CN1583769A - 9－[2－(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤双环醇酯及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种新的抗病素活性化合物9－[2－(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤双环醇酯，是由9－[2－(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤与4，4′－二甲氧基－5，6，5′，6′－双(亚甲二氧基)－2－羟甲基－2′－甲氧羰基联苯反应生成。这种阿德福韦双环醇酯还可以盐的形式而存在。该阿德福韦双环醇酯及其盐为白色固体，实验表明该化合物具有熔点高、吸湿性少，对光、热等稳定性好，具有显著的抗病毒活性和良好的保肝、护肝双重功效，可作为制备抗肝炎病毒的优选药物。

Description

9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤双环醇酯及其制备方法

所属技术领域

本发明涉及医药用杂环化合物领域，更具体地说是关于膦酰基甲氧基核苷酸类似物的双环醇酯化合物及其制备技术。

背景技术

下列定义适用于整个说明书和权利要求书。

PMEA＝阿德福韦(Adefovir)，化学名为9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤；

AD＝Adefovir Dipivoxil，阿德福韦的双新戊酰氧基甲酯；

PMEA-DBOL＝化学名为：2-(N⁹-腺嘌呤基)-乙氧基甲基磷酸：双环醇酯；

“药用盐”＝是指一些含有酸性基团，并具有保肝、护肝药物活性的中药提取物与(I)式化合物形成的一类盐；

PMEA-BOL＝2-(N⁹-腺嘌呤基)乙氧基甲基磷酸双环醇单酯；

双环醇＝(Bicyclol)，化学名为4，4’-二甲氧基-5，6，5’6’-双(亚甲二氧基)-2-羟甲基-2’-甲氧羰基联苯；

核苷酸类似物阿德福韦化学名为9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤(简称PMEA)它对HIV，HBV等病毒具有较强的抗病毒活性和抗耐药性，用于治疗各种类型的乙型肝炎，其双新戊酰氧基甲酯即阿德福韦酯(Adefovir Dipivoxil，简称AD)已经在国外上市。

PMEA和AD在US4724233，EP 048241、WO990477、Antiviral Res.(1992)19：267-273，和J.Med.Chem.(1994)37：1857-1864.等专利文献中有描述。目前还没有发现对阿德福韦耐药性的变株，非常具有临床价值。

双环醇(Bicyclol)化学名为4，4’-二甲氧基-5，6，5’，6’-双(亚甲二氧基)-2-羟甲基-2’-甲氧羰基联苯，是中国医学科学院药物研究所研制的国家一类抗慢性病毒性肝炎化学新药，已在14个国家和我国台湾地区获得专利保护，药理学研究证明，该药具有显著的保肝作用和一定抗肝炎病毒活性。双环醇50，100，200mgokg-lig对四氯化碳、D-氨基半乳糖、对乙酰氨基酚引起的小鼠肝损伤以及卡介苗+脂多糖(LPS)诱导的小鼠免疫性肝炎均有明显降谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)作用，并能减轻肝组织病理损伤。双环醇体外给药对2.2.15细胞株分泌乙型肝炎e抗原(HBeAg)和乙型肝炎表面抗体(HBsAg)有抑制作用，该药0.4和0.6gokg-lig口服对鸭病毒性肝炎血清和肝脏的鸭肝病毒(DHBV-DNA)有显著抑制作用，对该药作用的机制进行多方面研究的结果表明，双环醇可清除自由基，保护细胞膜，亦可以保护肝细胞核DNA免受损伤和减少细胞凋亡的发生。双环醇具有一定的抗肝炎病毒和抗肝细胞损伤两方面的作用。但是双环醇在应用抗病毒方面能力远远不够。

PMEA和AD可用来抗病毒治疗乙型病毒肝炎，无保肝和护肝的作用；双环醇具有显著的保肝作用和一定的抗肝炎病毒活性。对于急、慢性肝炎患者来说，即需要显著的抗病毒治疗，又需要很好的护肝和保肝治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种稳定性好，且具有抗病毒活性和保肝、护肝双重作用的核苷酸类似物的双环醇酯的新化合物。

本发明的另一个目的是提供了这种核苷酸类似物的双环醇酯化合物的制备方法。

本发明的再一个目的是提供具有抗肝炎病毒活性，保肝护肝作用的药物组合物，该药物组合物含有治疗有效量的式(I)化合物的活性成分，以及药学上可接受的载体。

本发明提供了下面的通式(I)化合物：

在上述式(I)化合物定义中所述的R1为式(II)的基团；R2表示氢或R1。

在上述(I)式化合物定义中，包括R2为H的单双环醇酯，其结构式为：

化学名为2-(N⁹-腺嘌呤基)乙氧基甲基磷酸双环醇单酯，简称：PMEA-BOL；

或R2为R1的双环醇二酯，其结构式为：

化学名为：2-(N⁹-腺嘌呤基)乙氧基甲基磷酸二双环醇酯，简称：PMEA-DBOL；

通式(I)的化合物还可以以多种盐的形式存在，它包括(I)式化合物的无机酸盐，如它的盐酸盐、硫酸盐等。有机酸盐，如富马酸盐、马来酸盐、对甲基苯磺酸盐等；以及含有酸性基团的保肝护肝类药物的盐，如(I)式化合物的甘草酸盐，葡萄糖醛酸盐、齐墩果酸盐。

本发明提供的式(I)化合物的制备方法包括：

(A)将通式(III)的化合物PMEA：

与卤酰化剂反应得到通式(IV)的膦酰卤化合物：

这里所说的卤酰化剂它选自二氯亚砜、五氯化磷等常规卤化剂，反应是在惰性溶剂或无溶剂存在下进行；

接着式(IV)的膦酰卤化合物与式(V)的双环醇进行酯化反应，

与过量的双环醇反应生成(VI)式的双环醇二酯化合物；相对于(III)式化合物与等量或不足的双环醇反应则生成(VII)式的双环醇单酯化合物；

(B)通式(II)的化合物在惰性溶剂中，在催化剂存在下，直接与式(V)的双环醇进行酯化反应得到(VI)式的双环醇二酯(PMEA-DBOL)和(VII)式的双环醇单酯(PMEA-BOL)。这里所说的催化剂它选自盐酸、硫酸、氢溴酸。酯化反应优选在溶剂回流温度下进行，所说的惰性溶剂它选自苯、甲苯、四氢呋喃、1，4-二氧六环、二氯甲烷、氯仿等。

PMEA可参照US4724233、EP048241和J、Med、Chen(1994)37：1857-1864等文献资料进行制备。

本发明制取的(I)式化合物为白色固体，它还可以与酸成盐。这些以盐形式存在的(I)式化合物，仍然具有同等的抗病毒活性与保肝、护肝作用。这些盐包括(I)式化合物的无机酸盐。如它的盐酸盐、硫酸盐等；有机酸盐，如富马酸盐、马来酸盐、对甲基苯磺酸盐等；以及含有酸性基团，并具有保肝、护肝药物活性的药用盐，如甘草酸盐、葡萄糖醛酸盐、齐墩果酸盐等。这些盐可以用常规的中和方法制备，通常是在乙醇、乙醚之类的有机溶剂中进行。

本发明制取的(I)式化合物及其盐，还可以以治疗上的有效量用于制备治疗抗肝炎病毒的药物组合物，其中可包含有治疗有效量的式(I)化合物的活性组分以及药学上可以接受的载体。

本发明提供的这种药物组合物中，通常含有成人可接受的阿德福韦双环醇二酯量为20mg/片；对于阿德福韦双环醇单酯的含量则为12.5mg/片。

为证明(I)式化合物的稳定性，用本发明的PMEA-DBOL做了稳定性实验，并以WO-9904774专利中报道的形态1为对照。试验样品分别放与40℃、60℃，75％相对湿度，4000LX光照条件下，于1 0天，30天，60天取样，用HPLC法测定有关物质，结果见表1。

表1 PMEA-DBOL稳定性对比结果

放置条件	时间	PMEA-DBOL	形态1
						有关物质	有关物质
	0天	0.36	0.42
				40℃	10天	0.36	0.43
30天	0.37	0.45
			60天		0.41	0.48
60℃	10天	0.38					0.48
			30天	0.42	0.52
	60天	0.46				0.53

光照	10天	0.36	0.42
				30天	0.36	0.42
	60天	0.39	0.43
				75％相对湿度	10天	0.37	0.44
30天	0.40	0.43
			60天		0.42	0.46

实验结果表明，(I)式化合物PMEA-DBOL在40℃，60℃，4000LX光照，75％相对湿度等条件下表现出更好的稳定性。

进一步用大白鼠观察了本发明PMEA-DBOL的保肝作用，并与PMEA、双环醇作了比较。

选用50只体重为200±20g大白鼠，平均分五个研究组。第一组为正常对照组，第二组为肝损伤模型组，第三组为本发明药物PMEA-DBOL治疗组，第四组阿德福韦酯治疗对照组，第五组为双环醇治疗对照组。第二组、第三组、第四组、第五组于试验的第一、五天分别于皮下注射纯的四氯化碳(5ml/kg)，第三组于第一天至第六天皮下注射阿德福韦双环醇酯生理盐水溶液70mg/kg，第四组于第一天至第六天皮下注射阿德福韦酯生理盐水溶液35mg/kg，第五组于第一天至第六天皮下注射双环醇生理盐水溶液140mg/kg，，第一组于第一天至第六天注射相同体积的生理盐水，于第七天测定血清谷丙转氨酶，并取肝脏做病理切片检查，结果如下表：

组别	第一组	第二组	第三组	第四组	第五组
						谷丙氨酸转	26	200	44	205	42

氨酶(u/l)
						肝脏切片观察结果	正常	肝细胞变性、浸润、坏死严重	有少量肝细胞变性及坏死	肝细胞变性、浸润、坏死严重	有少量肝细胞变性及坏死

结果表明：

(1)剂量水平为70mg/kg阿德福韦双环醇酯和140mg/kg的双环醇酯都能明显抑制谷、丙胺酸酶的升高，而阿德福韦酯几乎没有抑制谷、丙胺酸酶的升高的作用。

(2)病理切片检查表明，阿德福韦双环醇酯和双环醇对肝细胞变性、浸润、坏死等指标都具有明显的改善作用，而阿德福韦酯几乎没有改善作用。

同时用体外抗乙肝病毒实验观察了本发明PMEA-DBOL的抗病毒活性，并与PMEA、双环醇作为比较。实验是将HBV-DNA转染的细胞株，在10％的牛血清培养液中进行。

将HBV-DNA转染的2.2.15细胞珠在10％的牛血清培养液中进行，培养，分成五个试验组。第一组为自然对照组，第二组为治疗组和第三组为阿德福韦酯治疗对照组，第四组为双环醇治疗对照组。当生长达到70％培养面积(25CM²)时，改用2％的牛血清培养液培养，并开始分别对第二组给予35ug/ml的阿德福韦双环醇双酯进行治疗，第三组给予17.5ug/ml的阿德福韦酯进行治疗，第匹组给予70ug/ml的双环醇进行治疗。每两天更换培养液，治疗组都分别补充相同浓度的药物，共培养10天，培养过程中测定两组培养液中HbsAg的含量，见下表。

      培养液中HbsAg的浓度(ug/ml)

天数	0	2	4	6	8	10
							对照组	2	2.1	2.2	2.3	2.4	2.5
PMEA-DBOL治疗组	2	1.4	1.2	1.0	0.8	0.7
							AD治疗组	2	1.6	1.4	1.3	1.2	1.1
双环醇治疗组	2	1.8	1.7	1.6	1.5	1.5

从表中数据可见，

(1)对照组培养液中HbsAg浓度随着时间延长在持续地增加，治疗组在治疗2天后开始下降，这表明治疗组都具有抗HBV病毒作用。

(2)阿德福韦酯和阿德福韦双环醇酯治疗组的培养液中HbsAg浓度变小比双环醇大，这表明阿德福韦酯和阿德福韦双环醇酯具有更为显著的抗HBV病毒作用，而且阿德福韦双环醇酯作用效果更好。

总之，本发明研制成功的9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤双环醇酯为白色固体，实验证明该化合物具有熔点高，吸湿性小，对光、热等稳定性好，具有显著抗病毒和良好的保肝、护肝双重功效，可作为治疗乙肝的优选药物。

具体实施方式

下面再用一些实施例对本发明作进一步说明，给出本发明的一些实施细节，但是并不旨在限定本发明的保护范围。

例1制备对甲苯磺酰甲基膦酸二乙酯(中间体1)

将74ml亚磷酸二乙酯、9ml三乙胺、22g多聚甲醛与340ml甲苯加入三口瓶中，控温87℃反应2hr，然后升温回流5hr，停止反应，冷却至0℃，加入100g苯磺酰氯后滴加三乙胺82g(控制温度小于10℃，约3小时滴完)，室温反应24hr，降温、过滤、甲苯洗涤、水洗、无水硫酸镁干燥、过滤、浓缩得到100g中间体1。

例2制备9-[2-羟乙基)腺嘌呤(中间体2)

将4g氢氧化钠、200g腺膘呤、160g碳酸亚乙酯和1000mlDMF加入三口瓶中，升温135℃反应8hr-10hr(TLC检测无腺膘呤停止反应，展开剂：丙酮∶乙酸乙酯∶氨水＝4∶3∶1)，冷却至50℃，加入甲苯1400ml，冷冻结晶，过滤、冷甲苯和无水乙醇洗涤、真空干燥(60℃)得到类白色固体290g。

例3制备9-[2-[二乙基氧磷酰甲氧基]乙基]腺嘌呤(中间体3，简称PMEA乙酯)

将9-(2-羟乙基)腺膘呤20g、DMF 80ml加入三口瓶中，升温125℃反应1hr，冷却条件下，分批加入叔丁醇钠19g(加料控制温度小于20℃)，加料完毕，冰浴冷却，滴加54g苯磺酰甲基膦酸二乙酯的80ml DMF的溶液(控温0℃)，滴加完毕，0℃反应5hr(TLC检测无9-(2-羟乙基)腺膘呤原料，展开剂：乙醇∶二氯甲烷＝1∶4)，加入冰醋酸67g，20℃反应1hr，真空浓缩至半固体，加入二氯甲烷，过滤，滤液浓缩，用二氯甲烷萃取、水洗、干燥、浓缩、浓缩液加入150ml甲苯，冷冻析晶，过滤，乙醚洗涤，真空干燥(30℃)得到13g白色物质。

例4制备PMEA

将10g中间体3、43g三甲基溴硅烷、乙腈200g加入三口瓶中，升温回流5hr，浓缩，加60ml水升温搅拌溶解，随后加入120ml丙酮，冷冻析晶，过滤，丙酮洗涤，乙醚洗涤，真空干燥(80℃)，得到8g白色固体。

例5合成阿德福韦二双环醇酯

将10g 9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤(简称PMEA)、20ml二氯亚砜加入到三口瓶中，室温搅拌4小时，真空浓缩除去过量的二氯亚砜。加入干燥的四氢呋喃溶解，慢慢滴加含有40克双环醇的四氢呋喃溶液，冰浴冷却，加毕后室温搅拌2小时，静止过夜，过滤，得到阿德福韦双环醇酯盐酸盐粗品。

阿德福韦双环醇二酯盐酸溶于水过滤，除去不溶物，用饱和溶碳酸钠调制PH＝8，用二氯甲烷萃取，浓缩近干，加入乙醚，得到白色固体，用乙酸乙酯-石油醚重结晶得到5g阿德福韦双环醇双酯HPLC检测≥99％，mp105℃。

元素分析(％)(C₆₈H₆₄N₅O₂₁P)

元素	C％	H％	O％	N％	P％
						理论值	55.06	5.22	26.58	5.53	2.45
测定值1	55.04	5.23	26.60	5.52	2.46
						测定值2	55.02	5.24	26.59	5.53	2.39

IR(KBr)以cm^-1表示特征吸收峰：特征吸收峰，以CM^-1表示：3224(O-H)、3107-3152(N-H，C＝C-H)2986-2939(C-H)、1759(C＝O)，1678(C＝N)，1620(C＝C)，1269(P＝O)，1102(C-O-C)

例6制备阿德福韦双环醇双酯

将10g 9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤(简称PMEA)、100ml四氢呋喃、40g双环醇加入到三口瓶中，通入干氯化氢气体，至饱和，回流3小时，冷至室温静止2小时过滤，得到阿德福韦二双环醇酯盐酸盐粗品。如例1相同的方法处理阿德福韦二双环醇酯盐酸盐得到3.5g阿德福韦二双环醇酯，mp104-105℃

例7制备阿德福韦双环醇单酯

将10g 9-[2-(膦羧基甲氧基)乙基]腺嘌呤(简称PMEA)、100ml四氢呋喃、15.4g双环醇加入到三口瓶中，通入干氯化氢气体，至饱和，回流3小时，冷至室温静止2小时过滤，得到阿德福韦双环醇单酯粗品。用甲醇-四氢呋喃重结晶得到13.5g阿德福韦双环醇单酯，mp144-146℃

例9制备阿德福韦双环醇双酯.葡萄糖醛酸盐

将10g阿德福韦二双环醇酯酯、18ml乙醇，≤35℃搅拌至溶解，加入17g甘草酸+10ml乙醇溶液，搅拌30分钟慢慢加入100ml乙醚，搅拌过夜，有固体析出，过滤，室温真空干燥得白色晶体，mp124.5-126.5℃为阿德福韦双环醇双酯的葡萄糖醛酸盐。

例10制备阿德福韦双环醇盐酸盐

将10g阿德福韦双环醇双酯、20ml乙醇，≤50℃搅拌至溶解，加入10ml 10％盐酸乙醇溶液，搅拌30分钟慢慢加入100ml乙醚，搅拌过夜，有固体析出，过滤，室温真空干燥得白色晶体，mp154-156.5℃。

例11制备阿德福韦双环醇富马酸盐

将10g阿德福韦双环醇双酯、20ml乙醇，≤50℃搅拌至溶解，加入10g富马酸溶解于10ml乙醇溶液，搅拌30分钟慢慢加入100ml乙醚，搅拌过夜，有固体析出，过滤，室温真空干燥得白色晶体，mp142-144℃。

例12制备阿德福韦双环醇双酯制剂：20mg处方

阿德福韦双环醇双酯    20g

乳糖                  25g

微晶纤维素            20.5

交联羟甲基纤维素钠    2.5g

硬脂酸镁              1g

微分硅胶              1g

制成1000片。

Claims (10)

1、一种具抗病毒活性通式(I)化合物：

        (I)其中R1                                      (II)R2为氢或R1。

2、依照权利要求1所述的化合物，其特征在于包括R2为H的单酯或R2为R1的二酯。

3、依照权利要求1所述的化合物，其特征在于所说的通式(I)化合物包括它以盐的形式存在的通式(I)化合物，所说的盐包括(I)式化合物无机酸盐、有机酸盐以及含有酸性基团的保肝护肝类药的的盐。

4、依照权利要求3所述的化合物，其特征在于所说的无机酸盐它选自盐酸盐、硫酸盐。

5、依照权利要求3所述的化合物，其特征在于所说的有机酸盐它选自富马酸盐、马来酸盐、对甲基苯磺酸盐。

6、依照权利要求3所述的化合物，其特征在于所说的含有酸性基团的保肝护肝类药物的盐，它选自甘草酸盐、葡萄糖醛酸盐、齐墩果酸盐。

7、依照权利要求1所述的通式(I)化合物的制备方法，该方法包括：

(A)将通式(III)的化合物：

与卤酰化剂反应得到通式(IV)的膦酰卤化合物：

通式(IV)的膦酰卤化合物，再与式(V)的双环醇进行酯化反应，

反应生成(VI)式的双环醇二酯化合物；或(VII)式的双环醇单酯化合物；

(B)通式(II)的化合物在催化剂存在下与式(V)的双环醇反应得到(VI)式的双环醇二酯化合物，或(VII)式的双环醇单酯的化合物。

8、依照权利要求7所述的制备方法，其特征在于方法(A)所说的卤酰化剂，它选自二氯亚砜或五氯化磷中的一种。

9、依照权利要求7所述的制备方法，其特征在于方法(B)中所说的催化剂，它选自盐酸，硫酸，氢溴酸等酸催化剂中的一种。

10、依照权利要求1所述的化合物，其特征在于以治疗上的有效量用于制备治疗抗肝炎病毒的药物组合物，其中包含有治疗有效量的式(I)化合物的活性组分，以及药学上可以接受的载体。