CN1579379A - 烯丙胺衍生物的组合物及用途 - Google Patents

Abstract

本发明揭示例如特比萘芬(terbinafine)的烯丙胺衍生物，在抑制癌细胞生长上的用途。本发明也揭示烯丙胺衍生物与例如诺考达唑(nocodazole)的其他化疗活性剂组合，在抑制癌症上的增效效果。

Description

烯丙胺衍生物的组合物及用途

技术领域

本发明揭示烯丙胺衍生物的组合物及烯丙胺衍生物在抑制癌细胞生长上的用途，该烯丙胺衍生物例如特比萘芬(terbinafine，TB)。本发明也揭示烯丙胺衍生物与其他化疗活性剂组合，在抑制癌症上的增效作用，该化疗活性剂例如诺考达唑(nocodazole)。

背景技术

目前治疗人类癌症的选择是限制于切除手术、一般化疗、辐射治疗，以及用于少部分依赖雌激素生长的乳癌的抗雌激素疗法。虽然在癌症治疗上已有可观的改良，但全面预断仍不佳。例如根据台湾卫生署(Taiwan’s Department of Health(DOH))的报导，依据台湾2002年十大主要死亡原因调查，癌症已连续第21年为主要死亡原因。超过四分之一的疾病患者死于恶性肿瘤。前五大主要死亡原因为肝癌、肺癌、cochrane结直肠癌、乳癌和胃癌。因此，研究者持续研究新的治疗策略。有一种方法为寻求确认能够阻滞细胞周期和/或活化癌细胞内细胞凋亡(apoptotic)反应的药剂。

化疗药剂抑制癌细胞生长和诱发凋亡作用的能力在其治疗反应上扮演重要的角色。另一种方法尝试确认化疗药剂的组合。因为在高剂量下的显著毒性，已排除将化疗药剂用于癌症的单一治疗(monotherapy)，综合治疗(combination therapy)已成为一种有潜力的方法，以有助于降低化合物的非所要的毒性效果，但仍维持或增进其抗肿瘤效力。

发明内容

因此，本发明的一方面为提供一种化合物，其组合物，以及其与其他用于癌症治疗的活性剂的组合。

本发明的另一方面为提供一种烯丙胺衍生物、其组合物，以及其与其他用于抗肿瘤治疗的活性剂的组合。

在一方面，本发明包括一种用于治疗温血哺乳动物的癌症的方法，包含下述步骤：将治疗上有效量的游离碱形式或药学上可接受的盐类形式的烯丙胺衍生物，投药到这种哺乳动物。

在另一方面，本发明包括一种用于治疗温血哺乳动物的癌症的药学组合物，包含一种治疗上有效量的烯丙胺衍生物与一种药学上可接受的载剂。

又另一方面，本发明包括一种用于抑制结肠癌细胞生长的增效药学组合物，其中此组合物包含一种治疗上有效量的烯丙胺衍生物、活性剂与药学上可接受的载剂。

在另一方面，本发明包括一种利用诱发温血哺乳动物内抗癌蛋白质以治疗癌症的方法，包含下述步骤：将治疗上有效量的游离碱形式或药学上可接受的盐类形式的烯丙胺衍生物，投药到这种哺乳动物。

在另一方面，本发明包括一种利用抑制温血哺乳动物内与细胞周期调节蛋白质(cyclin)有关的蛋白质以治疗癌症的方法，包含下述步骤：将治疗上有效量的游离碱形式或药学上可接受的盐类形式的烯丙胺衍生物，投药到这种哺乳动物。优选地，这种烯丙胺衍生物为特比萘芬(terbinafine，TB)。

本发明的这些与其它方面及特征，当配合后附图式以阅读下述详述说明时，将可更完全地了解。

附图简单说明

图1显示在人类恶性肿瘤细胞及正常细胞内，TB对细胞数的剂量依赖性效应；

图2显示TB诱发的COLO 205细胞中G0/G1相停止的时间依赖性反应；

图3显示TB对人类癌细胞中细胞周期及凋亡作用的效应；

图4显示细胞增殖的TB诱发抑制作用的可逆性；

图5显示低剂量(1-5μM)的TB对人类COLO 205癌细胞中细胞周期停止的效应；

图6显示TB对COLO 205细胞中细胞周期调节蛋白质(cyclin)及cdk蛋白质浓度的时间效应；

图7显示TB对细胞周期调节蛋白质浓度的剂量效应；

图8显示在含有不同p53基因复制量的各种不同细胞株(cell lines)中cdk4的存在量；

图9显示TB降低裸鼠中肿瘤的生长速率及增强ND(诺考达唑(nocodazole))的抗肿瘤活性；

图10显示TB造成COLO 205-异种移殖肿瘤中凋亡作用的发生以及p53与p21/Cip1蛋白质的浓度增加；以及

图11显示COLO 205肿瘤组织中p53、p21/Cip1及p27/Kip1蛋白质的免疫定位作用(immuno-localization)。

具体实施方式

定义

在本说明书中所使用的“有效量”一词意指足以提供充分抑制活体外及活体内肿瘤细胞生长的效果的量。

在本说明书中所使用的“药学上可接受的载剂”中的“载剂”一词意指稀释剂、赋形剂、受体(recipient)及其类似物，以供使用于制备药学组合物的混合物。

缩写

AS，反义寡核酸(反义寡核苷酸)

CDK，细胞周期调节蛋白质(cyclin)依赖性激酶

CKIs，cdk抑制剂

DMSO，二甲亚砜

EMSA，电泳迁移率位移分析

FACS，荧光活化细胞筛检仪

FCS，胎牛血清

I.P.，免疫沉淀法

NBT，氮蓝四唑

ND，诺考达唑(nocodazole)

TB，特比萘芬(terbinafine)

PMSF，苯甲基磺酰氟

S，有义

SDS-PAGE，十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳

烯丙胺衍生物及其组合

最近，发明人已显示出许多抗真菌剂在活体外及活体内的各种不同的亚性肿瘤细胞中，实行抗增殖和/或凋亡(apoptotic)活性。举例而言，发明人先前的研究已显示出，酮康唑(ketoconazole)在细胞周期的G0/G1相时诱发细胞周期停止，以及在肝癌和结肠癌细胞中发生凋亡作用(HoYS等人，Toxicology & Applied Pharmacology 1998；153(1)：39-47；ChenRJ，等人，Toxicology & Applied Pharmacology 2000；169(2)：132-41)，而灰黄霉素(griseofulvin)经由不正常的微小管聚合作用，在G2/M期诱发凋亡作用及细胞周期停冲(Ho YS等人，International Journal ofCancer 2001；91(3)：393-401)。

众所皆知的抗真菌剂中的一种烯丙胺衍生物。烯丙胺类的较佳例子包括下述产品：

(1)特比萘芬(terbinafine)，1-萘甲胺、N-(6，6-二甲基-2-庚炔-4-基)-N-甲基-，(E)-抗霉菌烯丙胺或特比内芬(turbinefine)盐酸盐。

(2)萘替芬(naftifine)、1-萘甲胺、N-甲基-N-(3-苯基-2-丙烯基)-(E)。

(3)布特萘芬(butenafine)、N-(对-第三丁基苯甲基)-N-甲基-1-萘甲胺、苯甲胺抗真菌剂，或布特萘芬(butenafine)盐酸盐。最佳的烯丙胺衍生物为诺考达唑(nocodazole)。

TB为烯丙胺类中新合成的口服抗霉菌药剂，以及在三十碳六烯酸过氧化作用阶段抑制麦角甾醇(ergosterol)合成的杀真菌剂。(Petranyi G等人，Science 1984；224(4654)：1239-41)。其显示出良好的安全性分布以及极微的药物交互作用(Abdel-Rahman SM等人，Annals ofPharmacotherapy 1997；31(4)：445-56)。在美国，已认可乳霜形式和口服锭剂形式的TB的临床使用。(Gupta AK等人，Journal of the AmericanAcademy of Dermatology 1997；37(6)：979-88)。口服配方已在不同的国家上市达8年以上，以及到1997年，已有超过七千五百万人接受过这种药剂的治疗(Gupta AK等人，Clinical & Experimental Dermatology1998；23(2)：64-7)。TB的抗肿瘤活性是藉由本发明来检测的。

此外，本案发明人的先前研究证实灰黄霉素(griseofulvin)，其为一种口服抗真菌剂，具有诺考达唑(nocodazole)的抗癌活性，诺考达唑为临床使用的活体内化疗药剂(Ho YS等人，International Journal ofCancer 2001；91(3)：393-401)。虽然本发明可包括任何化疗药剂，但是较佳的化疗药剂包括选自于下述化疗药剂组成的组群中：阿苯达唑(albendazole)、苯硫咪唑(fenbendazole)、诺考达唑(nocodazole)、甲基丁基苯并咪唑-2-基胺基甲酸酯(parbendazole)、甲苯达唑(mebendazole)、丙氧苯咪唑(oxibendazole)、多菌灵(carbendazim)和噻菌灵(thiabendazole)和苯并咪唑(benzimidazol)及其组合。最佳的化疗药剂为诺考达唑(nocodazole，ND)。ND也为天然和合成的依波士龙(epothillones)，包括但不限制于依波士龙(epothillone)A、B、C和D。为了研究更多治疗癌症的方法，本案发明人也揭示灰黄霉素(griseofulvin)和诺考达唑(nocodazole)的综合疗法，显著地增进对带有COLO 205肿瘤异种移殖物的无胸腺老鼠体内癌细胞的治疗效果(Ho YS等人，International Journalof Cancer 2001；91(3)：393-401)。因此，在本发明中，TB对ND-诱发的凋亡作用的增进作用已进一步证实。

经特比萘芬(terbinafine)治疗的人类恶性癌细胞的细胞增殖作用的抑制

检测TB对不同人类癌细胞的生长的影响。在图1中，(A)COLO 205、(B)HT29、(C)HepG2、(D)Hep3B、(E)HL60和(F)正常人类成纤维细胞是利用不同浓度(30至120Mm)的TB来处理。包含或不包含TB的培养基是每天更换，直到进行细胞计数为止。每一实验组群分析三个样品。数值以平均值±S.E.表示。将细胞在有或无TB(30至120μM)之下培养5天，以及接着收取细胞并计数。这些数据显示出TB以剂量依赖性的方式，使经培养的人类癌细胞(COLO 205、HT29、HepG2、Hep3B和HL60)的细胞数目降低。当TB浓度增加到60μM，在这些癌细胞中可观察到细胞生长停止或细胞死亡。相对地，浓度30-60μM的TB不会抑制经培养的人类牙龈的成纤维细胞的生长速率(图1F)。然而，当TB浓度增加到120μM，观察到50％的生长抑制率。

在人类癌细胞中藉由TB造成在G0/G1期的细胞周期停止

为了有区别地证实TB对于细胞周期的特定期的作用，癌细胞(COLO 205和HT 29)均同步地由转换到含有0.04％FCS的培养基中24小时，以使该等癌细胞静止。当使这些癌细胞回到含有10％FCS和0.05％DMSO(对照组)的培养基或90μM的TB溶于0.05％DMSO(其使得该等癌细胞皆由一新细胞周期开始)时，在不同的时间下，收取癌细胞以进行流式细胞光度分析。图2显示COLO 205和HT 29细胞中TB诱发的G0/G1期停止的时间依赖性反应。COLO 205(A)和HT 29(B)细胞为如实施例中所述，利用0.04％FCS同步化处理24小时。在同步化之后，接着将细胞释放到含有0.05％DMSO(左方部分)的完全培养基(10％FCS)中，或90μM的TB溶于0.05％DMSO(右方部分)。在细胞周期的G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比是利用细胞匹配DNA分析(Cell FIT DNA analysis)软件来测定。每一实验组群分析三个样品，以及数值以平均值±S.E.表示。在图2中，其进一步显示细胞自静止释放后，在不同时间下，DMSO处理的COLO 205细胞(左方部分)以及90μM TB处理的COLO 205细胞(右方部分)的DNA含量的代表性FACS分析(图2A)和DMSO-(左方部分)处理的HT 29细胞以及90μM TB-(右方部分)处理的HT 29细胞的DNA含量的代表性FACS分析(图2B)。结果证实TB诱发在细胞周期的G0/G1期的COLO 205和HT 29细胞的蓄积作用(＞90％)，其暗示所观察到的TB对COLO 205和HT 29细胞的生长抑制作用归因于细胞周期的G0/G1期的停止。图3证明TB对G0/G1停止的剂量效应，以及显示出在COLO205(A)、HT29(B)和HepG2(C)中，TB的剂量依赖性地诱发细胞周期停止在G0/G1期。在Hep3B(D)和HL60(E)中，TB以剂量依赖性的方式，造成凋亡作用的发生。对人类成纤维细胞冶疗15小时后，未造成细胞周期停止或凋亡作用(F)。藉由培养在补充10％FCS和各种不同浓度的TB溶于0.05％DMSO的培养基而自静止释放，于15小时后，进行DNA含量的FACS分析。利用已建立的细胞匹配DNA分析(Cell FIT DNAanalysis)，测定细胞周期的G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比。每一实验组群分析三个样品，以及数值以平均值±S.E.表示。如图3A-C所示，TB以剂量依赖性方式，诱发COLO 205、HT 29和Hep G2细胞中的G0/G1停止。然而，在Hep 3B和HL 60细胞(p53无效)中，TB(10-150Mm)没有诱发G0/G1停止，但剂量依赖性地造成凋亡作用的发生，其可由次G1的存在来证明(图3D和3E)。重要地，利用TB处理人类的成纤维细胞不会诱发细胞周期停止或细胞死亡(图3F)。

TB诱发的G0/G1停止是不可逆的

TB诱发的G0/G1停止的可逆性是由在诱发细胞周期停止后，移除TB来测定。图4显示TB诱发的细胞增殖作用的抑制作用无法由TB的移除而回复。COLO 205细胞是由培养在含或不含90μM TB的补充有10％FCS和0.05％DMSO的培养基中24小时，而自静止释放。在24小时之后，利用PBS冲洗细胞2次，利用不含DMSO或TB的新鲜10％FCS替换。在移除TB之后，TB诱发的抑制细胞增殖作用维持至少7天。每天计数经DMSO与经TB处理的组群中经培养的细胞数目。每一实验组群分析三个实验样品，以及数值是以平均值±S.E.表示。图4中的结果证实，TB诱发的G0/G1细胞周期停止不会因为TB的移除而回复，以及此抑制作用维持至少7天。本发明进一步测试在较低浓度下较长期的暴露，TB是否可诱发细胞周期停止。如图5所示，将COLO 205以浓度低至1μM的TB处理，可诱发显著G0/G1细胞周期停止。TB在COLO 205细胞中，剂量依赖性地且时间依赖性地诱发细胞周期停止于G0/G1期。COLO205细胞是暴露至补充有10％FCS和各种不同浓度(1和5μM)的TB溶于0.05％DMSO的培养基，达指定的时间。含有或不含有TB的培养基是每天替换直到进行流式细胞光度法(flowcytometry)分析。细胞周期的G0/G1、S和G2/M期的细胞百分比是使用已建立的细胞匹配DNA分析(Cell FIT DNA analysis)软件来测定。每一实验组群分析三个实验样品，以及数值是以平均值±S.E.表示。

TB对细胞周期调节蛋白质的浓度的影响

为了研究TB诱发G0/G1停止的潜在分子机制，将COLO 205细胞转换至含有0.04％FCS的培养，以使得细胞在G0/G1期静止。该细胞接着回到补充有10％FCS和0.05％DMSO的含有或不含有TB(60μM)的培养基中，在不同时间之后，收取细胞以进行蛋白质萃取及蛋白质印迹法分析(Western blot analysis)。根据COLO 205细胞中的FACS分析，自静止释放后0、15、18及24小时，分别代表细胞周期的G0/G1、S、G2/M和第二G0/G1期(图2A)。因此，这些时间点是自蛋白质萃取及蛋白质印迹法分析中选择出，以检测TB对细胞周期调节蛋白质的表现的影响。在图6中，(A)在经DMSO处理的COLO 205中，10％FCS造成p21/Cip1蛋白质浓度的暂时增加(上方部分)。相对地，TB造成p21/Cip1蛋白质浓度的持久增加(下方部分)。(B)回应TB的处理，细胞周期调节蛋白质A2(cyclin A2)、B及D3、cdk2、cdk4及pRB蛋白质浓度是向下调整，而细胞周期调节蛋白质E(cyclin E)及p27/Kip1是稍微向上调整。COLO 205细胞是同步地利用0.04％FCS处理24小时，并接着释放到含有TB(60μM)的完全培养基(10％FCS)中，达到所指定的时间点。COLO 205细胞也利用DMSO(0.05％，v/v)处理，以作为对照组。蛋白质萃取物(100μg/线道)是由SDS-PAGE分离，利用专一性的抗体作为探针探查，以及利用NBT/BCIP系统侦测。如图6A所示(上方部分)，在经DMSO处理的COLO 205细胞中的p21/Cip1蛋白质，在这个细胞利用10％FCS攻击后3小时，显著地增加，以及接着在处理后9小时，快速地下降到无法测得的浓度。此结果与现有报告一致，该报告显示出cdk激酶活性的安定性的增加，必须要p21/Cip1的暂时诱发(LaBaer J等人，Genes &Development 1997；11(7)：847-62)。另一方面，经TB处理的COLO 205细胞，TB处理后，显示出p21/Cip1蛋白质浓度的持续增加(图6A，下方部分)。现有研究显示出，静止细胞中的p27/Kip1蛋白质浓度高，以及在利用血清刺激后，快速地降低(Coats S等人，Science 1996；272(5263)：877-80)。由图6B可观察到类似的发现，所述的图显示出在血清饥饿作用后(左方部分，0小时)24小时，在COLO 205细胞中的p27/Kip1蛋白质浓度高，以及接着利用10％FCS攻击后降低(左方部分，15小时)。相对地，在经TB处理的COLO 205细胞的p27/Kip1蛋白质浓度，在经过10％FCS处理后，维持在高浓度(右方部分，0-24小时)。在经TB(60μM)处理的COLO 205细胞中，细胞周期调节蛋白质D3(cyclin D3)、cdk2及cdk4蛋白质向下调整，同时细胞周期调节蛋白质D1(cyclin D1)及PCNA蛋白质的浓度没有改变(图6B，右方部分)。在经TB处理的COLO 205细胞中，也向下调整细胞周期调节蛋白质A2(cyclin A2)及细胞周期调节蛋白质B(cyclin B)，这些蛋白质分别促进细胞进入S及G2/M期(图6B，右方部分)。在经TB处理的细胞中，细胞周期调节蛋白质E(cyclin E)蛋白质的浓度稍微地升高，所述蛋白质与cdk2相结合(图6B，右方部分)。此外，在经TB处理的COLO 205细胞中，磷酸化(pRb)的浓度向下调整。

图3中显示的结果证实，在具有野生型p53的人类癌细胞(COLO 205及HepG2)或具有p53 His²⁷³突变体的人类癌细胞(HT 29)中，TB诱发细胞周期停止于G0/G1期。相对地，在HL 60(p53无效)及Hep 3B(p53部分缺失)中，TB诱发凋亡作用。这些数据建议，TB诱发癌细胞进行G0/G1细胞周期停止凋亡作用，是依细胞的p53状态而定。为了进一步测试这个假设，TB对细胞周期调节蛋白质浓度的剂量效应是以四种不同的人类癌细胞株进行试验：COLO 205(p53野生型)、HT 29(p53 His²⁷³突变体)、Hep 3B(p53部分缺失)及HL 60(p53无效)。如图7所示，在COLO 205及HT 29细胞中，TB增加p53、p21/Cip1及p27/Kip1蛋白质的浓度，以及降低细胞周期调节蛋白质D3(cyclin D3)与cdk4蛋白质的浓度。在HL 60及Hep 3B细胞中，TB处理不会改变p53及p21/Cip1蛋白质的浓度，但显著地增加p27/Kip1蛋白质的浓度。在COLO 205及UT 29细胞中，TB剂量依赖性地增加p53、p21/Cip1及p27/Kip1蛋白质的浓度，以及降低细胞周期调节蛋白质D3(cyclin D3)与cdk4蛋白质的浓度。在HL 60及Hep 3B细胞中，TB处理不会改变p53和p21/Cip1蛋白质的浓度，但以剂量依赖性的方式，显著地增加p27/Kip1蛋白质的浓度。使细胞静止24小时，以及接着利用10％FCS攻击并利用不同浓度的TB(60-150μM)再处理15小时。蛋白质萃取物(100μg/线道)是藉由SDS-PAGE分离，利用专一性的抗体作为探针探查，以及利用NBT/BCIP系统侦测。膜也利用抗GAPDH抗体作为探针探查，以校正蛋白质样品填充(loading)的差异。

P53活化的信号途径涉及TB诱发的G0/G1停止

p53蛋白质已被建议为关于调节细胞周期停止及凋亡作用发生的潜在转录因子(Ko U及Prives C.Genes & Development 1996；10(9)：1054-72；Levine AJ.，细胞1997；88(3)：323-31.)。如图7所示，在经TB处理的COLO 205和HT 29细胞中，p21/Cip1及p53蛋白质浓度是剂量依赖性地增加，其暗示在这些细胞中，p53及p21/Cip1的向上调节可能涉及TB中介的G0/G1停止。为了进一步测试这种假设，发明人测试在三种人类癌细胞株(COLO 205、HT 29及Hep 3B)中，TB对p21/Cip1、p27/Kip1及p53蛋白质，以及cdk4激酶活性的影响。图8显示出：(A)在COLO 205细胞(p53野生型)中，TB强力地降低可分析的cdk4激酶活性。在HT 29(p53 His²⁷³突变)和Hep 3B细胞(p53部分缺失)中，TB稍微地降低cdk4激酶活性。在细胞自静止释放后15小时，利用60μM TB(+)或0.05％DMSO(-)处理细胞；(B)COLO 205细胞，而不是HT 29细胞，利用60μM TB的处理增加p53蛋白质与p21/Cip1启动子DNA探针中p53共有性结合部位之间的结合；以及(C)反义p53寡核苷酸废止TB中介的p53及p21蛋白质浓度以及在G0/G1期的细胞群体的增加。在利用10％FCS攻击细胞并以60μM TB再处理细胞15小时之前16小时，将反义或有义p53添加到COLO 205达最终浓度20μM。利用已建立的细胞匹配DNA分析(Cell FIT DNA analysis)软件测定的细胞周期的G0/G1期的细胞百分比显示于下部。符号″M″意指″大小标志″，″AS″意指″反义p53寡核苷酸″；以及″S″意指″有义p53寡核苷酸″。如图8A所示，浓度60μM的TB，在COLO 205(p53野生型)细胞中诱发可分析的cdk4激酶活性大幅降低，以及在经TB处理的HT-29(p53 His²⁷³突变体)及Hep 3B(p53部分缺失)细胞中，诱发可分析的cdk4激酶活性稍微降低。藉由使用含有p53共有性结合部位的p21/Cip1启动子DNA，进行电泳迁移率位移分析，以证实在经TB处理的COLO 205细胞的核萃取物中的p53结合活性(图8B，线道4)，与在经TB处理的HT 29细胞的核萃取物中的p53结合活性(图8B，线道2)相较，前者显著地增加。

为了进一步证实在经TB处理的细胞中，增加的p53表现与G0/G1停止的相关性，完成如图8C所解释说明的实验。因此，在标志TB的样品中(仅以60μM的TB处理)，p53及p21电泳图谱区带的强度增加，而G0/G1群体增加约2.3倍(图8C，线道2)。利用p53反义寡核苷酸(AS)处理样品TB+AS，该核苷酸阻断p53的表现。因此，在此样品中，p53和p21蛋白质的浓度并未增加，以及将TB添加到样品TB+AS中并无法诱发由TB样品中可明显看出的G0/G1群体增加(图8C，线道3)。

TB增进诺考达唑(nocodazole)(ND)的凋亡作用效果

利用影响不同细胞周期的关卡(checkpoints)的药剂进行细胞的综合治疗，已建议为增进药剂启发的人类恶性肿瘤细胞中凋亡(apoptotic)效应的方法的一(Li CJ等人，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 1999；96(23)：13369-74)。因此，发明人利用TB及ND共处理COLO 205细胞，其中TB造成G0/G1停止，ND造成细胞停止在G2/M期，以及检测凋亡作用发生的程度。自经TB处理的COLO 205细胞中萃取的基因组DNA是藉由凝胶电泳检测。当ND浓度为50Nm或更高时，发现其显示出细胞进行凋亡作用的DNA梯式图谱特征(图9A，线道5)。在图9中，(A)的部分意指因为TB造成的经ND诱发的凋亡作用的潜在性。在COLO 205细胞中，凋亡作用的诱发是利用基因组的电泳，以DNA断裂片段来表示。DNA断裂片段是在药剂处理后24小时检测。在线道2及8，以接受模拟处理(mock treatment)的細胞为对照组。符号″M″(在线道1及7)，意指″DNA大小标志″。(B)经DMSO处理的平均肿瘤体积相对于经药剂处理的裸鼠(n＝5)。(C)肿瘤重量，(D)动物体重，以及(E)肿瘤/体重比例是在实验结束时测定。每一实验组群分析5个样品，以及数值以平均值±S.E.表示。将比较值利用ANOVA(变异数分析)，以及接着利用费希尔氏最低显著差异性分析。被接受的显著性为p＜0.05。^*TB-、ND-，及经TB+ND处理的组群不同于经DMSO处理的组群。经TB+ND处理的组群不同于经TB或经ND处理的组群。在10μM的TB存在下，其不会诱发COLO 205细胞中的DNA梯状现象(图9A，线道9)，ND在如1nM般的低浓度下，在COLO 205细胞中诱发DNA梯式图谱(图9A，线道10)。这个发现意指TB增进COLO205细胞中经ND诱发的凋亡作用。

获知在活体外，藉由TB可增进COLO 205细胞的经ND诱发的凋亡作用后，发明人接着测定在活体内设定中，TB的投药是否可影响经ND诱发的肿瘤尺寸的显著降低。测定给与TB、ND或TB加ND的老鼠相对于给与载剂(DMSO加上花生油)的老鼠的肿瘤体积减少图(9B-E)。重要地，与单独利用TB或ND处理的老鼠(p＜0.05)相较，经TB加ND处理的老鼠的肿瘤体积及肿瘤重量显著地减少，其暗示TB增进经ND诱发的降低肿瘤尺寸的作用。

细胞周期的停止及凋亡作用的发生皆涉及活体内经TB抑制的肿瘤生长

因为细胞周期的阻滞作用和/或细胞凋亡(apoptotic)反应的活化为防止肿瘤生长的二个主要机制，发明人检测TB对衍生自经殖入的COLO 205的固态肿瘤的细胞周期及凋亡作用发生的影响。将置于0.1ml RPMI 1640的COLO 205细胞(5×10⁶)皮下注射到每只裸鼠肩胛骨的间(该裸鼠购自国家科学委员会动物中心，台北)。在移殖作用后，利用双脚规测定肿瘤尺寸以及藉由下述公式评估肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝1/2×L×W²，其中L为肿瘤的长度以及W为肿瘤的宽度(Oki E等人，British Journal of Cancer 1998；78(5)：625-30)。一旦肿瘤的体积达到200mm³，使动物接受腹膜内注射DMSO(25μl)、TB(50mg/kg)、ND(5mg/kg)，或TB加ND，每周3次，共注射6周。

在图10，藉由TdT-中介的dUTP-生物素切口端标记方法原位染色的COLO 205肿瘤组织的光学显微照片用于检测DNA断裂(A)(400×)。箭头指示代表性凋亡(apoptotic)细胞。在COLO 205肿瘤中诱发的TB的凋亡作用也利用基因组DNA的电泳，由DNA断裂片段来显示(B)。蛋白质印迹法显示COLO 205肿瘤中，p53和p21/Cip1蛋白质浓度(C)。COLO205肿瘤在DMSO或TB处理后6星期分离出来，以供蛋白质萃取。利用抗-GAPDH抗体作为探针探查细胞膜，以校正蛋白质样品填充的差异。在自经TB处理的动物分离出来的肿瘤中，凋亡作用的发生的特定证据包括藉由内切核酸酶造成的DNA股断裂，其可利用藉由脱氧核苷酰末端转移酶，以dUTP-生物素标志切口端的组织片断来原位检测(图10A)，以及DNA的断裂片段，其可藉由凝胶电泳来检测(图10B)。自经TB处理的老鼠分离出来的肿瘤中，p53和p21/Cip1的含量增加(图10C)，其暗示抑制细胞周期活性的进行涉及TB诱发的肿瘤尺寸的衰减。COLO 205肿瘤中，TB诱发的p21和p53的向上调节是由免疫细胞化学染色技术来进一步确认。在图11中，p53蛋白质(D，蓝及红色正方形)，p21/Cip1蛋白质(E，蓝色正方形)以及p27/Kip1蛋白质(F，红色正方形)，在自经TB处理的裸鼠分离出来的COLO 205肿瘤组织中，测定到强免疫反应性，但在经DMSO处理的老鼠中则没有(A-C)。将肿瘤组织切割成厚度5-7μM且连续的片段，利用抗人类p53(A及D)、p21/Cip1(B及E)，以及p27/Kip1(C及F)的专本性抗体染色，以测定肿瘤组织中的专一性抗原。绿色箭头表示代表性的p53(D)、p21/Cip1(E)，或p27/Kip1(F)免疫反应性细胞(棕色)(200×)。计算表现p53(G)、p21/Cip1(H)及p27/Kip1(I)的细胞百分比。在COLO 205肿瘤组织中，经DMSO处理的动物(对照组)表现极少的p53、p21/Cip1及p27/Kip1活性(如果有的话)(图11A-C)。相对地，在经TB处理的肿瘤组织中，强烈地诱发p53、p21/Cip1及p27/Kip1免疫反应性(图11D-F)。有趣地，在遍及整个组织片段中，观察到p53免疫反应性细胞。在这些细胞中，一部分细胞表现p21/Cip1而其他的细胞表现p27/Kip1。p21/Cip1(图11E，蓝色正方形)以及p27/Kip1(图11F，红色正方形)免疫反应性细胞位在COLO 205肿瘤组织中的不同区域。第11G-I及I显示出分别表现p53、p21/Cip1及p27/Kip1的细胞百分比。

讨论

在本说明书中，发明人进行的研究为探究TB的抗癌机制。发明人的活体内研究证实在经培养的人类癌细胞中，TB抑制增殖作用及诱发凋亡作用。活体内的研究显示出腹膜内投药剂量50mg/kg的TB，造成COLO 205肿瘤块的肿瘤尺寸减小。在自经TB处理的老鼠分离出来的固态肿瘤中，p21/Cip1和p53蛋白质表现增加及凋亡作用的发生，暗示细胞周期抑制作用及凋亡(apoptotic)细胞死亡皆助成TB的抗肿瘤效果。就我们所知，这首次证明TB透过在癌细胞中阻止细胞周期及活化细胞凋亡(apoptotic)反应，在活体外及活体内皆抑制结肠癌细胞的生长。

TB对细胞生长的抑制性效果没有显示出限制于COLO 205细胞，因为类似的抑制作用也已在其他经转型培养的细胞中观察到，例如HT29、HepG2、Hep3B及HL60(第1图)。然而，TB透过阻止细胞周期或活化细胞凋亡(apoptotic)反应来实行其抗肿瘤活性，似乎依癌细胞中p53状态而定。在所述的研究报告中，我们观察到TB是剂量依赖性地在具有野生型p53(COLO 205及Hep G2)的癌细胞中，诱发细胞周期停止在G0/G1期，以及在具有p53无效(HL 60)或部分缺失p53(Hep 3B)的细胞中，发生凋亡作用。现有的研究报告证实HT-29细胞在p53基因的密码子273(Arg→His)中，含有一点突变(Niewolik D等人，Oncogene 1995；10(5)：881-90)。在HT-29细胞中，经TB处理造成的细胞周期停止取代凋亡作用(第3B图)。这个结果与最近的研究报告一致，这研究报告显示突变体p53不足以诱发凋亡作用(Rowan S等人，EMBO Journal 1996；15(4)：827-38)。在HT-29细胞中，突变体型p53蛋白质是藉由pAbDO-1(识别所有p53蛋白质)及pAb 1620(识别p53的野生型构型)识别，但不是藉由pAb 240(识别p53的突变体构型)识别(Webley KM等人，Journal of Pathologv 2000；191(4)：361-7)。在这个研究中，在HT-29细胞(具有野生型p53构型)中的突变体型p53蛋白质，可利用pAb 1620来检测。然而，在HT-29细胞中，p53藉由TB诱发的程度远低于在COLO 205细胞中所观察到的程度(第8A图)。这些观察证明表现野生型p53的COLO 205细胞，以及具有野生型p53的HT 29细胞对于TB诱发的G0/G1停止具有敏感性。这个结果暗示G0/G1细胞周期停止涉及p53信号途径。

利用TB处理的COLO 205细胞，造成p21/Cip1、p27/Kip1和p53蛋白质浓度增加，以及细胞周期调节蛋白质(cyclin)A2、B及D3、cdk2及cdk4蛋白质浓度降低(第6及7图)。在这些改变中，p53似乎对于COLO 205细胞中，TB诱发的G0/G1停止具有主要的贡献。p53，肿瘤抑制基因，已涉及各种不同细胞加工(Greenblatt MS等人，Cancer Research 1994；54(18)：4855-78；Bates S及Vousden KU。Current Opinion in Genetics &Development 1996；6(1)：12-8)。然而，p53的无庸争议的角色为诱发细胞生长停止及凋亡作用(el-Deiry WS等人，Cancer Research 1994；54(5)：1169-74；el-Deiry WS等人，Cell 1993；75(4)：817-25)。回应TB处理，COLO 205中的p53及HT 29的表现是显著地向上调节。TB诱发的p53的增加确实会结合至p21/Cip1启动子DNA，其含有p53共有性结合部位(第8B图)。在这研究中，我们进一步证实藉由COLO 205细胞中的TB诱发的G0/G1细胞周期停止的过程，是与联合p53的信号途径活化作用相关，如同p53专一性反义寡核苷酸实验所证实者(第8C图)。此外，在p53无效细胞，HL 60中，没有观察到TB诱发的G0/G1停止(第3E图)。这些数据进一步支持TB诱发的抗增殖涉及p53的概念。自经TB处理的老鼠分离出来的固态肿瘤中观察到的p53及p21/Cip1蛋白质表现增加以及凋亡作用的发生，支持下述假设：TB诱发的COLO 205肿瘤的肿瘤尺寸降低涉及p53信号途径。在经TB处理的COLO 205细胞中，p21/Cip1蛋白质表现增加及可分析的cdk4激酶活性降低(第8A图)，建议TB处理造成p53蛋白质浓度增加，其接着向上调节p21/Cip1浓度，以及最后诱发cdk激酶活性降低。因p21/Cip1所诱发的cdk4活性降低最有可能成为引起COLO 205细胞中TB诱发的G0/G1停止的原因。

在这研究中，我们尝试澄清p21/Cip1及p27/Kip1蛋白质表现的角色，其涉及藉由TB诱发的G0/G1停止和(或)凋亡作用。现有研究已证明p21/Cip1透过结合cdks及使cdks去活化以停止细胞周期，所述cdks为细胞周期进行所需要者(el-Deiry WS等人，Cancer Research 1994；54(5)：1169-74；el-Deiry WS等人，Cell 1993；75(4)：817-25)。许多研究已建议p21/Cip1确实具有肿瘤抑制基因性质。p21/Cip1突变已于数种人类肿瘤中发现(Malkowicz SB等人，Oncogene 1996；13(9)：1831-7)；以及已证实为专一性地废止与cdks结合的p21/Cip1突变，是在初期乳癌中被鉴定出(Balbin M等人，Journal of Biological Chemistry 1996；271(26)：15782-6)。p27/Kip1亦中介生长停止及被视为在活体内细胞分裂的负调节中扮演重要角色(Naumann U等人，Biochemical & BiophysicalResearch Communications 1999；261(3)：890-6)。相对于p21/Cip1，具有p27/Kip1基因无效的老鼠显示出体型尺寸增加，雌性不孕，以及自发性脑下垂体肿瘤的高发生率(Fero ML等人，Cell 1996；85(5)：733-44)。在这研究中，我们证实p27/Kip1是显著地藉由TB在HL 60(p53无效)及Hep 3B(p53缺失)细胞中同时诱发(第7图)。然而，在Hep 3B及HL 60细胞中没有观察到显著的G0/G1期细胞周期停止(第3D及E图)。最近的研究证实腺病毒中介的p27/Kip1过度表现，导致人类癌细胞中的凋亡作用。强烈对比地，观察到p21/Cip的类似过度表现，造成G1-S停止，但使细胞毒性最小化(Katayose Y等人，Cancer Research 1997；57(24)：5441-5)。另一研究证实p27/Kip1表现是与自发性凋亡作用，以及活体内及活体外的口及正咽癌(oral and orthopharyngeal carcinoma)的肿瘤区段的Bax蛋白质表现(Fujieda S等人，International Journal of Cancer1999；84(3)：315-20；Wang X等人，Oncogene 1997；15(24)：2991-7)。所有这些结果暗示p27/Kip1蛋白质可能在TB诱发的凋亡作用上，而不是细胞生长停止上，扮演重要的角色。

抑制癌细胞生长及诱发凋亡作用的化疗药剂对其化疗反应扮演重要的决定者。然而，高剂量下的显著毒性已排除化疗药剂使用于癌症的单一治疗(monotherapy)。综合治疗(combination therapy)为一种有潜力的方法，有助于降低化合物的非所要的毒性影响，但仍维持或增进其抗肿瘤效力。最近，我们的研究证实灰黄霉素(griseofulvin)，一种口服抗真菌剂，在活体内可使临床上使用的化疗药剂ND的抗癌活性增效(Ho YS等人，International Journal of Cancer 2001；91(3)：393-401)。在最近的研究中，我们进一步证实TB增进ND诱发的凋亡作用。历史上，TB已使用于作为具有口服活性的广谱抗真菌剂，尤其是组织浆菌病(histoplasmosis)或非脑膜隐球菌症(nonmeningeal cryptococcosis)(Rademaker M及Havill S，New Zealand Medical Journal 1998；111(1060)：55-7；Caceres-Rios U等人，Journal of the American Academy ofDermatology 2000；42(1 Pt 1)：80-4)。现有的研究已证实，在口服剂量(250mg)后，约70％TB被吸收(Jensen JC，Clinical & ExperimentalDermatology 1989；14(2)：110-3)，以及在2小时内达到最大血浆浓度0.5-1.5μg/mL。(Humbert U等人，Biopharmaceutics & Drug Disposition1995；16(8)：685-94；Kovarik JM等人，AntimicrobialAgents &Chemotherapy 1995；39(12)：2738-41；Kovarik JM等人，British Journalof Dermatology 1992；126(Suppl.39)：8-13)。人类研究的另一报导显示，在每天口服摄取250mg的TB达4周后，TB的血浆浓度为1.7±0.77μg/ml(5.83μM)(Kovarik JM等人，Antimicrobial Agents &Chemotherapy 1995；39(12)：2738-41)。TB为高度亲脂性及亲角质性(keratophilic)。其广泛地蓄积在脂肪组织、富含角蛋白的组织(例如真皮、表皮及指甲)以及其他器官组织(Faergemann J等人，Acta Dermato-Venereologica 1993；73(4)：305-9；Uosseini-Yeganeh M及McLachlan AJ.Journal of Pharmaceutical Sciences.2001；90(11)：1817-28)。在停止药物治疗后短短1天，组织阶层的TB浓度超过血浆中的TB浓度，以及所述的差异持续增加直到组织取样的最后一天。在本说明书中，我们显示出1μM的低浓度投药TB达3天，使COLO 205细胞停止在细胞周期的G0/G1期(第5图)。我们进一步证实TB诱发的细胞周期停止是不可逆的(第4图)。这个结果暗示持续投药低剂量的TB可达到血浆中的治疗浓度。重要地，流式细胞光度分析显示出，在使用于我们活体外研究的剂量(10-150μM)下，TB对于经培养的未转型人类成纤维细胞无细胞毒性，且Tb对此培养物中的细胞增殖作用无任何作用(第3F图)。然而，TB对于细胞生长速率的影响的研究显示出以浓度120μM的TB处理5天，人类成纤维细胞数目降低50％(第1F图)。这可藉由细胞内TB蓄积来解释，此蓄积归因于5天中培养基的每日变化。此外，使用于目前活体内研究的剂量(50mg/Kg体重)对于活体器官没有细胞毒性。

虽然TB诱发的抗肿瘤作用的动物研究仍持续进行，但是由目前活体外及活体内的研究发现，强烈地建议TB在人类癌症治疗上的潜在性应用。TB在癌细胞增殖作用的抑制上的万用性使其在癌症化疗上非常有吸引。

实施例

下述实施例解释说明本发明的组合物的制备、特征及用途。这些实施例不能以任何方式企图缩限本发明的范围。

实施例1  细胞株和细胞培养物

HT 29(p53突变体)(Niewolik D等人，Oncogene 1995；10(5)：881-90)及COLO 205(p53野生型)(Ho YS等人，Molecular Carcinogenesis 1996；16(1)：20-31)是自人类结肠腺癌(colon adenocarcinoma)(美国菌种保存中心，ATCC HTB-38及CCL-222)分离中的细胞株。Hep 3B(p53部分缺失)(Bressac B等人，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 1990；87(5)：1973-7)及Hep G2(p53野生型)(Bressac B等人，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America 1990；87(5)：1973-7)细胞株为衍生自人类肝细胞癌(ATCC HB-8064及HB-8065)(Knowles BB等人，Science 1980；209(4455)：497-9)。人类牙龈成纤维细胞是藉由酶解离获取。HL 60细胞株(p53无效)是自人类骨髓细胞白血病(myeloid leukemia)的细胞(59170；美国菌种保存中心)。细胞株是在湿润的保温箱(37℃，5％CO₂)中，在伊格尔氏基本必需成分培养基(Eagle′s minimal essential medium，MEM)(用于Hep 3B、Hep G2及人类牙龈成纤维细胞)，或补充有10％胎牛血清(FCS)、50μg/mL庆大霉素(gentamycin)及0.3mg/mL谷氨酰胺(glutamine)的RPMI 1640(用于COLO 205、HT 29及HL 60细胞)中生长。p53专一性的反义(5′-CGGCTCCTCCATGGCA-GT-3′)和有义(5′-ACTGCCATGGAGGAGCCG-3′)磷硫代酸酯(phosphothioates)(S-寡聚物)是如同我们前述论文中所描述般设计(Chen RJ等人，Toxicology &Applied Pharmacology 2000；169(2)：132-41)，利用Genset制造的高效能液态层析仪合成及纯化。

实施例2  细胞生长曲线的测定

将人类结肠癌、肝癌、血癌及人类正常的成纤维细胞，以1×10⁴的密度，放置在35-mm培养皿中。依所指示的剂量，将TB添加于0.05％二甲亚砜(DMSO)中。就对照组而言，使用相同体积的0.05％DMSO，但没有添加TB。含有或不含有TB的培养基是每日更换，直到计数细胞为止。

实施例3  流式细胞光度

如前述般使COLO 205及HT 29细胞同步生长(Chen RJ等人，Toxicology & Applied Pharmacology 2000；169(2)：132-41)。在细胞已生长至70-80％汇合生长时，藉由在含有0.04％FCS的RPMI 1640中24小时，使细胞静止，并利用10％FCS攻击。接着，在利用胰蛋白酶-EDTA释放后，在不同时间点收取细胞，利用PBS/0.1％右旋葡萄糖冲洗2次，在4℃下，在70％乙醇中固定。利用含有磺化吡啶(propidium iodine)(50g/ml)及无DNA酶的RNA酶(2U/ml)的试剂染色细胞核DNA，并利用荧光活性细胞分选仪(FACS)测量。在细胞周期的每一期内的细胞核数目是利用已建立的细胞匹配DNA分析(Cell FIT DNA analysis)软件决定(Becton Dickenson，San Jose，CA)。

实施例4  蛋白质萃取及蛋白质印迹法分析

同前述(Chen RJ等人，Toxicology & Applied Pharmacology 2000；169(2)：132-41)，将冷冻的肿瘤在液态N₂中磨成粉，并接着与溶胞作用缓冲液(Tris-HCl 0.5M，pH 6.8，SDS 0.4％)混合。对细胞培养物而言，将细胞接种在150-mm培养皿上并在RPMI 1640(用于COLO 205、HT 29及HL 60细胞)中或在补充有10％FCS的MEM(用于Hep 3B)中生长。在细胞已生长至次汇合生长时，使细胞静止。利用补充有10％FCS的培养基使细胞自静止释放。将含有TB的0.05％DMSO或不含TB的0.05％DMSO以不同浓度添加到细胞中，并容许混合物保温17小时。如前述般进行蛋白质印迹法(Chen RJ等人，Toxicology & Applied Pharmacology2000；169(2)：132-41；Lee WS等人，Circulation Research 1998；82(8)：845-51)。利用适当稀释倍数的专一性抗体作为探针，在室温下进行免疫检测(immunodetection)2小时。抗-p21/Cip1、抗-p27/Kip1、抗-p53、抗-GAPDH的单株抗体(Santa Cruz，Inc.CA)；抗-细胞周期调节蛋白质(cyclin)B1、D1，及D3，抗-cdk2及cdk4，以及PCNA单株抗体(Transduction Laboratories，Lexington，KY)是以1∶1,000的稀释倍数使用。抗-细胞周期调节蛋白质(cyclin)A及E多株抗体(Transduction，San Diego，CA)是以1∶250的稀释倍数使用。二次抗体、与碱磷酸酶耦合的抗-老鼠或抗-兔抗体(Jackson，Westgrove PA)在室温下培养1小时，分别以1∶5,000的稀释倍数及1∶1,000的稀释倍数使用。专一性蛋白质复合物是由与致色基质(colorigenic substrates(氮蓝四唑，NBT及5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐BCIP；Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)一起培养来鉴定。在每一实验中，细胞膜也利用抗-GAPDH抗体作为探针，以校正蛋白质填充上的差异。

实施例5  免疫沉淀及激酶活性分析

如前述(Wu X等人，Oncogene 1996；12(7)：1397-403)，经TB处理的细胞是在Rb溶胞作用缓冲液中进行溶胞，并利用抗-cdk4抗体(2μg)进行免疫沉淀。在珠粒上的蛋白质复合物是利用Rb溶胞作用缓冲液冲洗2次，并接着利用Rb激酶分析缓冲液冲洗1次。磷酸化Rb(用于pRb)，组织蛋白H1(用于cdk2)及谷胱甘肽s-转移酶-Rb融合蛋白质(用于cdk4)是由将珠粒与40μl的热Rb激酶溶液(0.25μl(2μg)的Rb-GST融合蛋白质，0.5μl的(γ-³²P)ATP，0.5μl的0.1mM ATP及38.75μl的Rb激酶缓冲液)，在37℃下一起培养30分钟，并接着由将样品在SDS样品缓冲液中煮沸5分钟来测定。利用12％SDS-PAGE分析样品，以及接着干燥凝胶，并将该凝胶进行放射自显影术处理。

实施例6  电泳迁移率位移分析(EMSA)(Somasundaram K等人， Nature 1997；389(6647)：187-90)

使用于本实施例的双股DNA探针包含具有p53共有性结合部位的p21/Cip1启动子(5’-CAGGAACAGTCCC-AACATGTTGAGC-3’)。经放射线标记的DNA(4ng，100,000cpm)是与细胞核萃取物一起在冰上培养于15μl的结合缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM EDTA，10％甘油，200mM NaCl，及1μg探针DNA)5分钟。样品在5％聚丙烯酰胺凝胶中电泳，在Whatman 3M滤纸上干燥，并接着在-70℃下曝光至富士(Fuji)X-射线软片。

实施例7  活体内COLO 205衍生的异种移殖物的处理(Ho YS等 人，International Journal of Cancer 2001；91(3)：393-401)

将0.1ml的RPMI 1640中的COLO-205细胞(5×10⁶)皮下注射至每一只裸鼠的肩胛骨之间(该裸鼠购自国家科学委员会动物中心，台北)。在移殖后，利用双脚规测定肿瘤尺寸以及藉由下述公式评估肿瘤体积：肿瘤体积(mm³)＝1/2×L×W²，其中L为肿瘤的长度以及W为肿瘤的宽度(Oki E等人，British Journal of Cancer 1998；78(5)：625-30)。一旦肿瘤的体积达到200mm³，便使动物接受腹膜内注射DMSO(25μl)、TB(50mg/kg)、ND(5mg/kg)，或TB加ND，每周3次，共注射6周。

实施例8  自经TB处理老鼠分离出来的肿瘤组织中的DNA断裂 片段

肿瘤组织是在每一实验结束时切除。一部分肿瘤组织冰冻在液态氮中以供用于DNA分离；其他部分固定在4％多聚甲醛，用于利用TdTFragEL^TMDNA断裂片段检测套组(Calbiochem Co.，Cambridge，MA02142)来检测凋亡(apoptotic)细胞。如前述般(Ho YS等人，Toxicology &Applied Pharmacology 1998；153(1)：39-47)，将自冷冻肿瘤组织分离出来的DNA用于检测DNA梯状现象，凋亡作用的标志。

实施例9  COLO 205肿瘤组织中p53、p21/Cip1及p27/Kip1蛋白质的表 现的免疫细胞化学染色分析

将包埋在石蜡中的嵌段分段成厚度5-7μm(Lee WS等人，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 1990；87(13)：5163-7；Lee WS等人，Nature Medicine 1997；3(9)：1005-8)。在用于抗原恢复的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)中微波预处理后，将载玻片浸渍在0.3％过氧化氢中20分钟，以阻断内生性过氧化酶活性。于利用PBS彻底冲洗后，将载玻片在4℃下，与稀释倍数1∶50的p53、p21/Cip1及p27/Kip1抗体培养隔夜。在与生物素酰基化抗鼠抗体二次培养后，将载玻片与过氧化酶共轭链霉抗生物素(streptavidin)(DAKO LSAB+kit；Dako Corp.，Carpinteria，CA)。反应产物是由将载玻片浸渍在四氢二胺基联苯胺中而视觉化，及最后利用苏木精(hematoxylin)。

实施例10  统计学

所有数据都以平均值±s.e.平均值来表示。比较是采变异数单向分析法(ANOVA)并接着进行费希尔氏最低显著差异性分析(Fisher’s leastsignificant difference test)。接受P＜0.05的下的显著性。

虽然本发明已参考特殊具体例来描述，但对熟悉这所述技术者而言，明显可知在没有偏离本发明的范畴下，可进行各种不同的改变及改质。

Claims (16)

1.一种用于治疗温血哺乳动物的癌症的药学组合物，包含治疗上有效量的烯丙胺衍生物及药学上可接受的载剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述烯丙胺衍生物选自特比萘芬(terbinafine，TB)、布特萘芬(butenafine)及萘替芬(naftifine)。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述烯丙胺衍生物为特比萘芬(terbinafine，TB)。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述烯丙胺衍生物可诱发温血哺乳动物内抗癌蛋白质。

5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述抗癌蛋白质包括p53、p21/Cipl及p27/Kipl蛋白質。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述烯丙胺衍生物可抑制温血哺乳动物内与细胞周期调节蛋白质(cyclin)有关的蛋白质。

7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述与细胞周期调节蛋白质(cyclin)相关的蛋白质包括：细胞周期调节蛋白质(cyclin)A2、细胞周期调节蛋白质(cyclin)B、细胞周期调节蛋白质(cyclin)D3、细胞周期调节蛋白质(cyclin)依赖性激酶2、以及细胞周期调节蛋白质(cyclin)依赖性激酶4。

8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述烯丙胺衍生物的含量大于1μM。

9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述烯丙胺衍生物的含量约1μM至约150μM。

10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述癌症包括结肠癌、肝细胞癌及血癌。

11.根据权利要求1所述的组合物，其中所述癌症包括结肠癌及肝细胞癌。

12.根据权利要求1所述的组合物，其中所述癌症为结肠癌。

13.根据权利要求1所述的组合物，其中所述烯丙胺衍生物是与活性剂组合地投药到所述哺乳动物。

14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述活性剂选自依波士龙(epothillone)、阿苯达唑(albendazole)、苯硫咪唑(fenbendazole)、诺考达唑(nocodazole)、甲基丁基苯并咪唑-2-基胺基甲酸酯(parbendazole)、甲苯达唑(mebendazole)、丙氧苯咪唑(oxibendazole)、多菌灵(carbendazim)、噻菌灵(thiabendazole)及苯并咪唑(benzimidazol)。

15.根据权利要求13所述的组合物，其中所述活性剂为诺考达唑(nocodazole)。

16.根据权利要求13所述的组合物，其中所述烯丙胺衍生物与这种活性剂的比例约为10000∶1。

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