这样的：

将海绵垫、滤纸和电转印用膜分别浸泡在1×电转缓冲液(40-50ml)中30-60分钟，保证海绵垫、滤纸和电转印用膜充分的湿润；

制备凝胶条，放入1×电转缓冲液中漂洗1-2分钟；

准备电转装置：将电转印用膜、狭缝滤膜和凝胶条紧紧贴牢，并在电转印用膜的外侧和凝胶条的外侧分别置放两层滤纸和一层海绵垫，然后一起平放于电转印装置夹板上，凝胶条在阴极端，电转印用膜在阳极端，构成电转印夹层组合；

将电转印夹层组合放入转印槽中，电转印用膜端紧靠正极；

然后于1V/cm转印60-70分钟左右；

转印结束后立即断开电源，小心拆开装置，在膜上做好所需的标记。

采用上述技术方案，给本发明待来的有益效果是：(1)蛋白质可以定向定位地转印至印迹膜上，提高该类产品的商品性能；(2)蛋白质是通过电泳转移到印迹膜上，提高了蛋白质吸附量，从而解决了狭缝印迹技术不足，提高了免疫印迹检测的灵敏度与特异性；(3)由于特异性好，免去了设置临界显色条带，使检测结果更易判读；(4)无狭缝的压痕，印迹膜表面平滑，避免检测结果的错判。

附图说明

附图1是本发明狭缝滤膜的一种结构示意图；

附图2是本发明电转印夹层组合的一种结构示意图；

附图3是本发明转印结果的一种结构示意图。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

实施例：以转印兔抗人IgG为例

1.1狭缝滤膜的制备：

1.1.1用75％的酒精将狭缝模板擦洗干净，自然干燥后，将0.45μm厚度的滤膜衬于模板下面，用刀在狭缝模板的狭缝中切割滤膜，在滤膜上切割出狭缝，该狭缝的长度小于电转印用膜的宽度。

参看图1，滤膜的孔径为0.45μm，所述狭缝的宽度为0.5-1.0mm，所述狭缝的间距为1.0-1.5cm。

1.2试剂的准备：

1.2.1 1×TBS缓冲液

Tris-HCl 0.02M

NaCl 0.1M

定容至1000ml，调PH至7.4(可配成10×储存液)；

1.2.2 1×PBS缓冲液

NaCl 8.0g

KCl 0.2g

Na₂HPO₄ 1.44g

KH₂PO₄ 0.24g

定容至1000ml，调PH至7.4(可配成10×储存液)；

1.2.3 1×电转缓冲液

Tris 3.0g

甘氨酸 14.4g

定容至1000ml，置4℃保存(可配成10×储存液)；

1.2.4 A液：30％丙烯酰胺储存液

丙烯酰胺 29.2g

双丙烯酰胺 0.8g

定容至100ml，置4℃密封保存；

1.2.5 B液：凝胶缓冲液

1.5M Tris-HCl(pH8.8)

1.2.6 10％十二烷基磺酸钠(SDS)

将10gSDS溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；

1.2.7 10％过硫酸铵(APS)

将0.1g过硫酸铵溶于1ml蒸馏水中，4℃保存；

1.2.8封闭缓冲液

3％牛血清白蛋白BSA、0.1％Tween-20，用1×TBS溶液溶解；

1.2.9印迹缓冲液

1％牛血清白蛋白BSA、0.1％Tween-20，用1×TBS溶液溶解；

1.2.10漂洗液

0.1％Tween-20，用1×TBS溶液溶解；

1.2.11显色液储存液

5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐BCIP：将0.5g BCIP(二价钠盐)溶于10ml 100％二甲基甲酰胺

硝基四唑氮蓝NBT：将0.5g NBT溶于10ml 70％二甲基甲酰胺

碱性磷酸酶缓冲液：0.1M的NaCl、5mM的MgCl₂和0.1M的Tris-HCl(PH9.5)；

1.2.12显色液

66ul NBT溶液同10ml碱性磷酸酶缓冲液充分混匀后加入33ulBCIP溶液，置4℃的环境中，1小时内使用；

1.2.13兔抗人IgG 浓度1mg/ml

1.2.14羊抗人IgG碱性磷酸酶标记浓度1mg/ml

1.2.15正常人血清或血浆

1.3操作方法：

1.3.1将海绵垫1、滤纸2和电转印用膜3分别浸泡在1×电转缓冲液(40-50ml)中30-60分钟，保证海绵垫、滤纸和电转印用膜充分的湿润；

1.3.2准备好狭缝滤膜；

1.3.3准备好灌胶用的模具(国内外厂家生产的电泳槽即可以用来制胶，凝胶厚度0.75mm)，模具要干燥；

1.3.4按需要量配制凝胶溶液，10％凝胶溶液配制方法如下：

蒸馏水 3.9ml

A液 3.4ml

B液 2.5ml

10％SDS 100ul

10％APS 100ul

将上述溶液在烧杯中配加好后，加入蛋白质样品(如：1ml凝胶液中加兔抗人IgG 10ug)充分混匀，避免产生气泡，然后加入TEMED(10ul)溶液混匀，立即灌胶，操作要迅速，以免凝胶在灌胶时已聚合；

1.3.5用移液器小心地吸取凝胶溶液缓慢的加入模具内，避免凝胶内产生气泡；

1.3.6凝胶聚合后取出凝胶玻璃板，小心地撬开玻璃板，凝胶便会贴在其中的一块板上；

1.3.7用刀片将凝胶切成胶条或整胶，放入1×电转缓冲液中漂洗1-2分钟；

1.3.8准备电转装置：参看图2，将电转印用膜3、狭缝滤膜4和凝胶条5紧紧贴牢，并在电转印用膜3的外侧和凝胶条5的外侧分别置放两层滤纸2和一层海绵垫1，然后一起平放于电转印装置夹板上，凝胶条5在阴极端，电转印用膜3在阳极端，构成电转印夹层组合；

1.3.9将电转印夹层组合放入转印槽中，电转印用膜端紧靠正极；

1.3.10然后于1V/cm转印60-70分钟左右；

1.3.11转印结束后立即断开电源，小心拆开装置，在膜上做好所需的标记。

1.4免疫检测(间接法)

1.4.1用镊子取出电转印用膜放入容器中，加入一定量封闭缓冲液(液面必须没过膜)；

1.4.2置摇床上摇动60分钟，转速50-60转，充分封闭电转印用膜；

1.4.3摇动结束后，用漂洗液漂洗3次，5分钟/次，吸弃漂洗液；

1.4.4用镊子取出电转印用膜，自然干燥后切成0.3cm的电转印用膜条；

1.4.5用镊子取电转印用膜条放入反应槽内，每槽各一条；

1.4.6每槽加1ml漂洗液，置摇床上漂洗5分钟后，吸弃漂洗液；

1.4.7每槽加1ml印迹缓冲液，再加入10ul正常人血清，置摇床上摇动60分钟，摇动结束后，吸弃印迹缓冲液；

1.4.8每槽加1ml漂洗液，漂洗3次，每次5分钟，吸弃漂洗液；

1.4.9将羊抗人IgG标记碱性磷酸酶稀释液(1∶1000)于印迹缓冲液中，加入反应槽内置摇床上摇动45分钟，摇动结束后，吸弃印迹缓冲液；

1.4.10每槽加1ml漂洗液，漂洗3次，每次5分钟，洗好后吸尽余液；

1.4.11每槽中加入1ml显色液，置摇床上摇动10分钟，显色；

1.4.12吸弃显色液，每槽中加入1ml蒸馏水，置摇床上摇动5分钟，终止反应；

1.4.13将抗原条小心地取出放在滤纸上，吸干水份后观察结果，参看图3。

最后，应当指出，以上实施例仅是本发明较有代表性的例子。显然，本发明的技术方案并不限于上述实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims

1.一种转印蛋白质的狭缝电转印技术，其特征在于：

a.狭缝滤膜的制备：

用75％的酒精将狭缝模板擦洗干净，自然干燥后，将0.45μm厚度的滤膜衬于模板下面，用刀在狭缝模板的狭缝中切割滤膜(4)，在滤膜上切割出狭缝(6)，该狭缝的长度小于电转印用膜的宽度；

b.操作方法：

将海绵垫(1)、滤纸(2)和电转印用膜(3)分别浸泡在1×电转缓冲液(40-50ml)中30-60分钟，保证海绵垫、滤纸和电转印用膜充分的湿润；

制备凝胶条，放入1×电转缓冲液中漂洗1-2分钟；

准备电转装置：将电转印用膜(3)、狭缝滤膜(4)和凝胶条(5)紧紧贴牢，并在电转印用膜(3)的外侧和凝胶条(5)的外侧分别置放两层滤纸(2)和一层海绵垫(1)，然后一起平放于电转印装置夹板上，凝胶条(5)在阴极端，电转印用膜(3)在阳极端，构成电转印夹层组合；

将电转印夹层组合放入转印槽中，电转印用膜端紧靠正极；

然后于1V/cm转印60-70分钟左右；

2.根据权利要求1所述的一种转印蛋白质的狭缝电转印技术，其特征在于：滤膜的孔径为0.45μm，所述狭缝的宽度为0.5-1.0mm，所述狭缝的间距为1.0-1.5cm，且所述狭缝滤膜上的狭缝边缘整齐。

3.根据权利要求1或2所述的一种转印蛋白质的狭缝电转印技术，其特征在于：所述的电转印用膜是硝酸纤维素膜，或者是聚偏二氟乙烯膜PVDF膜，或者是尼龙膜。