CN1624152A - 紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及种质资源，具体地说是一种紫菜SCAR标记的建立方法。它应用RAPD技术对紫菜材料进行遗传多样性分析，获得紫菜材料的特异性扩增片段；所述特异性片段经大量扩增后回收、克隆、测序得到紫菜材料P.tenuipedalis的RAPD扩增片段OPZ－19140和P.yezoensis qd－8的RAPD扩增片段OPJ－18488的碱基序列；再根据这两个序列两端的碱基顺合成特异引物对，经PCR反应程序，将所述特异性扩增片段转换成了SCAR标记。本发明SCAR标记可以作为紫菜P.tenuipedalis和P.yezoensis qd－8种质鉴定和产权保护的分子标记。其紫菜种质检测结果稳定、操作快捷，重复性、稳定性高；同样适合于把其它类型的标记(如AFLP，RFLP)转换为SCAR标记。
Description
技术领域
本发明涉及种质资源，具体地说是一种紫菜序列鉴定扩增区(SequenceCharacterized Amplification Region缩写：SCAR)标记的建立方法。
背景技术
紫菜是我国重要的大型经济海藻之一，其产值在海藻中位居第一。然而在开发利用紫菜资源的过程中，种质问题长期以来一直是困扰其生产的严重问题。近年来发展起来的分子标记技术，如RAPD技术，AFLP技术，SSR技术，克服了传统的形态分类学方法的诸多缺点，尤其是RAPD技术，以其简单、快速、不涉及同位素的使用等优点，被广泛应用于农作物的遗传多样性分析、种质资源鉴定等产权保护。但是用具有细胞系特异性的SCAR标记进行海藻种质鉴定，目前尚未见到有研究报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以对紫菜细胞系进行特异性种质鉴定的紫菜SCAR标记的建立方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
应用RAPD技术对紫菜材料进行遗传多样性分析，获得紫菜材料的特异性扩增片段；所述特异性片段经大量扩增后回收、克隆、测序得到其中紫菜材料P.tenuipedalis的RAPD扩增片段OPZ-19140和P.yezoensis qd-8的RAPD扩增片段OPJ-18488的碱基序列；再根据这两个序列两端的碱基顺合成特异引物对，经PCR反应程序，将所述特异性扩增片段转换成了SCAR标记；
其中：所述两个RAPD的特异引物对为OPJ-18、OPZ-19；所述2个特异标记的碱基序列为SEQ ID NO 1～2；所述P.tenuipedalis特异片段OPZ-19140的SCAR-PCR引物：P1：5’-GTGCGAGCAAGCACTGTTGAT-3’及P2：5’-GTGCGAGCAATATTTAAAGTT-3’，序列号为SEQ ID NO 3～4；所述P.yezoensis qd-8特异片段OPJ-18488的SCAR-PCR引物：P3：5′-TGGTCGCAGA ACCGGTTACC GAC-3′及P4：5′-TGGTCGCAGATCTTTTCGAA TC-3′，序列号为SEQ ID NO5～6；
所述P.tenuipedalis特异片段OPZ-19140的SCAR-PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后94℃1min，56℃1min，72℃1.5min，扩增30个循环，最后72℃延伸5min。反应条件为：反应体系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH9.0)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，约20ng模板DNA，1单位Taq DNA聚合酶；
所述P.yezoensis qd-8特异片段OPJ-18488的SCAR-PCR反应程序：94℃预变性4min，然后94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，扩增30个循环，最72℃延伸5min。反应体系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH8.8)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，约20ng模板DNA，1单位Taq DNA聚合酶。
所述由P.tenuipedalis的RAPD扩增片段OPZ-19140和P.yezoensis qd-8的RAPD扩增片段OPJ-18488转换的SCAR标记可以作为紫菜P.tenuipedalis和P.yezoensis qd-8种质鉴定和产权保护的分子标记。
本发明具有如下优点：
1.为了能将在实验室中获得的RAPD标记应用于生产实践、特别是应用于海藻种质鉴定，本发明将有关RAPD标记经过回收、克隆、测序、合成特异的PCR引物，优化PCR反应条件，最后将其转换成SCAR(Sequence-characterized Amplified Region)标记。采用本发明SCAR标记进行紫菜种质检测时，结果稳定且操作简便快捷。现有技术中采用的RAPD技术，扩增过程中不是碱基严格匹配，只是部分碱基匹配，因此错配几率较高，重复性、稳定性较差。然而按照本发明转换为SCAR标记后，引物与模板碱基严格配对，因此，重复性、稳定性高。
2.一般来讲RAPD要求的条件严格，对设备精密度要求较高，因此，在基层单位很难应用，而本发明SCAR标记稳定性、重复性、实用性强，一般的PCR仪都可以使用，因此，该技术可在基层单位推广应用。
3.现有技术RAPD扩增图谱中存在大量条带，需要认真分辩、鉴定，而在本发明SCAR图谱中只有特异的品系才能出现特异的扩增条带，因此，结果清晰、明确，易识别。通常用的RAPD结果不宜作为种质鉴定的法律证据，而本发明SCAR标记可以作为法律证据，用于种质鉴定(如：对紫菜细胞系P.tenuipedalis和P.yezoensis qd-8进行种质鉴定)及产权保护。
4.本发明将RAPD标记转换为SCAR标记的方法不仅应用于海藻种质鉴定，同样适合于把其它类型的标记(如AFLP，RFLP)转换为SCAR标记。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详述本发明。
实施例1
本发明SCAR标记的建立主要内容包括以下几个方面：
1、选用的实验材料：
本研究共收集了7种共27个紫菜材料，其中条斑紫菜(P.yezoensis)15个，坛紫菜(P.haitanensis)6个，少精紫菜(P.oligospermatangia)2个，甘紫菜(P.tenera)1个，半叶紫菜(P.katadai.var.hemiphylla)1个，列紫菜P.seriata 1个和生活史特异的贝壳紫菜(P.tenuipedalis)1个(见表1)。
表1 紫菜材料的来源和特性
种类 编号 特性 来源
Y9101 高产，耐高温，抗病性强 江苏连云港海区
Ymg9602 Y9602的绿色突变体 江苏海洋水产研究所
Y9430 质优，丝状体成熟较难，单孢子少 江苏南通海区
Y9502 耐高温，抗逆性强，单孢子少 福建海区
Y9830 保持系 江苏南通海区
Y92-1 研究材料 国外引进
Y94-1 研究材料 国外引进
条斑紫菜
Y95-1 研究材料 国外引进
P.yezoensis
Yqd-2 研究材料 江苏如东海区
Ynt-6 高产，适温广，抗逆性强 江苏连云港海区
Ynt-8 质优，适温广，抗逆性强，藻体薄 江苏海区
Yqd-6 研究材料 江苏如东海区
Yqd-8 研究材料 青岛海区
Ysh-6 Y92-1的绿色突变体 上海水大
Y92-3 研究材料 国外引进
H9208 优质，丝状体成熟 福建南日岛海区
H9161 野生种的栽培种质 福建海区
坛紫菜 H182 杂种 福建海区
P.haitanensis Hqd-1 研究材料 浙江舟山海区
Hqd-5 研究材料 福建连江海区
H02-1 研究材料 浙江海区
少精紫菜 O9406 研究材料 福建连江海区
P.oligospermatangia O9301 研究材料 福建连江海区
甘紫菜
T94-2 研究材料 国外引进
P.tenera
列紫菜
S02-1 研究材料 国外引进
P.seriata
半叶紫菜
K9401 研究材料 山东青岛海区
P.katadai
贝壳紫菜
Tsh-8 研究材料 国外引进
P.tenuipedalis
2、紫菜DNA的提取及纯化：
按如下程序提取各个紫菜的基因组DNA(参见王斌等，玉米自交系8112特异SCAR标记的获得，高技术通讯，1999，9(3)：45-47)。简述如下：
取新鲜组织2g，在液氮中研磨成粉，置于50ml离心管，加入8ml提取液(100mM Tris，pH8.0，50mM EDTA，500mM NaCl，1.5％SDS)，50℃下处理30分钟，不时颠倒混匀，加2.5ml 5M乙酸钾(KAC)，冰浴10分钟，加2.5ml氯仿，颠倒混匀，10000rmp离心8分钟，取上清移入新管，加2/3体积预冷异丙醇，颠倒混匀，-20℃置1-2小时，搅出絮状白色DNA，70％乙醇洗1～2次，吹干，溶于100μl TE中，并在1％琼脂糖凝胶上电泳，用标准λDNA作对照，估算紫菜DNA样品的浓度，获得高纯度紫菜DNA。
3、用获得高纯度紫菜DNA为模板进行RAPD分析：
RAPD反应在MJ Research PTC-100型PCR仪上完成，引物分别选用美国Operon公司的产品420个引物中的OPJ-18、OPC-04和OPX-06；RAPD-PCR反应体系为25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH9.0)，50mMKCl，2.0mM Mg2+，0.15mM dNTP，15ng引物，20ng模板DNA，1单位Taq DNA聚合酶；反应程序为94℃预变性4min，然后按94℃45s，37℃1min，72℃1.5min，扩增42个循环，最后72℃延伸5min；扩增产物在1.0％琼脂糖凝胶上电泳，经EB染色后在Bio-Rad DOC-1000型凝胶成像系统中观察并记录结果，获得7个紫菜材料的特异性扩增片段。
4、RAPD特异扩增产物的回收、克隆和测序(参见王斌等，玉米自交系8112特异SCAR标记的获得，高技术通讯，1999，9(3)：45-47)。
RAPD产物经琼脂糖电泳，在紫外灯下切取目的片段，用DNA片段回收纯化试剂盒(Promega)进行回收。回收片段经琼脂糖电泳检验、定量后，利用T-Easy连接试剂盒(Promega)克隆到pGEM-T Easy载体中，经电击转化转入E.coli DH10B菌株，摇菌培养，提取质粒DNA后用EcoR I进行酶切检验。确认所得克隆与相应RAPD特异片段一致后，送博亚生物技术公司进行测序分析，得5个特异标记的碱基序列。这时，本实施例从420个引物的扩增产物中筛选出两个特异片段OPZ-19140和OPJ-18488，结果示于图1和图2。其中：
图1 P.tenuipedalis特异片段OPZ-19140的SCAR标记转换中A为RAPD标记(OPZ-19140)；B：SCAR标记；M为DNA marker DGL-2000；1-27为供试的27个紫菜的编号(详见表1)；箭头所示为P.tenuipedalis的特异扩增片段OPZ-19140。
图2 P.yezoensis qd-8特异片段OPJ-18488的SCAR标记转换中A为RAPD标记(OPJ-18488)；B：SCAR标记；M为DNA marker DGL-2000；1-27为供试的27个紫菜的编号(详见表1)；箭头所示为P.yezoensis qd-8的特异扩增片段OPJ-18488。
这两个特异片段的测序结果分别示于序列表SEQ ID NO 1～2，SEQ IDNO 1为紫菜细胞系P.tenuipedalis的特异扩增片段OPZ-19140的碱基序列：
GTGCGAGCAA GCACTGTTGA TACAAATAAG GATATCTTTG
AATCAAATTA CCAACAGTAT GTTGTTTAGT TGGAGAAGTT
TTTTCTTGGC TTTGACGAAT TAAATTACTG AGACGTTTTA
ACTTTAAATA
TTGCTCGCAC；
其中：下划线所示为随机引物OPZ-19的碱基序列。
SEQ ID NO2为紫菜细胞系P.yezoensis qd-8的特异扩增片段OPJ-18488的碱基序列：
TGGTCGCAGA TCTTTTCGAA TCATATGTAG GATCAATCAT
TGGAACCATG GTGCTTGGTG CCGCTTTTAT GGGACTTGCA
CCATTTCAAG GTGATGGCTT TGGTGGTTTG AGTGCTGTGC
TTTTGCCGCT CGCATTGGCG AGTATGGGTA TCGTAACTTC
GATTCTTGGT ACTTTCTTCG TGAAAGTTAA AGAAGGCGGA
GATCCGCATA AAGCCTTGAA TAAAGGCGAA TTTGGTTCAG
CACTGGTATT ACTGGTGGCA ACTTATTTCG CAGTTAAAGG
CATGCTGCCG GAATCCTGGA CAGTTGCCGG CGCCGAAAGC
GCTTACACTT CTAATGGCGT TTTTATCTCT ATCCTTATCG
GCCTTGCCTC TGGTTTGGCT ATTGGTAAAA TTACCGAATA
TTACACCGGC ACCGGTACTG GTCCGGGTAT TTCAATTGTA
AAACAGTCGG TAACCGGTTC
TGCGACCA
其中：下划线所示为随机引物OPJ-18的碱基序列。
5、SCAR引物设计
分析测序结果确认目的片段后，根据测序的2个末端的序列设计各20-24bp SCAR-PCR引物，每对引物都包含对应的RAPD引物10碱基序列和与之相邻的10-14碱基序列，由北京赛百盛公司进行引物合成。(参见王斌等，玉米自交系8112特异SCAR标记的获得，高技术通讯，1999，9(3)：45-47)。
对特异片段OPZ-19140和OPJ-18488的末端顺序(参见序列表SEQ ID NO1～2)，设计的两对引物如下：
P.tenuipedalis特异扩增片段OPZ-19140的SCAR-PCR引物(参见序列表SEQ ID NO 3～4)：
P1：5’-GTGCGAGCAAGCACTGTTGAT-3’
P2：5’-GTGCGAGCAATATTTAAAGTT-3’
P.yezoensis qd-8特异扩增片段OPJ-18488的SCAR-PCR引物(参见序列表SEQ ID NO 5～6)：
P3：5′-TGGTCGCAGA ACCGGTTACC GAC-3′
P4：5′-TGGTCGCAGA TCTTTTCGAA TC-3′
6、SCAR-PCR反应
取合成的SCAR引物先按常规PCR反应进行扩增，然后优化反应条件，得到了特异的目的片段。本实施例的两个反应程序具体为：
P.tenuipedalis特异扩增片段OPZ-19140的SCAR-PCR反应程序(称为程序1)为94℃预变性4min，然后94℃1min，56℃1min，72℃1.5min，扩增30个循环，最后72℃延伸5min。反应条件为：反应体系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH9.0)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，约20ng模板DNA，1单位Taq DNA聚合酶。扩增产物在MJResearch PTC-100型PCR仪上完成。
P.yezoensis qd-8特异扩增片段OPJ-18488的SCAR-PCR反应程序(称为程序2)为94℃预变性4min，然后94℃1min，58℃1min，72℃1.5min，扩增30个循环，最后72℃延伸5min。反应条件为：反应体系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH8.8)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，约20ng模板DNA，1单位Taq DNA聚合酶。扩增产物在MJResearch PTC-100型PCR仪上完成。
如图1和图2所示，将P.tenuipedalis特异片段OPZ-19140和P.yezoensisqd-8的特异片段OPJ-18488转换为SCAR标记已获成功。可以看出，在SCAR-PCR扩增中只有一个细胞系特异的扩增条带出现，而其它细胞系中都没有扩增产物，结果清楚、明了。
本实施例应用RAPD技术对生产上广泛应用的、野生的和国外引进的共27个紫菜材料进行遗传多样性分析，获得7个紫菜材料的特异性扩增片段。这些特异性片段经大量扩增后回收、克隆、测序得到了其中5个特异标记的碱基序列，根据克隆片段两端序列合成特异引物对，成功地将其中2个标记(即紫菜材料P.tenuipedalis的RAPD标记OPZ-19140和P.yezoensisqd-8的RAPD标记OPJ-18488)转换成了SCAR标记。这两个SCAR标记可以用于对这2个紫菜细胞系进行种质鉴定和产权保护。
实施例2
建立细胞系特异的SCAR标记难度较大，费用较高，但是SCAR标记一旦建立后使用起来非常方便，而且便宜、快速，应用价值高。本实施例采用已获得的SCAR标记对紫菜细胞系(P.tenuipedalis和P.yezoensis qd-8)进行种质鉴定。
要确定未知材料是否是细胞系P.tenuipedalis，只要采用本发明确定的SCAR引物Primer 1和Primer 2用反应程序1进行SCAR-PCR扩增，能够扩增出特异片段OPZ-19140的就是细胞系P.tenuipedalis；没有扩增片段OPZ-19140的就不是这个材料。实验结果快速、正确。
同样，如果要确定一个未知材料是否是细胞系P.yezoensis qd-8，只要用本发明确定SCAR引物Primer 3和Primer 4，用反应程序2进行SCAR-PCR扩增，能够扩增出特异片段OPJ-18488的就是细胞系P.yezoensisqd-8；没有该扩增片段的就不是这个材料。
Claims (8)
1.一种紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法，其特征在于：应用RAPD技术对紫菜材料进行遗传多样性分析，获得紫菜材料的特异性扩增片段；所述特异性片段经大量扩增后回收、克隆、测序得到其中紫菜材料P.tenuipedalis的RAPD扩增片段OPZ-19140和P.yezoensis qd-8的RAPD扩增片段OPJ-18488的碱基序列；再根据这两个序列两端的碱基顺合成特异引物对，经PCR反应程序，将所述特异性扩增片段转换成了SCAR标记。
2.按照权利要求1所述紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法，其特征在于：所述两个RAPD的特异引物对为OPJ-18、OPZ-19。
3.按照权利要求1所述紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法，其特征在于：所述特异标记的碱基序列为SEQ ID NO 1～2。
4.按照权利要求2所述紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法，其特征在于：所述P.tenuipedalis特异片段OPZ-19140的SCAR-PCR引物：P1：5’-GTGCGAGCAAGCACTGTTGAT-3’及P2：5’-GTGCGAGCAATATTTAAAGTT-3’，序列号为SEQ ID NO 3～4。
5.按照权利要求1所述紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法，其特征在于：所述P.yezoensis qd-8特异片段OPJ-18488的SCAR-PCR引物：P3：5′-TGGTCGCAGA ACCGGTTACC GAC-3′及P4：5′-TGGTCGCAGATCTTTTCGAA TC-3′，序列号为SEQ ID NO 5～6。
6.按照权利要求1所述紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法，其特征在于：所述P.tenuipedalis特异片段OPZ-19140的SCAR-PCR反应程序为：94℃预变性4min，然后94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1.5min，扩增30个循环，最后72℃延伸5min。反应条件为：反应体系25μl，其中含有10mMTris-HCl(pH9.0)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，约20ng模板DNA，1单位Taq DNA聚合酶。
7.按照权利要求5所述紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法，其特征在于：所述P.yezoensis qd-8特异片段OPJ-18488的SCAR-PCR反应程序：94℃预变性4min，然后94℃ 1min，58℃ 1min，72℃ 1.5min，扩增30个循环，最72℃延伸5min。反应体系25μl，其中含有10mM Tris-HCl(pH 8.8)，50mM KCl，1.8mM Mg2+，0.15mM dNTP，20ng引物，约20ng模板DNA，1单位Taq DNA聚合酶。
8.按照权利要求5所述紫菜序列鉴定扩增区标记的建立方法，其特征在于：所述由P.tenuipedalis的RAPD扩增片段OPZ-19140和P.yezoensis qd-8的RAPD扩增片段OPJ-18488转换的SCAR标记可以作为紫菜P.tenuipedalis和P.yezoensis qd-8种质鉴定和产权保护的分子标记。
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