CN101066981A - 非环核苷膦酸酯类化合物及其组合物、制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一类如下通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物及其在药学上可接受的无机或有机盐，以及包含通式(I)化合物的组合物。本发明还提供该类化合物的制备方法及通式(I)化合物作为活性物质用于治疗病毒感染性疾病，特别是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病的用途。
Description
技术领域
本发明属于药物学领域，涉及药物合成和药理学领域，更具体而言，涉及含有氨基酸基团的非环核苷膦酸酯类化合物及其组合物、制备方法和在制备抗病毒药物中的用途。
背景技术
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是一个全球性的健康问题。据世界卫生组织估计，目前全世界大约有3.5亿HBV携带者，仅中国就有1.2亿HBV携带者。HBV慢性感染可引起慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)、肝硬化(liver cirrhosis)和原发性肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)等相关疾病。目前治疗乙型肝炎的主要药物为干扰素和核苷类化合物。α-干扰素联合利巴韦林不仅疗效有限而且不良反应较多，因此核苷类化合物是近年来乙肝抗病毒药物研究的主要领域[Current Medicinal Chemistry，2003，10，1825；Expert Opinion on Investigatinal Drugs 2003，12，1269；Current DrugTargets-Infections Disorders 2005，5，307]。
核苷类抗病毒药物分为核苷类似物和非环核苷膦酸酯。非环核苷膦酸酯类似物具有广谱的抗DNA病毒活性，该类化合物的特点是结构中具有稳定的膦酰基甲基醚结构，其O-C-P键连接使非环核苷膦酸酯具有很高的酶学及化学稳定性。和核苷类似物相比，由于非环核苷膦酸酯结构中具有膦酸酯部分，能有效地绕开病毒编码激酶催化的初次磷酸化过程，因而对于不能编码胸腺嘧啶激酶或胸腺嘧啶激酶水平较低的病毒能产生较好的抑制效果。目前上市的非环核苷膦酸酯类抗病毒药物有西多福韦、阿德福韦酯以及替诺福韦酯三种药物，其中阿德福韦酯是继拉米夫定后上市的第二个小分子抗HBV药物，而且对拉米夫定耐受的变异乙肝病毒(YMDD)有很强的活性(Expert Opinionon Pharmacotherapy 2004，5(11)：2361-7.)。但非环核苷膦酸酯类药物普遍存在化学性质不稳定，毒性比较大，口服生物利用度低等缺点。
为了增加该类药物的代谢稳定性，延长作用时间，增加药物生物利用度，降低药物毒性，本发明提供一类新型非环核苷膦酸酯类化合物及其合成方法和用途。
发明内容
本发明的一个目的是提供下面通式(I)表示的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物。
本发明的另一个目的是提供含有通式(I)所示化合物中的一种或多种为主要活性成分的药物组合物。
本发明的又一个目的是提供通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物的制备方法。
本发明的还一目的是提供含有通式(I)所示化合物为主要活性成分的药物组合物的制备方法。
本发明的再一个目的是提供通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，以及含有式(I)所示化合物为主要活性成分的药物组合物在制备治疗病毒感染性疾病特别是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病的药物中的应用。
下面对本发明进行具体的说明。
本发明提供如下通式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物：
通式(I)中：
R1代表氢、氯、氟、氨基、羟基、直链或支链或环状C1-C6的烷基氨基(例如，环丙基氨基)、直链或支链C1-C6的烷氧基(例如，甲氧基、乙氧基等)、取代芳香基氧基或者取代芳香基硫基(例如，对甲氧苯硫基等)；
R2代表氢、氨基或者直链或支链C1-C6的烷基氨基；
R5代表氢、环丙基或者直链或支链C1-C6的烷基(例如，甲基等)；
R3和R4可以相同或不同，分别独立为苯基、(IIa)或者(IIb)，
式中，
R6和R8彼此独立地代表氢、直链或支链C1-C6烷基、三氟乙基或者苄基；R7代表氢、苄基、直链或支链C1-C6烷基(例如，甲基、异丙基、3-甲基丙基等)或者天然氨基酸的侧链；
n为1或2；
或者，
当R3代表苯基，R4代表下式(IIc)：
式中，
R7、n定义如上。
本发明化合物存在一个或多个不对称碳原子或磷原子，因此通式(I)包括单一旋光体，单一对映体，单一非对映体和非对映体混合物和外消旋体混合物。
R7可以是各种天然氨基酸或非天然氨基酸的侧链，上述氨基酸的构型可以是L-型或D-型。
“药学上可接受的无机或有机盐”具体地可列举本发明化合物与酸形成的盐，适合成盐的酸为盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、或磷酸等无机酸；本发明化合物可与甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸、或苯磺酸等有机酸或者天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸成盐；或与碱形成的盐，如钠盐、钾盐、钙盐、或铝盐等无机碱的盐，铵盐、甲胺盐、乙胺盐、乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成的盐。
对于上述定义的C1-C6的烷基、C1-C6的烷氧基，其中的烷基可以是C1-C6的直链、支链或环烷基，具体为甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、环丁基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、2-甲基丙基、己基、异己基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基丁基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基或1-乙基-2-甲基丙基。这些基团中，优选为甲基、乙基、丙基、环丙基、异丙基、丁基等碳原子数为1-4个的烷基。
本发明的通式(I)所示的化合物中具有代表性的化合物结构式如下：
| 化合物序号 | n | R7 |
| 1 | 2 | 3-甲基丙基 |
| 2 | 2 | 苄基 |
| 3 | 2 | 异丙基 |
| 4 | 1 | 3-甲基丙基 |
| 5 | 1 | 苄基 |
| 6 | 1 | 异丙基 |
/表示游离碱。
| 化合物序号 | R1 | R2 | R7 | R8 |
| 30 | NH2 | H | H | CH3 |
| 31 | NH2 | H | H | Et |
| 32 | NH2 | H | CH(CH3)2 | CH3 |
| 33 | NH2 | H | CH(CH3)(CH2CH3) | CH3 |
| 34 | NH2 | H | CH3 | CH3 |
| 35 | NH2 | H | CH2Ph | CH3 |
下面具体地描述本发明通式(I)结构化合物的制备方法，但这些具体方法不对本发明构成任何限制。
本发明通式(I)结构化合物可通过如下的方法制得，因此，本发明的另一目的是提供具有上述通式(I)结构化合物及其盐的制备方法，然而该方法的条件，例如反应物、溶剂、碱、所用化合物的量、反应温度、反应所需时间等不限于下面的解释。本发明化合物还可以任选将在本说明书中描述的或本领域已知的各种合成方法组合起来而方便的制得，这样的组合可由本发明所属领域的技术人员容易的进行。
本发明通式(I)化合物的制备方法包括：
方法一：
(1)N-叔丁氧羰基-L-氨基酸与2-溴乙醇或氯甲基氯磺酸酯反应生成(IIIa)化合物；
其中R7和n定义如前，X为溴或氯，R9为叔丁氧羰基；
(2)(IIIa)化合物与9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤(PMEA)单苯基酯反应生成膦酸酯；上述膦酸酯化合物在氯化氢饱和的1，4-二氧六环或乙酰氯/甲醇存在下脱去保护基生成(Ia)化合物；
或者，
方法二：
(1)L-氨基酸酯与氯甲酸氯甲酯反应生成(IIIb)化合物，或者L-氨基酸酯与2-溴乙基氯甲酸酯反应生成(IIIc)化合物；
其中R6、R7、R8和n定义如前，X为溴或氯；
(2)在碱存在下，化合物(IV)
与(IIIb)化合物反应生成下式(Ib)化合物，或者化合物(IV)和(IIIc)化合物反应生成(Ic)化合物；
其中R1、R2、R5、R6、R7、R8、n定义如前，
适合的碱为三乙胺，N，N′-二环己基-4-吗啉基-脒(DCMC)，1，8-二氮杂双环[5，4，0]十一烷-7-烯(DBU)，N，N-二甲氨基吡啶(DMAP)，N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)，吗啉，N-甲基吗啉，碳酸铯，碳酸钾，碳酸氢钠，碳酸氢钾，氨基钠等，其中优选的碱为DBU、DIEA、DCMC和三乙胺等有机碱。
而后根据需要，通过与相应的酸或碱反应可以将式(I)化合物制备成相应的药学上可接受的盐；按通常方法，式(I)化合物用水或含水溶剂重结晶，可以制备成其水合物、溶剂合物。
下面更详细地描述本发明化合物的制备方法：
对于方法一，本发明式(I)化合物可按如下流程I制备：
流程I
a.DBU或三乙胺，DMF；b.氯化氢饱和的1，4二氧六环或乙酰氯/甲醇。
其中R7和n定义如前，R9为叔丁氧羰基。
(1)9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯[J.Med.Chem.1994，37，12]和(IIIa)化合物[Bio.& Med.Chem.Lett.2007，17，465]在极性非质子溶剂中，有机碱作用下，于-10～80℃反应0.5～72小时，生成叔丁氧羰基保护的膦酸酯。最佳反应条件为在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，以三乙胺为碱在50～70℃反应2～16小时。
(2)膦酸酯在极性或非极性溶剂中，在氯化氢饱和的1，4-二氧六环或乙酰氯/甲醇存在下室温脱去保护基得到式(Ia)化合物。
(3)根据需要式(I)化合物可制备成相应的药学上可接受的盐。
对于方法二，本发明式(I)化合物可按如下流程II制备：
流程II
a.氯甲酸氯甲酯或2-溴乙基氯甲酸酯，DMAP，DIEA：b.DBU或三乙胺，DMF；
其中，R1、R2、R5、R6、R7、R8、X和n定义如前。
按照文献方法[J.Org.Chem.1982，47(10)：1962]可以制得原料L-氨基酸酯，按照[J.Med.Chem.2004，47(11)：2864；J.Med.Chem.1999，42(12)：2064]可以制得式(IV)的化合物。
(1)L-氨基酸酯与氯甲酸氯甲酯或2-溴乙基氯甲酸酯在极性或非极性溶剂中，碱性条件下，-10～100℃反应1～24小时得到卤素取代的产物(IIIb)或(IIIc)。最佳反应条件为在二氯甲烷中，以DMAP和DIEA为碱在室温反应2小时。
(2)化合物(IIIb)或(IIIc)与化合物(IV)在极性非质子溶剂中，有机碱作用下，于0～100℃反应0.5～72小时，生成含有氨基酸基团的膦酸双酯产物(Ib)或(Ic)。最佳反应条件为以DMF或NMP(1-甲基-2-吡咯烷酮)为溶剂，DBU为碱在50～80℃反应2～16小时；或三乙胺为碱50～60℃反应1～3小时；或以DIEA为碱，室温反应72小时。
(3)根据需要式(I)化合物可制备成相应的药学上可接受的盐。
流程III
其中，R1、R2、R5、R6和n定义如前。
化合物(Ib)与富马酸可以在异丙醇，二氯甲烷，乙腈等溶剂中在0-200℃反应生成化合物(Ib)的富马酸盐。最佳反应条件为以乙腈作溶剂加热回流2小时。
本发明化合物的药理上可接受的盐，具体地可列举与盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸的盐；与甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸等有机酸和天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸成盐；或与碱形成的盐，如钠盐、钾盐、钙盐、铝盐等无机碱的盐，铵盐，甲胺盐，乙胺盐，乙醇胺盐等，或与赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸等碱性氨基酸形成的盐。
本发明提供的式(I)所示的非环核苷膦酸酯类化合物及其药学上可接受的盐具有抗病毒活性，因此可在制备治疗病毒感染性疾病特别是乙型肝炎病毒HBV或HIV病毒引起的感染性疾病的药物中的应用。
本发明所要求保护的含有氨基酸基团的非环核苷膦酸酯类化合物及其药学上可接受的盐具有治疗病毒感染性疾病特别是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病的功能。
本发明所要求保护的含有氨基酸基团的非环核苷类化合物及其药学上可接受的盐具有与现有技术中核苷类小分子抗HBV药物阿德福韦相似或更强的治疗病毒感染性疾病的活性，所以这些化合物可用于制备新型的治疗病毒感染性疾病，特别是HBV和HIV病毒引起的感染性疾病的药物。
具体实施方式
在下述制备例和实施例中更具体地解释本发明。然而，应当理解，这些制备例和实施例是为了举例说明本发明，而并不是以任何方式限制本发明的范围。所有制备例和实施例中，熔点用MEL-TEMP熔点仪测定，温度计未校正；1H-NMR用Varian Mercury 400核磁共振仪记录，化学位移以δ(ppm)表示；分离用硅胶未说明均为200-300目。洗脱液的配比均为体积比。
式(IIIb)和(IIIc)化合物的制备
制备例1 N-(氯甲氧基羰基)-L-脯氨酸甲基酯的制备
在-5～0℃，N2保护下，将脯氨酸甲酯盐酸盐(5.80g，0.035mol)，DIEA(11.3g，0.088mol)，DMAP(0.086g，0.70mmol)与二氯甲烷(20mL)的混合物滴加到氯甲酸氯甲酯(4.70g，0.036mol)与二氯甲烷(50mL)混合液中，滴毕，缓慢升至室温后继续反应2小时，加入乙酸乙酯(60mL)稀释，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(90mL×3)，1当量的盐酸(90mL×3)，饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残留物柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1)得到标题产品(6.64g，85.6％)。1H NMR(CDCl3)：5.65-5.84(m，2H)，4.43(m，1H)，3.75(s，3H)，3.60(m，2H)，2.24(m，1H)，2.03(m，3H)。
EI-MS(m/z)：221(6，M+)，128(20)，162(100)。
下表所列的化合物可以由各种脯氨酸酯或脯氨酸酯的盐酸盐为原料按照制备例1相同的步骤制备得到。
制备例2-8
| 制备例 | R6 | 1H NMR(CDCl3，ppm) | MS(EI，m/e) | 产率 |
| 2 | Et | 5.63-5.82(m，2H)，4.40(m，1H)，4.23(q，J＝7.19Hz，2H)，3.64(m，1H)，3.53(m，1H)，2.19(m，1H)，1.91(m，1H)，1.81(m，2H)，1.30(t，J＝7.19Hz，3H) | 235 | 75.4％ |
| 3 | iPr | 5.68-5.88(m，2H)，5.01-5.09(m，1H)，4.30-4.37(m，1H)，3.47-3.66(m，2H)，2.18-2.28(m，1H)，1.89-2.06(m，3H)，1.32(m，6H) | 249 | 73.0％ |
| 4 | tBu | 5.66-5.89(m，2H)，4.19-4.29(m，1H)，3.49-3.62(m，2H)，2.20-2.22(m，1H)，1.88-2.20(m，3H)，1.45(s，9H) | 263 | 92.7％ |
| 5 | Bn | 7.36(m，5H)，5.53-5.90(m，2H)，5.20(m，2H)，4.45(m，1H)，3.45-3.65(m，2H)，2.30(m，1H)，1.85-2.10(m，3H) | 297 | 80.4％ |
| 6 | CH2CF3 | 5.62-5.87(m，2H)，4.40-4.68(m，3H)，3.42-3.70(m，2H)，2.22-2.39(m，1H)，1.89-2.17(m，3H) | 289 | 33.8％ |
| 7 | CH2CH2CH3 | 5.63-5.84(m，2H)，4.33-4.44(m，1H)，4.02-4.17(m，2H)，3.43-3.66(m，2H)，2.10-2.27(m，1H)，1.85-2.05(m，3H)，1.58-1.70(m，2H)，0.95(t，J＝7.62Hz，3H)。 | 249 | 76.3％ |
| 8 | CH2CH(CH3)2 | 5.68-5.89(m，2H)，4.36-4.44(m，1H)，3.88-3.94(m，2H)，3.52-3.62(m，2H)，2.25-2.28(m，1H)，1.90-2.04(m，4H)，0.94(d，J＝6.74Hz，6H)。 | 263 | 60.6％ |
制备例9 2-溴乙基氯甲酸酯的制备
三乙胺(16.2g，0.16mol)与二氯甲烷(70mL)混合后，在0℃下滴加至2-溴乙醇(20.0g，0.160mol)、固体光气(15.8g，0.053mol)和干燥的二氯甲烷(320mL)混合液中，在0℃反应2小时后再升至室温反应2小时，过滤，二氯甲烷(150mL)提取，水(80mL×2)洗，饱和氯化钠液洗后无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩得到标题产物(17.1g，57.1％)。1H NMR(CDCl3)：4.60(t，J＝6.31Hz，2H)，3.56(t，J＝6.31Hz，2H)。
制备例10N-(2-溴乙氧羰基)-L-脯氨酸甲基酯的制备
在-5～0℃，N2保护下将脯氨酸甲酯盐酸盐(5.00g，0.030mol)，DIEA(9.70g，0.075mol)，DMAP(0.073g，0.60mmol)与二氯甲烷(10mL)混合后滴加入2-溴乙基氯甲酸酯(5.90g，0.032mol)与二氯甲烷(60mL)的混合液中，滴毕，缓慢升至室温后再反应2小时后加入乙酸乙酯(100mL)稀释，饱和碳酸氢钠水溶液(100mL×3)、1当量盐酸(100mL×3)、饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残留物柱层析(石油醚∶乙酸乙酯＝3.5∶1)得到标题产物(6.30g，75.0％)。1H NMR(CDCl3)：4.30-4.45(m，3H)，3.74(s，3H)，3.44-3.55(m，4H)，2.18-2.25(m，1H)，1.89-2.00(m，3H)。
制备例11N-(2-溴乙氧羰基)-L-脯氨酸乙基酯的制备
按照制备例10的操作，以脯氨酸乙酯盐酸盐(2.73g，0.019mol)和2-溴乙基氯甲酸酯(3.76g，0.020mol)为原料反应得到标题产物(2.51g，44.7％)。1H NMR(CDCl3)：4.32-4.41(m，3H)，4.19(q，J＝7.18Hz，2H)，3.61(m，1H)，3.43-3.55(m，3H)，2.23(m，1H)，1.87-2.04(m，3H)，1.26(t，J＝7.18Hz，3H)。EI-MS(m/z)：293(3，M+)，107(32)，148(18)，220(100)。
下表所列的化合物可由制备例9所得化合物和各种氨基酸酯或氨基酸酯的盐酸盐为原料按照制备例10相同的步骤制备得到。
制备例12-17
| 制备例 | 取代基 | 1H NMR(CDCl3，ppm) | MS(EI，m/e) | 产率 |
| 12 | R7＝HR8＝CH3 | 5.26(brs，1H)，4.40(t，J＝6.16Hz，2H)，4.00(d，J＝5.42Hz，2H)，3.77(s，3H)，3.51(t，J＝6.16Hz，2H) | 240 | 61.9％ |
| 13 | R7＝HR8＝Et | 5.28(brs，1H)，4.41(t，J＝6.10Hz，2H)，4.24(q，J＝7.15Hz，2H)，3.97(d，J＝5.68Hz，2H)，3.52(t，J＝6.10Hz，2H)，1.29(t，J＝7.15Hz，3H) | 254 | 64.5％ |
| 14 | R7＝CH3R8＝CH3 | 5.34(brs，1H)，4.38(t，J＝6.01Hz，2H)，4.34(m，1H)，3.76(s，3H)，3.50(t，J＝6.01Hz，2H)，1.39(d，J＝5.87Hz，3H) | 255 | 70.8％ |
| 15 | R7＝CH(CH3)2R8＝CH3 | 5.30(brs，1H)，4.38(t，J＝6.15Hz，2H)，4.28(m，1H)，3.75(s，3H)，3.50(t，J＝6.15Hz，2H)，2.15(m，1H)，0.96(d，J＝6.89Hz，3H)，0.89(d，J＝6.89Hz，3H) | 281 | 70.7％ |
| 16 | R7＝CH(CH3)(CH2CH3)R8＝CH3 | 5.30(brs，1H)，4.39(t，J＝6.16Hz，2H)，4.33(m，1H)，3.73(s，3H)，3.52(t，J＝6.16Hz，2H)，1.89(m，1H)，1.42(m，1H)，1.15(m，1H)，0.84-0.94(m，6H) | 295 | 71.7％ |
| 17 | R7＝CH2PhR8＝CH3 | 7.13-7.33(m，5H)，5.28(brs，1H)，4.62(m，1H)，4.33(t，J＝6.16Hz，2H)，3.72(s，3H)，3.46(t，J＝6.16Hz，2H)，3.11(m，2H) | 329 | 89.4％ |
式(Ia)化合物的制备：
制备例18(2S)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤，[单苯基，单(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基戊酰氧基乙基)]酯的制备
9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯(1.00g，2.90mmol)，(S)-叔丁基-1-[(2-溴乙氧基)羰基]-2-甲基丁基氨基甲酸酯(1.93g，5.70mmol)，DCMC(0.99g，3.40mmol)与DMF(20mL)混合后，加热至30℃，体系全溶后加入DBU(2滴)后升温至80℃反应4小时后加水，乙酸乙酯提取，有机层用1％柠檬酸洗涤两次，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸镁干燥。过滤，减压浓缩，残留物柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝25∶1)得到标题产物(0.35g，20.2％)。
1H NMR(CDCl3)：8.33(s，1H)，8.09(s，1H)，7.32(m，2H)，7.09-7.18(m，3H)，5.92(brs，2H)，5.30-5.40(m，1H)，4.41-4.43(m，4H)，4.30-4.34(m，4H)，3.93-3.96(m，3H)，1.84(m，1H)，1.43(s，9H)，1.40(m，1H)，1.15(m，1H)，0.83-0.91(m，6H)。EI-MS(m/z)：606(12，M+)，163(100)。
制备例19(2S)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤，[单苯基，单(2-叔丁氧羰基氨基-3-苯基丙酰氧基乙基)]酯的制备
按照制备例18的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯(0.51g，1.40mmol)与(S)-叔丁基-1-[(2-溴乙氧基)羰基]-2-苯乙基氨基甲酸酯(1.86g，5.10mmol)反应生成标题产物(0.26g，27.8％)。1H NMR(CDCl3)：8.32(s，1H)，7.93(s，1H)，7.09-7.31(m，10H)，5.92(brs，2H)，5.54(m，1H)，4.82(m，1H)，4.26-4.45(m，6H)，3.93-3.96(m，4H)，3.02-3.16(m，2H)，1.40(s，9H).EI-MS(m/z)：640(6，M+)，100(100)。
制备例20(2S)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤，[单苯基，单(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基丁酰氧基乙基)]酯的制备
按照制备例18的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯(0.51g，1.40mmol)与(S)-叔丁基-1-[(2-溴乙氧基)羰基]-2-甲基丙基氨基甲酸酯反应(1.85g，5.70mmol)生成标题产物(0.13g，15.4％。)。1H NMR(CDCl3)：8.34(s，1H)，7.96(s，1H)，7.32(m，2H)，7.12-7.21(m，3H)，5.88(brs，2H)，5.30-5.40(m，1H)，4.29-4.42(m，6H)，3.93-3.96(m，5H)，2.08-2.14(m，1H)，1.43(s，9H)，0.92(d，J＝6.89Hz，3H)，0.85(d，J＝6.89Hz，3H)。EI-MS(m/z)：592(10，M+)，57(100)。
制备例21(2S)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤，[单苯基，单(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基戊酰氧基甲氧基)]酯的制备
N2保护下9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯(0.50g，1.40mmol)，DMF(15mL)与三乙胺(1.44g，0.014mol)混合后室温搅拌使全部溶解，加入(S)-叔丁基-1-[(2-氯甲氧基)羰基]-2-甲基丁基氨基甲酸酯(1.00g，3.60mmol)和DMF(5mL)，升温至50℃反应3～4小时后停止搅拌，加入1％柠檬酸(20mL)和乙酸乙酯(20mL)，分出有机相，水相用乙酸乙酯(20×2mL)萃取，合并乙酸乙酯层，用1％柠檬酸(20×2mL)，水及饱和食盐水洗涤，无水硫酸镁干燥，过滤，滤液减压浓缩，残余物柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝25∶1)得到标题产物(48mg，5.6％)。1H NMR(CDCl3)：8.35(s，1H)，7.94(s，1H)，7.32(m，2H)，7.12-7.19(m，3H)，5.76(brs，2H)，5.74(m，2H)，5.31(d，J＝8.08Hz，1H)，4.22-4.42(m，3H)，3.96-3.99(m，4H)，1.84(m，1H)，1.44(s，9H)，1.26(m，1H)，1.10(m，1H)，0.82-0.90(m，6H)。EI-MS(m/z)：592(4，M+)，94(100)。
制备例22(2S)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤，[单苯基，单(2-叔丁氧羰基氨基-3-苯基丙酰氧基甲氧基)]酯的制备
按照制备例21的操作，9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯(0.50g，1.40mmol)与(S)-叔丁基-1-[(2-氯甲氧基)羰基]-2-苯乙基氨基甲酸酯(1.12g，3.60mmol)反应生成标题产物(0.10g，11.1％)。1H NMR(CDCl3)：8.31(s，1H)，7.93(s，1H)，7.12-7.33(m，10H)，6.20(brs，2H)，5.68-576(m，2H)，4.60(m，1H)，4.42(t，J＝4.76Hz，2H)，3.92-3.98(m，4H)，3.10(m，2H)，1.43(s，9H)。EI-MS(m/z)：626(2，M+)，56(100)。
制备例23(2S)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤，[单苯基，单(2-叔丁氧羰基氨基-3-甲基丁酰氧基甲氧基)]酯的制备
按照制备例21的操作，以9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯(0.50g，1.40mmol)与(S)-叔丁基-1-[(2-氯甲氧基)羰基]-2-甲基丙基氨基甲酸酯(1.00g，3.60mmol)反应生成标题产物(0.13g，15.7％)。1H NMR(CDCl3)：8.34(s，1H)，7.95(s，1H)，7.32(m，2H)，7.19(t，J＝6.77Hz，1H)，7.12(d，J＝8.42Hz，2H)，5.84(brs，2H)，5.66-5.78(m，2H)，5.30(m，1H)，4.41(t，J＝4.76Hz，2H)，4.34(m，1H)，3.95-3.98(m，4H)，2.08-2.14(m，1H)，1.43(s，9H)，0.92(d，J＝6.89Hz，3H)，0.85(d，J＝6.89Hz，3H)。EI-MS(m/z)：578(11，M+)，57(100)。
实施例1(2S)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤，[单苯基，单(2-氨基-3-甲基戊酰氧基乙基)]酯，二盐酸盐(化合物1)的制备
制备例18制得的化合物(50mg，0.08mmol)溶于分子筛干燥的1，4-二氧六烷(1mL)，磁力搅拌，冰水浴下针筒注入15％氯化氢的1，4-二氧六烷溶液(0.1mL)，保温反应1小时后室温反应至原料完全消失。静置30分钟，将体系中上清液吸除，用乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷洗涤后加入蒸馏水冷冻干燥，得到标题产物(30mg，65.2％)。1H NMR(CD3OD)：8.38(s，1H)，8.36(s，1H)，7.36(t，J＝7.34Hz，2H)，7.23(t，J＝7.70Hz，1H)，7.09(d，J＝7.70Hz，2H)，4.55(t，J＝4.60Hz，2H)，4.38-4.46(m，4H)，4.11(d，J＝7.70Hz，2H)，4.05(t，J＝4.80Hz，2H)，4.04(m，1H)，1.96-2.02(m，1H)，1.50and 1.30(m，2H)，0.92-0.98(m，6H)。EI-MS(m/z)：506.0(12，M+)，157(100)。
下表所列的化合物2-6可由制备例19-23所得化合物为原料按照实施例1相同的步骤制备得到。
实施例2-6
| 实施例号 | 化合物 | R | 1H NMR(ppm，CD3OD) | MS(ESI，m/e)(M++H) | 产率 |
实施例7(2S，2′S)-9-{2-[O，O′-双[[2-(甲氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}腺嘌呤富马酸盐(化合物7)的制备
N2保护下，PMEA(0.40g，1.46mmol)，DMF(6mL)和DBU(0.44g，2.92mmol)，混合后升温至45℃，加入上述制备例1生成的化合物(1.30g，5.86mmol)和DMF(5mL)的混合溶液，升温于60℃反应2.5小时，加入异丙醇(30mL)，二氯甲烷(30mL)，1％柠檬酸，分层，有机相用1％柠檬酸洗涤两次后饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)得到(2S，2′S)-9-{2-[O，O′-双[[2-(甲氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}腺嘌呤(0.28g，0.44mmol)，加入乙腈(22mL)和富马酸(0.051g，0.44mmol)，氮气保护下回流2小时后浓缩至干，加入乙酸乙酯重结晶，得到化合物7(208mg，18.8％)。
1H NMR(CD3OD)：8.19(s，1H)，8.15(s，1H)，6.71(s，2H)，5.48-5.61(m，4H)，4.41(t，J＝4.77Hz，2H)，4.27-4.39(m，2H)，3.94(t，J＝4.77Hz，2H)，3.92(d，J＝7.69Hz，2H)，3.68(s，6H)，3.41-3.51(m，4H)，2.18-2.24(m，2H)，1.84-1.96(m，6H)。MS(ESI)m/z(％)：644.0(MH+，100)。M.p.：96-98℃。
下表所列的化合物8-14可由制备例2-8所得化合物与PMEA按照实施例7相同的步骤制备得到。
实施例8-14
| 5.58-5.73(m，4H)，4.96-5.00(m，2H)，4.44(t，J＝4.98Hz，2H)，4.30(m，2H)，3.96-3.99(m，4H)，3.44-3.58(m，4H)，2.13-2.20(m，2H)，1.86-1.96(m，6H)，1.24(m，12H). | |||||
| 10 | 10 | tBu | 8.22(s，1H)，8.18(s，1H)，6.75(s，2H)，5.52-5.69(m，4H)，4.44(t，J＝4.98Hz，2H)，4.19-4.25(m，2H)，3.96-3.98(m，4H)，3.45-3.50(m，4H)，2.17-2.28(m，2H)，1.90-2.00(m，6H)，1.42(s，18H). | 728.2 | 5.97％ |
| 11 | 11 | Bn | 8.20(s，1H)，8.13(s，1H)，7.31(m，10H)，6.75(s，2H)，5.42-5.68(m，4H)，5.13(s，4H)，4.35-4.43(m，4H)，3.86-3.92(m，4H)，3.30-3.49(m，4H)，2.24-2.26(m，2H)，1.88-2.00(m，6H). | 796.1 | 16.0％ |
| 12 | 12 | CH2CF3 | 8.22(s，1H)，8.17(s，1H)，6.75(s，2H)，5.51-5.66(m，4H)，4.55-4.72(m，4H)，4.38-4.44(m，4H)，3.95-3.99(m，4H)，3.46-3.55(m，4H)，2.30-2.38(m，2H)，1.93-2.06(m，6H). | 780.1 | 12.7％ |
| 13 | 13 | CH2CH2CH3 | 8.22(s，1H)，8.18(s，1H)，6.75(s，2H)，5.54-5.66(m，4H)，4.45(t，J＝4.69Hz，2H)，4.33-4.40(m，2H)，4.04-4.12(m，4H)，3.87-4.02(m，4H)，3.42-3.58(m，4H)，2.10-2.25(m，2H)，1.83-2.06(m，6H)，1.58-1.67(m，4H)，0.92(t，J＝7.35Hz，6H). | 700.2 | 3.11％ |
| 14 | 14 | CH2CH(CH3)2 | 8.22(s，1H)，8.19(s，1H)，6.76(s，2H)，5.51-5.66(m，4H)，4.33-4.50(m，4H)，3.83-4.01(m，8H)，3.42-3.58(m，4H)，2.20-2.37(m，2H)，1.83-2.06(m，8H)，0.92(d，J＝6.78Hz，12H). | 728.2 | 7.43％ |
实施例15(2S，2′S)-9-{2-[O，O′-双[[2-(甲氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]乙基]膦酰基甲氧基]乙基}腺嘌呤(化合物15)的制备
N2保护下，PMEA(0.20g，0.73mmol)，DMF(5mL)，DBU(0.22g，1.46mmol)，与上述制备例10生成的化合物(0.82g，2.93mmol)混合后，升温于80℃反应16小时，浓缩，加入水(30mL)，用二氯甲烷(10mL×3)提取，水(10mL×3)洗涤，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)，得到标题产物(196mg，40.0％)。1H NMR(CDCl3)：8.32(s，1H)，8.02(s，1H)，6.23(brs，2H)，4.40-4.44(m，2H)，4.19-1.38(m，10H)，3.96(t，J＝5.13Hz，2H)，3.84(m，2H)，3.72(s，6H)，3.46-3.62(m，4H)，2.17-2.24(m，2H)，1.90-2.02(m，6H)。MS(ESI)m/z(％)：672.3(MH+)。
实施例16(2S，2′S)-9-{2-[O，O′-双[[2-(乙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]乙基]膦酰基甲氧基]乙基}腺嘌呤(化合物16)的制备
按照实施例15的操作，以PMEA(0.20g，0.73mmol)和上述制备例11生成的化合物(0.861g，2.93mmol)为原料反应生成标题产物(145mg，28.4％)。
1H NMR(CDCl3)：8.30(s，1H)，7.94(s，1H)，6.03(brs，2H)，4.38(t，J＝4.69Hz，2H)，4.12-4.32(m，14H)，3.92(t，J＝4.54Hz，2H)，3.81(m，2H)，3.42-3.57(m，4H)，2.15-2.24(m，2H)，1.86-1.98(m，6H)，1.21(t，J＝6.30Hz，6H)。MS(ESI)m/z(％)：700.2(MH+)。
实施例17(2S，2′S)-2-氨基-6-环丙胺基-9-{2-[O，O′-双[[2-(乙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤富马酸盐(化合物18)的制备
N2保护下，2-氨基-6-环丙氨基-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘌呤(0.30g，0.92mmol)，DMF(5mL)和三乙胺(0.50g，4.58mmol)混合，升温微溶后加入上述制备例2生成的化合物(0.86g，3.66mmol)和DMF(5mL)的混合溶液，升温于55℃反应2小时后，加入异丙醇(30mL)，二氯甲烷(40mL)，1％柠檬酸(50mL)，分层，有机相用1％柠檬酸(10mL×3)洗涤，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝20∶1)得到(2S，2′S)-2-氨基-6-环丙胺基-9-{2-[O，O′-双[[2-(乙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(41mg，6.1％)。
(2S，2′S)-2-氨基-6-环丙胺基-9-{2-[O，O′-双[[2-(乙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(96.8mg，0.13mmol)，乙腈(5mL)和富马酸(15.5mg，0.13mmol)混合后，氮气保护下回流2小时后趁热抽滤，滤液减压浓缩，残余物加入乙酸乙酯重结晶，得到化合物18(18mg，收率16.2％)。
1H NMR(CD3OD)：7.82(s，1H)，6.74(s，2H)，5.50-5.72(m，4H)，4.31-4.38(m，4H)，4.18(q，J＝7.30Hz，4H)，3.85-4.00(m，4H)，3.24-3.58(m，4H)，2.92(brs，1H)，2.17-2.21(m，2H)，1.86-2.01(m，6H)，1.24(t，J＝7.30Hz，6H)，0.88(m，2H)，0.62(m，2H)。MS(ESI)m/z(％)：727.1(MH+)。
实施例18(2S，2′S)-2-氨基-6-环丙胺基-9-{2-[O，O′-双[[2-(异丙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤富马酸盐(化合物19)的制备
按照实施例17的操作，以2-氨基-6-环丙氨基-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘌呤(0.30g，0.92mmol)和上述制备例3(0.86g，3.66mmol)生成的化合物为原料反应生成(2S，2′S)-2-氨基-6-环丙胺基-9-{2-[O，O′-双[[2-(异丙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(41mg，收率18.8％)。
(2S，2′S)-2-氨基-6-环丙胺基-9-{2-[O，O′-双[[2-(异丙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(150mg，0.20mmol)，乙腈(10mL)和富马酸(23.1mg，0.20mmol)混合后，氮气保护下回流2小时后趁热抽滤，滤液浓缩至干，加入乙酸乙酯重结晶，得到化合物19(62mg，35.8％)。1H NMR(CD3OD)：7.81(s，1H)，6.73(s，2H)，5.54-5.76(m，4H)，4.97-5.00(m，2H)，4.26-4.29(m，4H)，3.99(d，J＝8.01Hz，2H)，3.91(m，2H)，3.44-3.58(m，4H)，2.92(brs，1H)，2.17-2.28(m，2H)，1.90-2.02(m，6H)，1.22(m，12H)，0.87(m，2H)，0.66(m，2H)。MS(ESI)m/z(％)：755.1(MH+)。
实施例19 (2S，2′S)-2-氨基-6-环丙胺基-9-{2-[O，O′-双[[2-(甲氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]乙基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(化合物20)的制备
N2保护下，2-氨基-6-环丙氨基-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘌呤(0.20g，0.61mmol)，DMF(5mL)与DBU(0.19g，1.22mmol)混合，升温微溶后加入上述制备例10生成的化合物(0.67g，2.40mmol)和DMF(5mL)的混合溶液，升温于80℃反应12小时，浓缩，加入水(30mL)，用二氯甲烷(10mL×3)提取，水(10mL×3)洗涤，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析(二氯甲烷∶甲醇＝15∶1)得到标题产物(70mg，16.3％)。1H NMR(CDCl3)：7.59(s，1H)，5.79(brs，1H)，4.81(brs，2H)，4.12-4.41(m，12H)，3.90(t，J＝4.73Hz，2H)，3.78-3.82(m，2H)，3.70(d，J＝5.80Hz，6H)，3.40-3.58(m，4H)，3.00(brs，1H)，2.17-2.28(m，2H)，1.89-2.04(m，6H)，0.85(m，2H)，0.62(m，2H)。MS(ESI)m/z(％)：727.3(MH+)。
实施例20(2S，2′S)-2-氨基-6-(4-甲氧基苯硫基)-9-{2-[O，O′-双[[2-(乙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(化合物21)的制备
N2保护下，2-氨基-6-(4-甲氧苯硫基)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘌呤(0.20g，0.49mmol)，DMF(5mL)和三乙胺(0.25g，2.40mmol)混合，升温微溶后加入上述制备例2生成的化合物(0.46g，1.95mmol)和DMF(5mL)的混合溶液，升温于55℃反应2小时，加入乙酸乙酯(40mL)，1％柠檬酸(50mL)，分层，有机相用1％柠檬酸(10mL×2)洗涤，饱和氯化钠溶液洗，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩，残余物柱层析(乙酸乙酯∶甲醇＝20∶1)得到标题产物(79mg，19.3％)。1H NMR(CDCl3)：7.95(s，1H)，7.46(d，J＝6.90Hz，2H)，6.88(d，J＝6.90Hz，2H)，5.62-5.68(m，4H)，4.83(brs，2H)，4.29-4.32(m，2H)，4.18(t，J＝5.10Hz，2H)，4.12(q，J＝7.20Hz，4H)，3.81-3.86(m，4H)，3.78(s，3H)，3.38-3.57(m，4H)，2.13-2.21(m，2H)，1.86-1.91(m，6H)，1.18(t，J＝7.20Hz，6H)。MS(ESI)m/z(％)：810.2(MH+)。
实施例21(2S，2′S)-2-氨基-6-(4-甲氧基苯硫基)-9-{2-[O，O′-双[[2-(异丙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(化合物22)的制备
按照实施例20的操作，2-氨基-6-(4-甲氧苯硫基)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘌呤(0.20g，0.49mmol)和上述制备例3生成的化合物(0.49g，1.94mmol)反应生成标题产物(98mg，23.3％)。1H NMR(CDCl3)：7.75(s，1H)，7.47(d，J＝8.80Hz，2H)，6.87(d，J＝8.80Hz，2H)，5.44-5.72(m，4H)，4.92-4.97(m，2H)，4.90(brs，2H)，4.25-4.29(m，2H)，4.19(t，J＝4.83Hz，2H)，3.81-3.86(m，4H)，3.75(s，3H)，3.42-3.54(m，4H)，2.08-2.23(m，2H)，1.85-1.93(m，6H)，1.14-1.22(m，12H)。MS(ESI)m/z(％)：838.2(MH+)。
实施例22(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤，双{(S)-[2-(乙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基}酯富马酸盐(化合物23)的制备
按照实施例7的操作，(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤(PMPA)(0.20g，0.70mmol)和上述制备例2生成的化合物(0.66g，2.79mmol)反应生成(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤，双{(S)-[2-(乙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基}酯(100mg，0.14mmol)，再与乙腈(10mL)和富马酸(0.017g，0.14mmol)混合，氮气保护下回流2小时后浓缩至干，加入乙酸乙酯重结晶，得到化合物23(110mg，19.6％)。1H NMR(CD3OD)：8.18(s，1H)，8.11(s，1H)，6.71(s，2H)，5.41-5.56(m，4H)，4.22-4.38(m，3H)，4.12(q，J＝7.03Hz，4H)，3.78-4.02(m，4H)，3.42-3.49(m，4H)，2.17-2.25(m，2H)，1.87-1.96(m，6H)，1.16-1.23(m，9H)。MS(ESI)m/z(％)：686.4(MH+).M.p.83-85℃。
实施例23(R)-9-[2-(膦酰基甲氧基)丙基]腺嘌呤，双{(S)-[2-(异丙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基}酯(化合物24)的制备
按照实施例7的操作，PMPA(0.20g，0.70mmol)和上述制备例3生成的化合物(0.70g，2.79mmol)反应生成(90mg，0.13mmol)再与乙腈(8mL)和富马酸(0.015g，0.13mmol)混合，氮气保护下回流2小时后浓缩至干，加入乙酸乙酯重结晶，得到化合物24(66mg，收率11.5％)。1H NMR(CD3OD)：8.18(s，1H)，8.12(s，1H)，6.71(s，2H)，5.52-5.60(m，4H)，4.88-4.97(m，2H)，4.19-4.33(m，4H)，3.83-4.07(m，2H)，3.75-3.81(m，1H)，3.39-3.48(m，4H)，2.15-2.22(m，2H)，1.86-1.97(m，6H)，1.16-1.22(m，15H)。MS(ESI)m/z(％)：714.3(MH+).M.p.79-81℃。
下表所列的化合物可由PMEA或2-氨基-6-(取代)-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘌呤和制备例12-17所得化合物为原料按照实施例19相同的步骤制备得到。
实施例24-31
| 30 | 37 | R1＝环丙氨基，R2＝氨基，R7＝3-甲基丙基，R8＝甲基 | 7.83(s，1H)，7.17(d，J＝8.80Hz，1H)，6.98(d，J＝8.80Hz，1H)，6.54(brs，1H)，4.86(brs，2H)，4.10-4.33(m，12H)，3.74-3.94(m，4H)，3.72(s，6H)，2.98-3.02(m，1H)，1.75-1.83(m，2H)，1.45(m，2H)，1.15(m，2H)，0.82-0.96(m，12H)，0.80(m，2H)，0.65(m，2H) | 759.1 | 14.5％ |
| 31 | 38 | R1＝对甲氧苯硫酚基，R2＝氨基，R7＝异丙基，R8＝甲基 | 7.87(s，1H)，7.50(d，J＝8.65Hz，2H)，6.92(d，J＝8.80Hz，2H)，6.26 and 6.19(dd，J1＝9.09Hz，J2＝9.08Hz，2H)，4.92(brs，2H)，4.17-4.26(m，12H)，3.84-3.88(m，4H)，3.81(s，3H)，3.80(s，6H)，2.18(m，2H)，0.96(d，J＝6.9Hz，6H)，0.90(d，J＝6.9Hz，6H) | 814.1 | 8.1％ |
实施例32 (2S，2′S)-2-氨基-9-{2-[O，O′-双[[2-(异丙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(化合物26)的制备
按照实施例7条件，2-氨基-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘌呤(0.15g，0.55mmol)和上述制备例3生成的化合物(0.55g，2.20mmol)反应生成化合物26(15mg，3.9％)。1H NMR(CDCl3)：8.66(s，1H)，7.94(s，1H)，5.81(brs，2H)，5.48-5.72(m，4H)，4.94-5.03(m，2H)4.22-4.35(m，4H)，3.83-3.92(m，4H)，3.38-3.58(m，4H)，2.10-2.25(m，2H)，1.83-2.04(m，6H)，1.16-1.23(m，12H)。MS(ESI)m/z(％)：700.2(MH+，100)。
实施例33(2S，2′S)-2-氨基-9-{2-[O，O′-双[[2-(乙氧羰基)吡咯烷基-1-羰氧基]甲基]膦酰基甲氧基]乙基}嘌呤(化合物25)的制备
按照实施例7条件，2-氨基-9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]嘌呤(0.30g，1.10mmol)和上述制备例2生成的化合物(0.78g，3.30mmol)反应生成化合物25(23mg，3.1％)。1H NMR(CDCl3)：8.67(s，1H)，7.99(s，1H)，5.82(brs，2H)，5.48-5.74(m，4H)，4.30-4.38(m，4H)4.10-4.21(m，4H)，3.84-3.99(m，4H)，3.41-3.62(m，4H)，2.08-2.24(m，2H)，1.83-2.04(m，6H)，1.23(t，J＝7.20Hz，6H)。MS(ESI)m/z(％)：672.1(MH+，100)。
抗病毒实验
1、细胞毒性试验
采用四氮唑还原法检测药物对HepG 2215生长的抑制作用。取HepG 2215细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，计数后调整细胞浓度至2×104cell/ml，加入96孔培养板中。置于细胞培养箱中，37℃、5％CO2培养过夜。吸去上清液后加入含有不同浓度药物的DMEM培养基(5％胎牛血清)。作用9天之后，各孔中加入10μl的MTT并继续培养4小时。仔细吸去上清液，每孔加入150μl DMSO，轻轻振荡后，用酶标仪检测570nm处的OD值。
2、细胞药物处理
取HepG 2215细胞一瓶，用胰酶消化后制备成单细胞悬液，调节细胞浓度至2×104cell/ml，加入24孔细胞培养板中(1ml/well)。37℃、5％CO2培养过夜。取出24孔细胞培养板，吸出上清液后依次加入5个5倍稀释浓度的药物，以及阳性对照药物。继续培养，每3天更换含有药物的培养基，并于第9天收集各孔上清液至离心管中-20℃冻存备用。
3、荧光定量PCR反应
血清标本(100μl)置于裂解液(1mmol/L Tris-HCl，pH8.0，10mmol/L NaCl，0.1mmol/L EDTA，0.5％SDS，0.8mg/ml蛋白酶K)中，在37℃孵化5h，然后用酚氯仿和氯仿分别抽提两次，再用乙醇沉淀。溶解在50μl水中以备作PCR扩增。
2μl病毒DNA放入48μl的反应混合物中，包括5mmol/L MgCl2、每种dNTP0.2mmol/L、2.5U的Gold Taq多聚酶，0.2U的UNG酶及引物各0.4mmol/L，探针0.15mmol/L。37℃ 5min后，95℃变性3min30s，94℃ 20s、60℃ 40s(荧光信号检测)循环41次，最后4℃保存。检测所用Taqman探针序列：5’FAM-CCAGCAGCGCCTCCTCCTGC-3’TAMARA；引物序列：Forward primer(正向引物)：5’-CCC TCAGGCTCAGGGCATA-3’，Reverse primer(反向引物)：5’-CTTCCTGACTGCCGATTGGT-3’。
4、试验细胞系
HepG 2215细胞，引自复旦大学分子病毒实验室。该细胞株是用2个头尾相连的HBV DNA全基因的重组质粒转染受体细胞HepG2而成，可在体外稳定的分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒，还能产生大量的复制中间体(RI)。细胞培养于含10％胎牛血清的DMEM中。
5、阳性对照药为阿德福韦双特戊酸酯(Adefovir Dipivoxil，ADV)。抗病毒结果如下：
| 化合物编号 | aEC50(μM) | bCC50(μM) | cSI |
| 7 | 0.14 | 225.70 | 1612.14 |
| 8 | 0.027 | 648.64 | 24023.70 |
| 9 | 0.03 | 272.40 | 9080.00 |
| 10 | 0.54 | 592.69 | 1097.57 |
| 11 | 1.16 | 600.18 | 517.40 |
| 12 | 2.89 | 175.23 | 60.63 |
| 13 | 1.64 | 186.02 | 113.43 |
| 14 | 0.45 | 112.84 | 250.76 |
| 16 | 4.99 | 808.22 | 161.97 |
| 18 | ＞50 | 372.30 | ＜7.45 |
| 19 | 0.016 | 696.55 | 43534.38 |
| 21 | 4.58 | 220.01 | 48.04 |
| 22 | 0.11 | 240.97 | 2190.64 |
| 23 | 0.67 | 203.10 | 303.13 |
| 24 | 0.94 | 311.70 | 331.60 |
| 25 | 0.98 | 570.16 | 581.80 |
| 26 | 0.10 | 468.48 | 4684.80 |
| 32 | ＞50 | 785.12 | ＜15.70 |
| 33 | 13.29 | 615.41 | 46.31 |
| ADV | 0.26 | 181.10 | 696.54 |
a.EC50：半数有效浓度；b.CC50：半数细胞毒性浓度；c.SI：作用选择性指数(CC50/EC50)。
从上表可以看出，大部分化合物都显示出较好的抗HBV的活性，其中，化合物7，8，9，19，22，26显示出比阳性对照药ADV更好的抗HBV活性，更好的选择比。尤其是化合物19的抗病毒活性约是阳性对照药ADV的20倍，SI值约是ADV的25倍。
Claims (11)
1、由下面通式(I)表示的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物：
式(I)中：
R1代表氢、氯、氟、氨基、羟基、直链或支链或环状C1-C6的烷基氨基、直链或支链C1-C6的烷氧基、取代芳香基氧基或者取代芳香基硫基；
R2代表氢、氨基或者直链或支链C1-C6的烷基氨基；
R5代表氢、环丙基或者直链或支链C1-C6的烷基；
R3和R4可以相同或不同，分别独立为苯基、(IIa)或者(IIb)，
式中，
R6和R8彼此独立地代表氢、直链或支链C1-C6烷基、三氟乙基或者苄基；
R7代表氢、苄基、直链或支链C1-C6烷基或者天然氨基酸的侧链；
n为1或2；
或者，
当R3代表苯基，R4代表下式(IIc)：
式中，R7、n定义如上。
2、根据权利要求1所述的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，其特征在于，所述的R1代表氢、氯、氟、氨基、羟基、环丙基氨基、甲氧基、乙氧基或者对甲氧苯硫基；
R2代表氢或者氨基；
R5代表氢、环丙基或者甲基；
R3和R4可以相同或不同，分别独立为苯基、(IIa)或者(IIb)，
式中，
R6和R8彼此独立地代表氢、直链或支链C1-C6烷基、三氟乙基或者苄基；
R7代表氢、苄基、甲基、异丙基或者3-甲基丙基；
n为1或2；
或者，
当R3代表苯基，R4代表下式(IIc)：
式中，R7、n定义如上所述。
3、根据权利要求1或2所述的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，其特征在于，所述的非环核苷膦酸酯类化合物为如下化合物之一：
/表示游离碱；
4、根据权利要求1所述的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物或溶剂合物，其特征在于，所述的药学上可接受的无机或有机盐是通式(I)化合物与酸形成的盐，所述的酸为盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸、甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、天冬氨酸或者谷氨酸；或通式(I)化合物与碱形成的钠盐、钾盐、钙盐、铝盐、铵盐、甲胺盐、乙胺盐或乙醇胺盐；或通式(I)化合物与碱性氨基酸形成的盐，所述的碱性氨基酸为赖氨酸、精氨酸或鸟氨酸。
5、一种通式(I)表示的非环核苷膦酸酯类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)N-叔丁氧羰基-L-氨基酸与2-溴乙醇或氯甲基氯磺酸酯反应生成(IIIa)化合物；
其中R7和n定义如权利要求1所述，X为溴或氯，R9为叔丁氧羰基；
(2)(IIIa)化合物与9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯反应生成膦酸酯；上述膦酸酯化合物在氯化氢饱和的1，4-二氧六环或乙酰氯/甲醇存在下脱去保护基生成(Ia)化合物；
6、根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述的(IIIa)化合物与9-[2-(膦酰基甲氧基)乙基]腺嘌呤单苯基酯，在极性非质子溶剂中，有机碱作用下，于-10～80℃反应0.5～72小时，生成叔丁氧羰基保护的膦酸酯。
7、一种通式(I)表示的非环核苷膦酸酯类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)L-氨基酸酯与氯甲酸氯甲酯反应生成(IIIb)化合物，或者L-氨基酸酯与2-溴乙基氯甲酸酯反应生成(IIIc)化合物；
其中R6、R7、R8和n定义如权利要求1所述，X为溴或氯；
(2)在碱存在下，化合物(IV)
与(IIIb)化合物反应生成下式(Ib)化合物，或者化合物(IV)和(IIIc)化合物反应生成下式(Ic)化合物；
其中R1、R2、R5、R6、R7、R8、n定义如权利要求1所述。
8、根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中的反应是在极性或非极性溶剂中，在碱性条件下，-10～100℃反应1～24小时，得到卤素取代的产物(IIIb)或(IIIc)化合物；
在步骤(2)中的反应是在极性非质子溶剂中，有机碱作用下，于0～100℃反应0.5～72小时。
9、一种治疗病毒感染性疾病的药物组合物，其特征在于，其包含通式(I)表示的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物和溶剂合物中的一种或多种作为有效活性成分。
10、通式(I)表示的非环核苷膦酸酯类化合物及其各种光学异构体、各种晶型、药学上可接受的无机或有机盐、水合物和溶剂合物在制备治疗病毒感染性疾病的药物中的应用。
11、根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述的疾病是乙型肝炎病毒和HIV病毒引起的感染性疾病。
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20111005 Termination date: 20120525 |