CN1634995A - 一种精氨酸脱酰酶融合蛋白、其制造方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及人血白蛋白(human serum albumin，HSA)和支原体精氨酸脱酰酶(arginine deiminase，ADI)的融合蛋白(HSA－ADI)、该蛋白制备方法及其在制备用于治疗肝癌等肿瘤的药物中的应用。本发明利用真核表达原理与技术，通过PCR方法克隆了人血白蛋白基因，化学合成了支原体精氨酸脱酰酶基因。选用真核表达载体构建了重组质粒，转化真核细胞得到稳定表达HSA－ADI的菌种。菌种发酵后，发酵液上清经过透析、离子交换、分子筛等方法进行产品纯化。生物活性检查确证得到的新分子具有ADI活性。纯品加入保护剂后制成药用冻干制剂。药效学研究结果表明，该制剂可以用于肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、舌咽肿瘤等的治疗。

Description

一种精氨酸脱酰酶融合蛋白、其制造方法及应用

本发明属生物技术领域，提供了一种新的融合蛋白即人血白蛋白-支原体精氨酸脱酰酶融合蛋白(HSA-ADI)，发明还涉及该融合蛋白的制造方法以及该融合蛋白在制备用于治疗肿瘤的药物中的应用。

肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等肿瘤是人体常见肿瘤。研究表明，这些肿瘤多是精氨酸营养缺陷型，这些肿瘤的细胞往往不能合成精氨酸，必须依赖外界的精氨酸来维持细胞的生长繁殖，这为肿瘤的治疗提供了一个重要的线索。而人体正常细胞是能够自身合成精氨酸的。因此，把循环血液中的精氨酸浓度降低，将导致肿瘤细胞营养缺乏，达到抑制肿瘤生长的作用。

支原体M.arginini是许多细胞培养的污染物微生物，它编码的一种酶精氨酸脱酰酶(arginine deiminase，ADI)具有专一降解精氨酸的作用，在水的参与下能够把精氨酸分解为瓜氨酸和氨。ADI由arcA基因编码，蛋白总量占M.arginini可溶蛋白的10％。除了支原体M.arginini以外，其它许多微生物如Mycoplasma hominis、Mycoplasma arthritidis、Mycobacterium tuberculosis、Lymedisease spirochetes和Streptococcus等都编码ADI，后者催化精氨酸代谢为生物体提供能量。M.arginini编码的ADI是由410个氨基酸组成的球型的生物大分子，分子量为46000，等电点为4.7，没有分子内二硫键，以二聚体形式出现。

最近几年，ADI引起了人们极大的兴趣。据报道，ADI浓度在ng/ml的情况下可以抑制黑色素瘤、白血病、前列腺癌等细胞系的生长。除了能够减少特殊肿瘤细胞生长所必需的精氨酸以外，近几年的研究也认为这种酶参与细胞凋亡，并且具有抑制一氧化氮(NO)合成、中和肿瘤坏死因子等作用。令人兴奋的是，新近的研究显示ADI不但可以直接抑制癌细胞生长，而且可以抑制肿瘤新血管的生成。而肿瘤新血管的形成被认为是肿瘤生长的重要环节。

美国Phoenix Pharmacologics现在正在进行ADI修饰物治疗肝细胞癌的III期临床研究。日本Nippon Mining公司通过动物实验证明，ADI能够在体内、体外抑制6种肿瘤细胞系的生长，延长动物的生存时间。德国Essen的科研单位和医院联合试验，已经证明ADI抑制白血病细胞的生长比asparaginase更有效，也能抑制成神经细胞瘤。韩国汉城也在研究E.coli表达的ADI在抑制一氧化氮合成方面的调控作用。

众多基础和临床研究报告的结果证实了ADI的药理作用，据此可以乐观地期望ADI成为一个强有力的肿瘤治疗药物。但是相对人体来说，这种酶属于异源蛋白质，容易引起过敏反应，同时该蛋白质在人体内容易被酶降解。

人血清白蛋白是血浆的重要成分，也是许多内源因子和外源药物的载体。人血清白蛋白全长585个氨基酸，分子量约66500。正常情况下人血清白蛋白不容易透过肾小球，血浆半衰期在两周以上。这些特点都有助于其成为一个药物修饰分子。

本发明的目的是提供一种新的融合蛋白即HSA-ADI，该蛋白具有以下特点：1、特异性降解精氨酸。2、免疫原性低于ADI。3、血浆半衰期长于ADI。

这种新的融合蛋白HSA-ADI用于治疗肝癌、黑色素瘤等肿瘤具有明显的优势：1、减少过敏反应，便于多疗程或持续用药。2、增加血浆半衰期，减少注射次数，延长给药间隔，减少患者痛苦，提高患者依从性。

本发明采用下述技术方案：

(1)为了获得人血白蛋白基因和支原体ADI基因，可以采用PCR或者RT-PCR的方法扩增两条基因，同样也可以采取全合成的方法。优选的方法是全合成ADI基因，并将支原体编码色氨酸的密码子TGA改编成TGG，以便于在酵母或者哺乳动物细胞中表达。一个优选的获得HSA基因的方法是用RT-PCR的方法从人胚胎肝脏组织总RNA中获得。

(2)将HSA基因和支原体ADI基因串联。优选的串联方法是将HSA基因串联在ADI基因的上游，会提高表达量。更优选的方案是在两个基因中间加入一段编码连接肽的基因序列。所述连接肽主要由甘氨酸、丝氨酸或者脯氨酸组成。连接肽的长度可以是1-100个氨基酸，优选的连接肽长度是10-30个氨基酸。优选的连接肽序列是(甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)n，n小于10。连接肽的加入将有利于提高融合蛋白的活性。

将串联好的基因克隆到适当的真核表达载体，哺乳动物细胞表达可以选用但不仅限于pcDNA系列载体，优选的哺乳动物细胞表达载体是携带二氢叶酸还原酶基因的pcDNA系列质粒。哺乳动物宿主细胞可以选择但不仅限于CHO细胞系列，优选的是二氢叶酸还原酶缺陷型CHO细胞。

酵母表达可以选用但不仅限于pPIC系列载体，优选的酵母载体是pPIC9。可以选择将串联基因置于pPIC9载体的α因子下游。宿主酵母可以选择但不仅限于毕赤酵母，最优选的是毕赤酵母GS115。

(3)发酵工程菌种。哺乳动物细胞的发酵可以选用但不仅限于DMEM、1640、MEM或者CHO专用系列培养基。采用pPIC9转化GS115方法获得的酵母菌种发酵时，可采用常规培养基，以甘油碳源，另外加入一定比例的磷酸盐、硫酸盐、生物素等等成分。甘油消耗尽后进行0.5-2小时饥饿，然后补加甲醇，诱导48-96小时。

(4)对发酵产物进行纯化处理，其中包括透析、阳阴离子交换层析和凝胶排阻层析等。目标产物的性质可因连接肽的大小而有轻微变化。在优选的酵母分泌表达中，由于目标产物分子量较大，而酵母培养上清成分比较简单，可以采用但不仅限于盐沉淀、透析、离子交换、凝胶排阻等手段。优选的纯化工艺过程是透析-阴离子交换-S200。该工艺可以是目的产物纯度达到98％以上，并可以去除内毒素，得到符合生产制剂要求的原液。

(5)纯品加入的药用辅料可以是但不仅限于药用甘露醇以及磷酸盐缓冲液等稳定剂和助溶剂，经过过滤除菌，冷冻干燥成冻干制品。注射用水溶解后应用，可用于肝癌、黑色素瘤、乳腺癌等肿瘤的治疗。

(6)采用体外精氨酸降解试验检验新融合蛋白质的生物活性。

(7)用种植有肝癌等肿瘤的裸鼠进行药效学实验，检验新融合蛋白对肿瘤生长的抑制效果。

本技术方案提供了一种新的蛋白质，该蛋白质通过重组DNA技术进行生产，易于进行放大，可实现工业化。该融合蛋白质具有ADI活性，在肝癌乳腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、舌咽肿瘤等的治疗中具有应用前景。

本发明用下述实例进行说明：

实施例1：HSA基因的获得

根据引物设计原则设计两条引物，并在上、下游引物5’端分别加入EcoRI酶切位点和BamHI酶切位点。以人胚胎肝组织总RNA为模板进行RT-PCR，获得人血白蛋白成熟蛋白的全长基因，该基因3’端缺失终止码。参见附图1。测序正确后连接入pBV220载体，构建成pBV220-HSA。

HSA1：5’Cg gAATTCgATgCACACAAgA  3’

HSA2：5’CgggATCCTAAgCCTAAggCA 3’

实施例2：支原体ADI基因全长片段的合成

按照生物化学原理，分别对全基因的正反两条链进行分段合成，然后进行退火、连接。合成中把支原体编码色氨酸的密码子TGA该为TGG，并在基因编码链5’端分别加入BamHI酶切位点和SalI酶切位点。该基因编码链5’端除了添加酶切位点外还添加了(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂的编码序列，见附图2。测序正确后连接入pBV220-HSA载体，构建成pBV220-HSA-ADI载体。

实施例3：HSA-ADI融合蛋白表达载体的构建

根据引物设计原则设计两条引物HSA-ADI1和HSA-ADI2，并在引物5’端分别加入XhoI酶切位点和EcoRI酶切位点。以pBV220-HSA-ADI载体为模板进行PCR，获得HSA-ADI基因。该基因双酶切后连接到真核表达载体，优选pPCI9，构建成pPCI9-HSA-ADI。该融合蛋白第一区和第二区之间的连接肽为12个氨基酸即Gly-Ser-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)₂。融合蛋白的编码序列见附图3。实施例1、2、3的质粒构建过程参见附图4。

HSA-ADI1：TCTCTCgAgAAAAgAgAggCTATggATgCACACAAgA

HSA-ADI2：5’CggAATTCTTACCACTTAACATCTTTAC

实施例4：转化并筛选工程菌菌种并发酵

选用SacI、SalI等适当内酶切pPCI9-HSA-ADI质粒，转化毕赤酵母GS115，按照规定办法筛选Mut⁺、His⁺克隆，摇瓶内培养后进行甲醇诱导，选择表达量高的作为工程菌。在发酵罐内以甘油为碳源进行培养约24小时，然后以甲醇为碳源进行诱导48-96小时。发酵培养基采用常规培养基。发酵结束后收获培养上清液。

实施例5：目标产物的分离、纯化

融合蛋白HSA-ADI主要以可溶性形式存在培养上清液内。收获的上清首先用磷酸缓冲液进行透析，置换掉培养基溶液，然后采用阴离子交换和分子筛等手段进行分离精制。

实施例6：目标产物的鉴定

SDS-PAGE测定融合蛋白分子量约为114KD，纯度均在98％以上。

采用体外精氨酸降解实验检查融合蛋白的生物活性。基本原理是：ADI催化精氨酸转变成瓜氨酸，后者与diacetyl mono-oxime结合，在460nm处有强吸收，在一定的线性范围内，反应液460nm处吸光度的变化量与反应的氨基酸量成正比。操作步骤为：(1)37℃孵育酶和底物混合物1小时，混合物组成(50mM精氨酸150ul、50mM醋酸盐缓冲液(PH5.5)2.3ml、酶适量、浓度0.05％的叠氮钠3.6ul)。(2)添加2M的盐酸0.5ml终止反应。(3)1ml终止过反应的上清液中加入H₃PO₄-H₂SO₄(3/1，V/V)1.5ml和250ul diacetyl mono-oxime(1.5％)的10％甲醇溶液，黑暗中95℃反应30分钟，冷却10分钟。(4)460nm测光吸收值，该值反应了瓜氨酸的生成量。

活力单位定义：1分钟反应时间内催化1微摩尔精氨酸转变为1微摩尔瓜氨酸的酶量定义为1个活力单位(IU)。

30L发酵罐一次发酵可以得到10万IU以上的HSA-ADI。

实施例7：无菌过滤、分装、冻干

纯品可加入甘露醇等辅料制成小容量注射剂或者冻干制剂。可采用(但不仅限于)缓冲体系为10mM PB、pH6.8、5％甘露醇。在环境洁净度达到百级的条件下，用0.22μM微孔滤膜过滤，然后进行分装、冻干、封口、贴签、装箱。保存于2～8℃的冷藏环境中。

实施例8：HSA-ADI体内抗肿瘤细胞增殖试验

选用种植有肝细胞癌细胞的裸鼠30只，肿瘤直径为1-3厘米。分为低剂量给药组(10只)、高剂量给药组(10只)和对照组(10只)。采用尾静脉注射给药方法，给药容量为每只小鼠1ml。低、高剂量给药组每天注射HSA-ADI融合蛋白分别为100IU或400IU，对照组给与相同容量的生理盐水。连续给药2周，给药后7天和14天分别观察并测量肿瘤直径的变化，记录肿瘤直径增长数值。两次观察测量结果显示，给药组动物肿瘤组织生长缓慢，与对照组相比差别显著。对最后一次观察结果进行统计学分析表明，两个给药组动物肿瘤直径与对照组相比均明显缩小，P值均小于0.01。说明HSA-ADI融合蛋白对肝癌细胞生长具有明显的抑制作用。末次记录数据如下：

表.HSA-ADI体内抗肿瘤细胞增殖试验数据表(肿瘤直径变化，厘米)。

组别    1      2      3     4      5     6     7     8      9      10

高剂量  0.1    -0.2   0.3   -0.1   -0.2  0.0   0.1   0.1    -0.3   -0.4

低剂量  0.2    0.3    0.4   -0.1   -0.2  0.1   0.1   -0.2   0.0    -0.1

对照组  0.6    0.7    0.7   0.8    0.9   1.0   0.8   1.3    0.6    0.4

Claims (5)

1、一种用于治疗肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、舌咽肿瘤等肿瘤的人血白蛋白(human serum albumin，HSA)-支原体精氨酸脱酰酶(arginine deiminase，ADI)融合蛋白(HSA-ADI)。

2、权利要求1的人血白蛋白-支原体精氨酸脱酰酶融合蛋白，其特征在于：融合蛋白的N端是人血白蛋白，C端是支原体精氨酸脱酰酶，分别称为第一区和第二区。

3、权利要求2的人血白蛋白-支原体精氨酸脱酰酶融合蛋白，其特征在于：该融合蛋白第一区和第二区之间可以设有连接肽，所述连接肽长度是1-100个氨基酸，主要由甘氨酸、丝氨酸或者脯氨酸组成。

4、一种权利要求3所述融合蛋白(HSA-ADI)的制造方法，包括：

(1)合成用于克隆人血白蛋白基因的特异性引物；

(2)合成ADI全长基因；

(3)以人胎肝总RNA为模板进行RT-PCR扩增HSA基因；

(4)将(2)和(3)获得的基因串联，插入到合适的载体，构建重组高效表达载体；

(5)用酵母、动物细胞或者植物细胞作为宿主，表达权利要求4(4)所得到的高效表达载体，建立工程菌。

(6)对(5)得到的工程菌进行发酵；

(7)用透析、离子交换和分子筛等方法处理(6)得到的发酵产物，获得HSA-ADI融合蛋白纯品；

(8)在(7)所得纯品中加入保护剂，制成小容量注射剂；

5、权利要求3所述的人血白蛋白-支原体精氨酸脱酰酶融合蛋白在制备用于治疗肝癌、乳腺癌、黑色素瘤、白血病、淋巴瘤、舌咽癌等肿瘤的药物中的应用。

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