CN1634035A - 9β－乙酰基闭鞘姜内酯作为抗癌剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明是从天然药物中获取的化合物9β－乙酰基闭鞘姜内酯(9β－acetoxystunolide)作为细胞毒型抗癌剂的应用。它对L1210、CCRF－CEM、KB、MCF－7及LS174T等五种癌细胞具有选择性。9β－乙酰基闭鞘姜内酯对上述五种癌细胞的IC50分别为0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml，抗癌活性与药物浓度及作用癌细胞的时间有关，浓度越大、作用时间越长，细胞毒活性越强。对L1210癌细胞的细胞毒活性，属于细胞毒型(cytotoxic)而不是细胞生长抑制活性(Cytostatic)，它杀死癌细胞的机理与抑制微管蛋白有关，使癌细胞坏死而不是使细胞凋亡。是一种优良的抗癌剂。

Description

9β-乙酰基闭鞘姜内酯作为抗癌剂的应用
技术领域
本发明涉及生物医学，具体地说是化合物9β-乙酰基闭鞘姜内酯(9β-acetoxystunolide，又名：9β-乙酰基闭鞘姜内酯，自编号为CP-C)作为抗癌剂的应用。
背景技术
癌症是威胁人类生命的第二大杀手，每年夺去约700万人的生命，是国际上急待攻克的难题。手术、化疗、放疗综合治理迄今仍是治疗癌症的主要手段。但是化疗、放疗在杀死癌细胞的同时，也杀死宿主的正常细胞，产生严重的副作用，破坏了机体的免疫功能，使免疫系统难以对抗入侵的细菌和病毒。现行的抗癌药物缺乏对癌细胞的特异性、选择性、不能有效对抗肿瘤细胞的恶变及手术后的癌转移、扩散。对癌细胞的多药抗药性也束手无策。这种现状促使药物化学家开辟新思路，寻找、研制新结构、新活性作用机理的抗癌活性成分。
从天然药物中寻找抗癌剂或先导物是新药研究的重要途径，而体外活性筛选则是待研药物必经的第一关卡。化疗药物主要是细胞毒类药物，就是用国际通用的癌细胞系进行体外细胞毒试验，药物细胞毒活性达到国际标准(IC50≤4μg/ml)，则认为具有细胞毒活性。细胞毒药物是通过干扰与细胞的生长、死亡、分化及功能相关的机制，抑制癌细胞生长甚至杀死癌细胞。细胞毒类药物引起细胞死亡有两种机制，一种是细胞生长受到抑制，诱导细胞程序性死亡(凋亡)，第二种是细胞处于(药物)剧烈损伤条件下引起细胞坏死。
本发明人的在先发明专利公开了从杯菊中提取化合物9β-乙酰基闭鞘姜内酯及其分离提纯的方法，并通过实验发现了该物质具有抗癌活性。其结构式为：
Figure A20041007956300041
发明内容
本发明的目的是提供一种从天然药物杯菊中获得天然产物化合物9β-乙酰基闭鞘姜内酯作为抗癌剂的应用。
本发明是将具有细胞毒活性的9β-乙酰基闭鞘姜内酯作为抑制五种癌细胞的细胞毒型抗癌剂。它对五种癌细胞具有选择性，能有效杀死L1210(小鼠白血病)、CCRF-CEM(人类白血病)、KB(人鼻咽癌)、MCF-7(人乳腺癌)、LS174T(人结肠癌)等五种癌细胞。其中IC50(半数杀伤率浓度)分别是0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml。
9β-乙酰基闭鞘姜内酯(CP-C)对L1210细胞毒活性，是细胞毒类型，直接作用于细胞膜，抑制有丝分类，限制核苷掺入细胞的DNA中，其机理与抑制微管蛋白有关，引起细胞坏死，而不是引起细胞凋亡。
9β-乙酰基闭鞘姜内酯(CP-C)对L1210等五种癌细胞的作用规律是随着药物浓度增加及作用时间延长，L1210细胞生长率越低。
以下是本发明的实验方法和实验数据：
1.细胞毒试验
样品9β-乙酰基闭鞘姜内酯的细胞毒试验用锥虫兰染料排除法测定细胞毒活性，同时用生长曲线法测定药物对癌细胞生长抑制作用，并推算IC50。
实验数据：9β-乙酰基-闭鞘姜内酯对L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五种癌细胞具有选择性细胞毒活性，IC50分别为0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml。
对L1210细胞系活细胞生长影响：低浓度下(0.1，1.0μg/ml)对活细胞无抑制作用；在细胞毒浓度下(＞1.0μg/ml)随作用时间延长，活细胞数减少，48小时后癌细胞全部被杀死。见表1及图1。
表1：CP-C浓度及作用时间对体外L1210细胞生长的影响
表1
         药物浓度            24h                         48h
         (ug/ml)    细胞数        细胞生长率    细胞数        细胞生长率
对照组   0          7.22±0.40                  14.9±0.07
CP-C     0.1        6.80±0.21    94.0          13.3±0.80    89.3
         0.3        6.11±0.82    84.6          10.7±0 10    71.8
         1.0        5.00±0.14    69.3          7.29±2.10    48.9
         3.0        1.10±0.64    15.2          0.36±0.30    2.5
         10.0       0.40±0.13    5.5           0.00±0.00    0.0
2.细胞毒类活性作用机理试验
1)用微量滴定克隆测定法(Microtitration clonogenic assays)和菌落形成试验(Colony formation assays)测定细胞毒活性是细胞毒类活性(cytotoxic)还是生长抑制活性(cytostatic)。结果见表2、图2。
表2：用微量滴定克隆测定法，CP-C作用于L1210细胞2、6、24小时后，对L1210细胞菌落形成的影响。
表2
不同药物浓度相对于对照组的L1210细胞菌落形成率(％)
          (ug/ml)    2h             6h               24h
对照组    0          100            100              100
CP-C      0.1        80.4±4.1      72.6±6.7        67.9±3.7
          0.3        68.1±3.6      67.0±5.0        60.0±7.5
          1.0        44.3±3.2      45.0±7.0        36.2±10.2
          3.0        22.2±5.0      12.3±3.2        0.1±0.1
          10.0       10.5±4.4      5.8±1.5         0.1±0.1
结果表明：9β-乙酰基闭鞘姜内酯(CP-C)抑制菌落形成取决于药物作用的时间和浓度，作用时间为2h时，随浓度增加，菌落形成逐渐降低；作用24h时，细胞毒性明显增加。结论：细胞毒性比细胞生长抑制活性更敏感。
2)氚代脱氧胸腺嘧啶核苷掺入试验([3H]-thymidine incoporation)，研究CP-C对L1210细胞核酸代谢作用的影响。结果见表3、图3。
表3：CP-C作用于L1210系2、6、24小时后，对氚代-胸苷掺入L1210细胞的影响。
表3
不同药物浓度相对于对照组对[3H]-thymidine的掺入率(％)
          (ug/ml)    2h              6h             24h
对照组    0          100             100            100
CP-C      0.1        94.1±2.6       90.9±3.8      89.8±6.5
          0.3        87.9.1±3.2     82.0±2.1      79.0±11.0
          1.0        79.9±4.6       65.9±4.1      53.7±5.0
          3.0        48.1±17.8      33.9±8.9      2.3±1.7
          10.0       36.9±15.6      16.1±3.1      0.1±0.1
结果表明：CP-C随着时间和浓度的变化明显抑制氚代脱氧胸苷掺入L1210细胞的DNA中。当作用2h时，3H胸苷掺入L1210细胞的百分比开始下降，随着时间的增加，抑制增强，24h时，浓度增至10ug/mL，抑制作用最强。结论：①随CP-C浓度及作用时间增加，抑制氚代-胸苷掺入L1210细胞内的作用增强；②CP-C细胞毒性与抑制DNA合成有关。
3)用流式细胞术测定CP-C对L1210细胞周期分布的影响。
表4、图4是CP-C对L1210细胞系细胞周期分布的作用。图5是CP-C处理后，L1210的流式细胞法矩形图。
由表和图可见，CP-C阻断L1210细胞于G2/M相，推测细胞生长抑制率及菌落形成与细胞有丝分裂作用有关。
表4：CP-C作用于L1210细胞系2、6、24、48小时后，对各时相细胞周期分布的影响。
表4
温育时间    浓度     细胞周期分布百分率(％)
            (ug/mL)  HD*        G0/G1      S            G2/M        PP*
对照组0h    0        0.7±0.1    39.1±1.3    30.2±1.2    26.0±1.5    4.2±1.1
CP-C 2h     0        1.0±0.5    40.0±1.8    28.4±3.0    25.7±1.3    5.0±2.2
            0.1      1.2±0.6    40.8±1.5    28.0±1.4    26.5±2.1    3.5±1.4
            0.3      1.1±0.4    39.1±1.2    29.8±3.0    25.1±1.3    4.9±2.1
            1.0      1.5±0.6    36.9±3.4    30.6±1.8    27.4±0.9    3.6±0.9
            3.0      1.8±0.7    30.6±2.5    27.4±3.8    35.3±4.8    4.9±0.7
            10.0     2.0±0.9    26.7±2.7    27.6±2.5    38.9±2.3    3.9±2.1
6h          0        1.9±1.4    39.2±1.4    30.0±2.2    26.8±1.0    2.1±0.5
            0.1      1.2±0.2    40.6±4.7    29.3±4.1    26.5±1.4    3.3±1.6
            0.3      1.1±0.4    42.0±1.3    25.7±1.8    28.1±1.1    3.1±0.9
            1.0      1.2±0.8    40.9±1.4    18.8±2.6    35.8±1.5    3.3±1.2
            3.0      2.1±0.5    25.2±4.6    26.1±2.9    45.6±3.2    3.0±0.5
            10.0     2.8±2.4    21.9±5.8    26.3±4.1    48.3±4.1    4.7±1.5
24h         0        0.8±0.3    43.8±1.3    28.5±1.4    23.5±1.7    3.4±0.9
            0.1      1.7±2.1    44.4±4.7    28.1±5.4    22.2±0.9    3.6±1.2
            0.3      0.6±0.1    42.0±1.3    28.6±1.8    24.9±2.5    3.9±1.8
            1.0      0.6±0.2    33.2±2.3    24.3±4.3    33.9±1.8    11.0±0.3
            3.0      13.6±6.5   16.9±2.7    19.5±9.7    28.0±3.0    22.0±3.6
            10.0     18.1±7.8   19.9±9.8    22.2±1.8    25.2±3.4    15.0±4.3
48h         0        5.9±0.3    42.3±0.3    28.8±0.2    19.4±1.4    0.1±0.5
            0.1      2.3±0.4    42.9±0.2    26.3±0.8    24.1±0.1    3.2±0.9
            0.3      2.4±1.1    45.2±0.4    25.6±0.9    23.1±0.9    3.2±1.3
            1.0      2.2±0.1    30.2±1.3    24.4±0.2    21.5±0.9    21.1±1.9
            3.0      19.8±4.7   22.7±7.5    13.7±2.4    25.2±0.9    19.1±0.7
            10.0     66.5±0.0   10.3±4.7    9.6±2.3     6.1±0.5     7.6±7.2
4)DNA断裂分析(DNA fragmentation assay)见图6，经48小时药物作用后，L1210细胞系中提取DNA琼脂糖胶电泳图。由图表明CP-C未出现DNA“梯子”型标准的断裂现象。说明CP-C是细胞毒型的抗癌剂，它引起的细胞毒是使细胞坏死，而不是诱导细胞凋亡。
本发明的有益效果是：
1.从对9β-乙酰基闭鞘姜内酯的系统的药理研究提供充分的依据，证实9β-乙酰基-闭鞘姜内酯的抗癌活性是属于细胞毒类型，其活性作用机理与抑制微管蛋白有关，引起细胞坏死。9β-乙酰基闭鞘姜内酯细胞毒活性较强，具有选择性，能有效杀死L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五种癌细胞，半数杀伤率浓度IC50分别为0.41、0.59、0.16、0.92、0.53μg/ml，远远超过国际标准，9β-乙酰基闭鞘姜内酯是优良的细胞毒类抗癌剂。
2.植物杯菊中珊9β-乙酰基闭鞘姜内酯含量较高，不同季节的原料，其含量是十万分之一左右，该植物可以人工培植，能得到充足的原料。
3.从杯菊原料中提取9β-乙酰基闭鞘姜内酯，分离提纯简单易行。
附图说明
图1是本发明的CP-C浓度和作用时间对L1210细胞生长的影响。
图2是本发明的用微量滴定测定法CP-C作用于L1210细胞2、6、24小时后对L1210细胞系菌落形式的影响。
图3是本发明的CP-C作用于L1210细胞系2、6、24小时后，对氚代一胸苷掺入L1210细胞的影响。
图4是本发明的CP-C(3μg/ml)作用于L1210细胞2、6、24小时后，G、S、G2/M、HD、PP各时相细胞分布的百分率(％)。
图5是本发明的L1210细胞经CP-C处理后，CP-C对L1210细胞周期分布的流式细胞术矩形图，浓度和作用时间对细胞生长的影响。
图6是本发明的DNA断裂实验，药物作用48小时后，L1210的DNA提取物的琼脂糖胶电泳谱图。
具体实施方式
实施例：
化合物9β-乙酰基闭鞘姜内酯作为抗癌剂的应用。
1.化合物9β-乙酰基闭鞘姜内酯按以下方法分离提纯：
1)将杯菊全株干燥粉碎后，取粉碎样10千克，用95％乙醇浸泡30天，提取浸膏，得浸膏CP0≈800克；
2)取此浸膏800克，与硅藻土按1∶1比例混合，用95％乙醇搅拌混合均匀，在水浴上炒干，称重，W样＝710克，用1L索式提取器，分别用石油醚、氯仿∶乙酸乙酯＝3∶1、乙酸乙酯、丙酮、甲醇依次萃取，得粗组分CP1(120克)、CP2(100克)、CP3(100克)、CP4(130克)、CP5(150克)。
3)用L1210细胞分别对CP1～CP5进行细胞毒活性筛选，结果，抗癌活性大小依次为CP2＞CP3＞CP1＞CP4＞CP5。
4)对CP2进行柱层析，用40～63μm硅胶作吸附剂，用石油醚-乙酸乙酯-甲醇作洗脱剂，湿法装柱，分得11个组分，经细胞毒活性试验测定，得到三个活性组分(用A4、A5、A7表示)。
5)对活性组分A4用TLC级硅胶作吸附剂，用正己烷-乙酸乙酯-甲醇作洗脱剂，真空柱层析，重结晶，得纯晶体CP-C。
6)用L1210癌细胞系对粗提物对组分和纯晶体CP-C进行抗癌活性筛选，得9β-乙酰基-闭鞘姜内酯抗癌活性成分。(可参考发明专利申请02128070.3的公开说明书)
2.用染料排斥法测9β-乙酰基闭鞘姜内酯细胞毒活性及细胞生长抑制作用，来确定9β-乙酰基闭鞘姜内酯抗癌活性与浓度(使用量)的关系：
①样品处理：称取9β-乙酰基闭鞘姜内酯样品1mg，溶于二甲亚砜(DMSO)中，溶解后，每个培养槽中加4μL，把等体积的(4μL)无药样的二甲亚砜单独加在对照组槽中每个槽中，样品浓度计算如下表：
样品 DMSO  溶液     添加量  细胞量  最终浓度
1mg 200μL  0.5％(5μg/uL)     4μL  2mL/well  10μg/mL
 0.16％(1.6μg/uL)     4μL  2mL/well  3μg/mL
 0.05％(0.5μg/uL)     4μL  2mL/well  1μg/mL
 0.017％(0.17μg/uL)     4μL  2mL/well  0.3μg/mL
 0.005％(0.05μg/uL)     4μL  2mL/well  0.1μg/mL
②选用对数生长期的肿瘤细胞，用10％小牛血清的RPM11640培养基，(在24槽的培养基内，对L1210细胞系)配成5×104个细胞的悬浮液，温育24小时内，细胞不受损。然后，分装在上述不同浓度的实验组的24孔槽中。在37℃温箱中培养48至72小时。
③取等体积的(0.4ml)0.2％锥虫兰与细胞悬浮液混合后，在室温下作用5分钟，在15分钟内用血细胞计数仪在相对比显微镜(Phase-contrastmicroscopy)下计数200个细胞，未显色的是活细胞，呈蓝色的是死细胞。
④上述细胞生长试验重复3次，实验结果是三次实验的平均值。
3.结果评定：
Figure A20041007956300101
(对照组活细胞率应在90％以上)
以L1210活细胞百分率为纵坐标，以CP-C浓度的对数为横坐标作图，得细胞生长率曲线，推算半数杀伤率浓度IC50。
由图得出结论：9β-乙酰基闭鞘姜内酯对L1210、CCRF-CEM、KB、MCF-7及LS174T五种癌细胞的IC50分别为0.89、0.65、0.25、1.28、0.63μg/ml。可以作为抗癌剂使用(本抗癌剂是制备成最终抗癌药的中间产品)
9β-乙酰基闭鞘姜内酯还可溶于丙酮、乙酸乙酯、氯仿等有机溶剂中。
其他癌细胞的浓度配制：CCRF-CEM癌细胞配成1×105/槽；KB、MCF-7、LS174T细胞系浓度为4×104/槽；操作与L1210一样。
4.根据上述测定的9β-乙酰基闭鞘姜内酯抗癌活性与浓度(使用量)的关系，针对不同的癌细胞，不同的应用领域，按本领域技术人员公知的方法，配制成不同溶剂、不同浓度的CP-C抗癌剂溶液。

Claims (1)

1.化合物9β-乙酰基闭鞘姜内酯作为抑制五种癌细胞：小鼠白血病、人类白血病、人鼻咽癌、人乳腺癌、人结肠癌的细胞毒型抗癌剂的应用。
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