CN1571927A - 自改造细胞制取的血液血清学灵敏度控制物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种血型测定的灵敏度控制物制备方法,包括将一定数量的抗原溶解于水中,制得浓度确定的抗原溶液,并将此溶液与细胞接触,使抗原分子插入细胞膜内,或者将此溶液与经插入连接分子修饰的细胞接触,使抗原分子通过连接分子与细胞膜结合,得到改造细胞。淋洗改造细胞,并配成溶液,测定此溶液浓度,使其可用作血型测定的灵敏度控制物。
Description
技术领域
本发明涉及人工改造细胞的应用,这些细胞表达血型(或相关血型)抗原,可用于免疫血液学/血液学/免疫学/血清学检验的灵敏度控制。本发明尤其涉及使用一些输液用药物时的灵敏度控制,这些药物由插入A抗原和/或B抗原的细胞制备。
背景技术
血站的一项重要职能是检测血液以准确测定提供血液(或其它制品)者的血型。血液分型的知识在一些治疗过程中极为重要,例如输血、器官移植、新生儿溶血症的治疗等。尤其在输血前,供血者血型必须提前被检测出来。血型错配可造成灾难性的后果,可能导致受血者死亡。
在输血血清学中,ABO血型系统代表了人类红细胞(RBCs)表面最重要的几种抗原。人类的血型归属于下列四种主要的血型之一:A,B,AB和O型。各血型的红细胞分别携带A抗原、B抗原、同时有A、B抗原、或者不表达任何抗原。针对红细胞不具有的抗原,体内天然存在其抗体,即A型血的人,体内存在抗B抗体;B型血的人则存在抗A抗体;O型血的人,则同时存在抗A和抗B抗体;AB血型的人,则不存在任何血型抗体。在输血前,必须先进行交叉配型(既可直接用供血者血液与受血者血清进行测试,亦可根据受血者医疗纪录对供血者血液进行电子配型),以保证不将某型红细胞输入存在其抗体的受血者体内。
使用含有已知抗体的试剂检查红细胞的抗原,称为正向定型;使用携带已知抗原的红细胞检查血清中的抗体,称为反向定型。
从1980年代开始,单克隆抗体(MAbs)被使用于血液分型。相较于传统的多克隆抗血清,单克隆抗体可以增加检测的特异性、提供持久的反应性,以及在大多数情况下,可以增加检测的效能。
分型系统(例如胶卡等)以及试剂的常规质量控制在血站实验室中是必备的,因为分型系统以及试剂有可能在运输、储藏或者在使用过程中由于污染而损失特异性和/或效能。
单克隆抗体也被用于鉴定ABO血型系统的各种自然变异,包括A和B型的各个亚型。为保证正确的鉴定,血站实验室中的单克隆分型试剂及其分型系统必须用红细胞标准品进行质量控制。为达成这个目的,血型抗原表达弱的红细胞更适于用作这样的比较试剂。这是因为在检测血型抗原弱表达的表现型时,抗血清的效能能够更好地表现出来。
天然存在着各种ABO亚型的抗原弱表达红细胞。A/B抗原浓度在各种细胞表现型中存在变异,通常这种变异是未知的,除非开展更为深入的分析。
由于具有亚型表现型的个体的出现频率非常低,因此将抗原弱表达的红细胞作为对照试剂是难以实施的。例如,据估计A型血的Ax表现型在人群中的出现频率为0.003%,其他亚型的频率甚至更低。因此,人造的弱表现型红细胞能用于满足此目的。
将O型红细胞人工改造成A型、B型或者AB型红细胞,能够获得相似的血清学弱表现型。这些抗原的表达量可以通过改变插入条件来控制,譬如,插入抗原的浓度、和/或红细胞和待插入抗原的比例、人工合成抗原的加入量等等。插入的抗原在特定的条件下,能够在红细胞膜上保持稳定至少六周,亦有可能更长。
当前,用于检测糖基化抗原弱表达细胞的单克隆抗体,其血清学灵敏度的检测可通过几种方法进行:
1.用天然存在的弱表达亚型细胞来检测。这种方法需要寻找此种稀有亚型,并制备该亚型细胞备用,然后用作对照。
2.使用正常细胞进行检测。这种方法检测普通细胞,但不能指示单克隆抗体的灵敏度。
3.稀释单克隆抗体来测定其效能。这种方法将抗体稀释,用正常抗原来进行检测。此法在缺乏真实对照时,最为常用。
鉴于天然弱表达亚型的低出现频率,其获得和供应均十分困难。此外,这些抗原弱表达细胞在个体间亦存在变异。这种天然细胞的稳定供应是困难的,甚至是不可能的。进一步说,弱表达亚型的发生频率在不同人群中也是不同的。
正常细胞表达高水平的抗原,举例来说,在单个红细胞表面,表达多于500,000个拷贝。当检测这些细胞时,通常抗体要被稀释,以显示在低浓度时,抗体依然能够和红细胞发生反应,并给出血清学阳性结果。稀释抗体浓度来检测其灵敏度的方法较费时。其实验结果可以用于推断正常浓度时抗体能够检测出抗原的最低水平。这种有漏洞的方法很遗憾地实际应用于大多数场合。只有经常性地花费时间稀释抗体,或者使用弱表达亚型时,才可能检测出试剂本身的损坏。
在进行单克隆抗体稀释的过程中,还可以有其它问题。单克隆抗体经常是由双克隆的抗体混合而成,并经调整而显示特异的抗体特性,众所周知某些克隆在检测ABO亚型时效果可能较另外一些要好,因此抗体通常是单克隆抗体的混合物。对这样的抗体进行稀释,将会破坏其内在的抗体特性,以至于不能真实地反映抗体的表现。另外,许多单克隆抗体被混合并预先载入测试卡系统(如胶卡),因此不能再用稀释的方法进行检测。
当前,许多实验室并不对他们的ABO分型系统抗体进行灵敏度控制。他们仅仅是依赖生产厂家提供的说明和这些抗体以往的表现。或者,实验室仅仅是使用前述的三种方法,每周或每月对一个批号的抗体进行测试。此外,有很多实验室还依赖于文献报道的结果,文献报道了某次偶然的输血,将一种弱表达亚型的血液输入血型不相容的受血者体内,提示这样的事件不是致命的。以往,交叉配型(用供血者的血液与受血者的血清反应)能够检测出错配的弱表达亚型与受血者之间的不相容性。然而,近年来,交叉配型在许多血液中心已不再进行,取而代之的是只对供血者和受血者血液进行检测。所以,正确配型显得更为重要。不对抗体进行检测将忽略一些问题,例如抗体被损坏,或由于不进行交叉配型而使得临床上重要的亚型可能被错配。这种错配将造成中等到严重程度的输血反应。
因此,对抗体灵敏度质量控制的要求是明显的。使用携带已知表达量抗原的细胞来检测抗体或检测系统,来给出一个准确的、标准的血液分型鉴定。
本发明的目的在于提供一种用于血型测定的灵敏度控制试剂,,或者至少提供一个可用的备选。
发明概述
本发明的一个方面,提供了一种血型鉴定灵敏度控制物的制备方法,包括:
●将一定量的抗原溶解于水中,亦可选择加入一种或多种可溶性盐,得到一定浓度的抗原溶液;和
●将抗原溶液与已知浓度的液态细胞溶液接触一段时间,在可使抗原分子能够插入细胞膜中的温度,形成人工改造的细胞;或者
●将抗原溶液与已知浓度的液态细胞(已经过修饰,在膜上插入了连接分子)溶液接触一段时间,在可使抗原分子能够和连接分子结合的温度,形成人工改造的细胞;和
●用洗液洗涤经改造的细胞,并将洗后的改造细胞悬浮于水中,亦可选择加入一种或多种可溶性盐,得到改造细胞的溶液;和
●测定改造细胞的浓度,并调整浓度使其能够用于血型检测时的灵敏度控制。在本发明的一个具体方案中,不对溶液中的细胞本身进行改造,改造细胞含直接插入细胞膜内的抗原分子。
本发明的另一个具体方案中,溶液中的细胞膜上插入连接分子,改造细胞含由连接分子结合于细胞膜上的抗原分子。
本发明中使用的细胞可以使用任意类型的细胞,包括动物细胞、植物细胞、细菌细胞或者拥有人造细胞膜的囊泡。然而,使用动物细胞更为理想。动物细胞中,人类的红细胞则更好。
连接分子最好具有一条脂肪链尾巴,以及一个“桥”结构连接脂肪链尾巴和抗原分子。
连接分子最好具有一个生物素化的糖脂结构。举例来说, “桥”结构可以由一个生物素-卵白素结构来实现。
抗原最好是一个糖脂,或者是一个生物素化的糖。这个糖脂最好血型相关的,例如A、B、H、Lewis或Gal(alpha)鞘糖脂。生物素化的糖最好也是血型相关的,例如A、B、H、Lewis或Gal(alpha)。
本发明的第二方面,提供了一个使用第一方案方法改造后的细胞系。
另一方面,本发明提供了一套检测血型鉴定抗体灵敏度质量控制的方法或系统,包括:
●将一定量的经第一方面程序制得的灵敏度控制物与抗体或检测系统接触,在经改造细胞和抗体或血型检测系统中含有的植物凝集素之间发生抗原-抗体反应
●检测抗原-抗体反应水平
●鉴定抗体或血型检测系统的灵敏度抗原-抗体反应水平可直接通过测定凝集程度,或者诱导凝集来检测。诱导凝集反应可以通过使用增强反应、使用抗-抗体或使用酶来实现。
检测方法最好是用酶标法、核素标记法或荧光标记法。
本发明的另外一方面系使用本发明第一方面的成果,对血液分型过程中使用的多种抗体或者检测系统的效果进行检验。
本发明尚提供了一个试剂盒,包含了血型测定所需要用到的各个组分,且此试剂盒中包括了一个检测抗体灵敏度的部分。
附图的简要说明
图1是流式细胞仪的测试结果,显示了改变含Leb抗原的糖脂数量,对体内转化大鼠外周红细胞的效果,使用抗Leb抗原为一抗。
图2是流式细胞仪的测试结果,显示了改变反应时间(1到12天)对体内转化大鼠外周红细胞的效果,使用抗Leb抗原为一抗。
图3是流式细胞仪的测试结果,显示了改变反应时间(16到28天)对体内转化大鼠外周红细胞的效果,使用抗Leb抗原为一抗。
图4是流式细胞仪的测试结果,显示了37℃下,改变反应时间(0到8小时)对体外转化红细胞的效果,使用两种不同的抗Leb抗原为一抗。
图5是流式细胞仪的测试结果,显示了22℃(RT)下,改变反应时间(0到8小时)对体外转化红细胞的效果,使用两种不同的抗Leb抗原为一抗。
图6显示了改变红细胞体外改造时间后流式细胞仪的实验结果。红细胞在4℃,与两个不同的抗Leb抗体共同孵育0小时-7小时。
发明详述
尽管以下阐述将主要针对鞘糖脂抗原,其他类型的抗原,包括糖脂和人工合成抗原同样被本发明所涵盖。这里的名词“抗原”亦包括经过改造的抗原,例如拥有黏附分子的抗原,使其能够与连接分子结合。举例来说,如果连接分子以生物素结尾,那么抗原就应该是一个卵白素结合的抗原。
连接分子可以是能够连接抗原和插入细胞膜内的脂肪链的任意分子。一个典型的连接分子具有一个糖链部分,并经过“桥”结构与脂肪链相连,譬如生物素—卵白素“桥”。其他的“桥”结构,可以是基于螯合作用结合的结构。
为了避免疑问,本文中提到的细胞溶液均指细胞悬液。
糖脂作为血型抗原可被红细胞从胞浆中摄取。这个知识部分来源于对Lewis系统的研究。胞浆和红细胞细胞膜之间可进行脂质交换,并且胞浆中和细胞膜内磷脂和脂肪酸的比例相似。所以,胞浆中具有Lewis或ABH结构的鞘糖脂,被吸收进入红细胞的细胞膜。
插入技术系基于已经证实的原则:糖脂抗原能够插入红细胞细胞膜而不引起细胞损伤。插入的抗原数量可以被控制,因此能够制备得具有特异抗体特性的细胞。这些细胞可以模拟天然的弱表达亚型或者非天然的表达血型抗原的细胞。
插入细胞膜的抗原数量可以根据用户的需要进行设定。不同水平的插入数量是可能的,举例来说,5%,10%,20%或1000个拷贝,5000个拷贝/个红细胞都是可行的。可以把数量设置在临床检测的阈值,在这个数量时,临床上不能检测出来,而有可能导致严重的输血反应。也可以把数量设置在肯定可以检测出弱表达亚型的水平上。这些设置可以保证ABO分型的有效性,因为它们使抗体的灵敏度水平变得明确了。这就可以保证更安全的进行输血措施。
本发明中的灵敏度质量控制部分在测定抗体灵敏度和/或检测系统灵敏度时,都是有用的,包括对胶卡的检测。
用于输液药物的弱表达亚型灵敏度控制,是通过O型细胞制备的。将一定数量的A和/或B抗原被插入,以便在抗原检测反应中给出特定的反应分数。这些反应包括板法、试管法、胶卡和微板法,和任何使用凝集反应的手动或自动平台,或者其他任何抗原检测的方法(例如,酶联免疫测定、流式细胞仪等)。
尽管本发明更倾向于使用人的红细胞,其他动物的红细胞也可以使用。作为补充,当下文中提及红细胞时,其他细胞如血小板、白细胞、植物细胞、细胞系、细菌细胞和人造细胞膜都可以被使用。
插入抗原的红细胞既可以在体外,也可以在体内制备,既可以使用人的红细胞,也可以使用其他动物的细胞。体内制备细胞,需要将一定数量的抗原注射进入人或其他动物的循环系统,然后立刻取血或者等待一段时间。后一种方法将减少插入抗原的数量(一个天然效价)。这种体内的方法可以制备某些抗原,而对另外一些则不能。举例来说,由于动物红细胞不表达人类的Kell、Duffy、Rhesus和Kidd抗原,故可以用来制备鉴定这些抗原时需要的红细胞。
凝集反应是检测抗原的一个手段。凝集反应是由于红细胞通过抗体或植物凝集素与其他细胞上的抗原交联导致形成团块状而引起。凝集反应可以进行可视化(用肉眼)或用血型分析仪自动读数。可以根据下表对凝集反应进行手工评分:
凝集反应评分 观察值
- 未见凝集
(+) 不能决定是否凝集
Vw 非常微弱的反应—需借助光学仪器
W或+w 微弱—非常小的团块
+ 很小的团块
++ 一些小团块
+++ 一个大团块,周围有小团块
++++ 一个单个的大团块
插入反应中A型抗原或B型抗原溶液的浓度越高,插入O型红细胞的抗原数量就越大,在凝集反应中,表现为红细胞与抗A和抗B抗体之间的凝集反应增强。插入反应中A型抗原或B型抗原溶液的浓度越低,插入O型红细胞的抗原数量就越少,表现为红细胞与抗A和抗B抗体之间的凝集反应减弱。插入抗原的数量与糖脂的浓度和/或温度和/或反应时间成正比。
红细胞可以用短链或者长链的糖脂来改造。然而,在检测抗体灵敏度时,糖脂链的长短并不造成血清学上明显的差异。用特异的抗血清进行检测时,观察到相似的凝集反应。红细胞可以用ABO系统中的特异组分来进行改造。例如,可以制备表达A抗原(例如ALeb或A3型)的红细胞。这些细胞在检测特定抗体的特异性时很重要,并可用于筛选单克隆抗体。
红细胞浓度和糖脂浓度之间比例的效果体现在,比例为1∶1和3∶1时,可导致高效的O型细胞改造,并在与抗A和抗B抗体的反应中获得强的凝集反应评分。4∶1或者更高的比例将导致插入抗原数目的减少。在特定条件下,3∶1的比例是最为经济的。当然,当需要制备弱表达表现型时,可以升高红细胞的比例。
浓缩的糖脂溶液可以在两小时内有效地将抗原插入红细胞膜。孵育时间更长,效果更好,尽管时间太长(超过32小时),可能会造成血清学损害(见例5)。这种损害被认为是由于在37℃的长时间孵育导致的红细胞受损,而不是抗原的损失。
插入反应所需的时间与抗原溶液浓度和细胞溶液浓度之间的比例以及温度有关。然而,推荐抗原溶液浓度为10mg/ml,细胞溶液浓度与之比例应为3∶1,温度控制在25℃,反应时间约4小时。
改变插入反应的条件即可控制红细胞携带的抗原数量。若需要弱表达的A型或B型细胞,则应配制低浓度的糖脂或高浓度的细胞溶液∶糖脂的比例即被用于插入反应。若需要较强的凝集反应,则应配制高浓度的糖脂或低浓度的细胞溶液∶糖脂比例可被用于产生最强的血清学反应。通过操纵糖脂的浓度,红细胞可被改造成携带超过20倍于正常抗原数量的细胞。
本发明的主要优点是抗原表达数量可以控制,以满足特异灵敏度的需要。例如,一个细胞可以携带与临床上重要水平相应的抗原数量。然后,如果此细胞的血清学检验呈现阳性,用户能够保证他们不会错过任何临床上重要的亚型。
另外一些细胞携带的抗原数量可以设定为抗原的特异阈值,例如,细胞可以携带不同亚型的抗原,调整到已知的灵敏度水平。这些细胞可以用来校准高灵敏度的仪器或者用于流式细胞仪的抗原定量标准曲线制定。
本方法学可使细胞做到全球化的标准化和一致性。即可用来比较不同实验室的表现或不同方法学的比较。将这种细胞用于输血血清质量保证计划能够设定ABO分型的质量控制标准。
工业上强烈要求对灵敏度的控制标准。这种重要性将被放大,因为在病理学界,正在推动一场针对实验室的运动,这些实验室拥有具备多种技能的实验员,但他们却不具备丰富的输血经验。
本发明中的灵敏度控制部分,包括一个弱表达A型表现型和一个弱表达B型表现型。进一步提出,一个可以携带Rh DCce(R1r),另一个可以是Rhce(rr)。这就可以保证用于ABO和RHD分型的抗体都能够用相同的两套细胞进行质量控制。而另外一套携带弱表达AB抗原的细胞能够用于更为专业化的实验室。作为替补,不表达特定人类抗原的动物细胞也可以使用。例如,一些动物细胞即等同于无Rh抗原的人红细胞。
一些实验室卓有成效地开展ABO和RhD分型的质量控制,但另外一些则不然。一些实验室生产内部使用的用于ABO和RhD分型质量控制的细胞(A2B R1r,Orr)。然而,由于供血者表现型的杂合性,使得这些产品具有一定程度的变异性。本发明的灵敏度控制部分就没有这个缺点,因为抗原表达的减弱是很精确的,也没有变异发生,且制备方便。
本发明进一步的优点是,包含抗原的用于插入反应的液体,可以挥干,并保存,在很长时间内不会损坏抗原。当需要制备小量的特定细胞(譬如B型细胞)时,就可以重新配置这个液体并把它加入细胞中。这种产品尚未面世
实施例
以下实施例用以简单地阐释本发明的应用,但并不限制本发明的应用。
实施例1
糖脂插入溶液按照以下方法制备:
●干糖脂溶于氯仿∶甲醇(2∶1)混合液中,并调浓度至20mg/ml
●200ul的糖脂溶液被移入玻璃试管中,并用氮气挥干
●300ul甲醇∶水(1∶1)混合液被加入到挥干后的糖脂中。37℃水浴加热助溶。
●玻璃试管的100ul处做一刻度,用氮气在60℃下挥干糖脂溶液,使液面降低至此刻度以下。此步骤使原溶液中的大部分甲醇被挥干,而使糖脂溶解在水中。
●10ul 10×PBS溶液(磷酸缓冲液)被加入试管中,调节盐浓度。
●加去离子水至100ul刻度处。
实施例2
按照如下方法,将糖脂插入红细胞膜:
●40mg/ml的糖脂插入液5ul被加入玻璃培养管中
● 15ul Celpresol和40ul O型红细胞被加入该玻璃管中
●玻璃管在37℃下孵育,时时震荡
●转化后的红细胞用0.9%的生理盐水淋洗6次,然后用Celpresol溶液重悬,调浓度至5%
Celpresol是一种保存红细胞的试剂,购自CSL Bioscinces,Adelaide,澳大利亚。不过,生理盐水或其他等渗溶液,或者其他保存细胞的试剂(如CellStab)也可使用。
实施例3
这个例子使用本发明方法制备的改造细胞测试了一个抗血清:
1.转化后的红细胞用0.9%的生理盐水淋洗3次。在试管中加入Celpresol调红细胞悬液浓度为5%。
2.25ul的红细胞悬液被加入一个小玻璃管中。再加入25ul的抗血清。
3.充分混合红细胞悬液和抗血清,并用免疫离心机(immunofuge)离心15秒。
4.读取凝集反应结果,并评分。
实施例4
本例使用本发明方法制备的改造细胞测试了血清学表现型抗体。下表中列出的抗体并不完全,本发明制备的产品亦可用于其他抗体的检测。本例中使用的一些抗体已经过期,仅用于演示。
抗A抗体:
名称 | 生产厂家 |
Bio-Clone(Blend) | Ortho Diagnostic,USA |
Biolab(human)1 | Biological Laboratories,NZ |
Biolab(human)2 | Biological Laboratories,NZ |
Biolab | Biological Laboratories,NZ |
Epiclone 1 | CSL,AUS |
Epiclone 2 | CSL,AUS |
Epiclone 3 | CSL,AUS |
Epiclone 4 | CSL,AUS |
Gamma-clone 1 | Gamma Biologicals,USA |
Gamma-clone 2 | Gamma Biologicals,USA |
Immucor | Immucor,USA |
Lorne | Lorne Laboratories,UK |
MonoClone | Organon Teknika B.V.NL |
Novaclone | Dominion Biologicals,Canada |
Ortho | OCD,USA |
Seraclone 1 | Biotest AG,Dreieich |
Seraclone 2 | Biotest Diagnostic,Dreieich |
*CSL | CSL,AUS |
*XXX1 | Confidential |
*XXX2 | Confidential |
抗B抗体:
名称 | 生产厂家 |
Biolab(Human) | Biological Laboratory,NZ |
Biolab | Biological Laboratory,NZ |
BioClone(blend) | Ortho Diagnostic,USA |
Epiclone 1 | CSL,AUS |
Epiclone 2 | CSL,AUS |
Gamma-clone | Gamma Biologicals,USA |
Immucor | Immucor,USA |
Lorne | Lorne Laboratories,UK |
Monoclone | Organon Teknika B.V.NL |
Novaclone | Dominion Biologicals,Canada |
Seraclone | Biotest AG,Dreieich |
*CSL | CSL,AUS |
*XXX3 | Confidential |
*XXX4 | Confidential |
*XXX5 | Confidential |
表示正在开发中的抗体
抗B抗体:
名称 | 生产厂家 |
Biolab(Human) | Biological Laboratory,NZ |
Biolab | Biological Laboratory,NZ |
Gamma(blend) | Gamma Biologicals,USA |
Immucor | Immucor,USA |
Seraclone 1 | Biotest Diagnostics,Dreieich |
Seraclone 2 | Biotest Diagnostics,Dreieich |
实施例5
糖脂插入反应所需时间,系用以下方法进行研究。180ul O型红细胞溶液被分别加入60ul的9.6,4.8,2.4,1.2和0.6mg/kg的含长的A型抗原链或短的B链的糖脂溶液中。在孵育1,2,4,8,24和72小时后,从上述溶液中移出25ul。在获得的转化细胞上进行血清学检测。检测结果在表1和表2中列出。
表1. 插入反应孵育时间的研究:用Bioclone公司生产的抗A抗体测试用中性A糖脂转化的O型红细胞
转化基质中
A型糖脂的 孵育时间(小时)
浓度
(mg/ml) 1 2 4 8 24 32 48 72
9.6 +++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
4.8 +++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++
2.4 ++ +++ +++ +++ +++ ++++ +++ +++
1.2 - + + + ++ +++ ++ ++
0.6 - - + + + ++ ++ ++
表2.插入反应孵育时间的研究:
用XXX5抗B抗体测试用中性B糖脂转化的O型红细胞
转化基质中
B型糖脂的 孵育时间(小时)
浓度
(mg/ml)1 2 4 8 24 32 48 72
9.6 + ++ +++ +++ +++ ++++ +++ +++
4.8 + ++ +++ +++ +++ ++++ +++ +++
2.4 - + + + +++ ++ +++ +++
1.2 - - - - - - ++ ++
0.6 - - + - - - - -
实施例6
使用不同体积的O型红细胞悬液分别与相同体积的9.6mg/ml的含长的A型抗原链或短的B链进行反应。结果总结在表3中。红细胞悬液体积与糖脂溶液体积比为3∶1时,其效率与比例为1∶1时相同。当比例上升至4∶1,5∶1和6∶1时,转化效率反而下降。
表3.红细胞悬液和糖脂溶液体积比例的研究。用抗A或抗B抗体测试不同体积的O型红细胞悬液和A型或B型糖脂反应时的效果。
红细胞悬液和糖脂 插入的B抗原与抗B抗体反
插入的A抗原与抗A抗体反应
溶液体积比例 应
1∶1 ++++ ++++
2∶1 ++++ ++++
3∶1 ++++ ++++
4∶1 ++ +++
5∶1 ++ ++
6∶1 ++ ++
抗A抗体购自Bioclone;抗B抗体购自CSL
实施例7
使用本发明方法制备的转化红细胞(插入了A和B型糖脂),测试了大批抗A、抗B和抗AB抗体结合红细胞的效能。红细胞在插入反应完成当天,即被用于测试。
用不同生产厂家生产的抗A抗体检测插入A型糖脂的红细胞,结果在表4中列出。
表4. 用抗A抗体检测插入A型糖脂的红细胞,结果按照评分高低顺序排列
转化基质中糖脂的浓度(mg/ml)
生产厂家
9.6 7.2 4.8 3.6 2.4 1.9 1.2 0.6
*XXX2 +++ ++++ ++++ +++ +++ ++ ++ ++
+
Bio-Clone +++ +++ +++ +++ ++ ++ + -
+
Seraclone +++ +++ +++ ++ + + W -
+
*CSL +++ +++ +++ ++ ++ + - -
+
Novaclone +++ ++ ++ + - - - -
*XXX1 +++ ++ ++ + + - - -
Orhto ++ ++ + W - - - -
Epiclone 1 ++ + + - - - - -
Epiclone 2 + + - - - - - -
Lorne + W W - - - - -
Gamma-clone 1+ - - - - - - -
Seraclone 1 + - - - - - - -
Immucor + - - - - - - -
Epiclone 1 + - - - - - - -
Biolab + - - - - - - -
(human)1
Monoclone W - - - - - - -
Biolab - - - - - - - -
Biolab(human - - - - - - - -
) 2
*处于开发中的抗体。
不同生产厂家提供的抗体(有些已经超过了保质期),凝集反应评分差异很大。从表4中可以看出,当插入的A糖脂浓度为9.6mg/ml时,一些抗A抗体可以有4个+或3个+的表现,而其他一些则只有1个+或没有凝集反应发生。在0.6mg/ml浓度时,只有XXX2抗体能够检测到插入的抗原。
用不同生产厂家生产的抗AB抗体检测插入A型糖脂的红细胞。结果在表5中列出。这些抗体在与转化后红细胞的反应中,也呈现不同的凝集反应评分。
表4.用抗AB抗体检测插入A型糖脂的红细胞
转化基质中糖脂的浓度(mg/ml)
生产厂家
9.6 7.2 4.8 3.6 2.4 1.9 1.2 0.6
Immucor +++ ++ ++ + + - - -
Gamma-clone +++ ++ ++ + + - - -
Seraclone ++ ++ ++ W - - - -
Biolab ++ ++ ++ W - - - -
Biolab(human ++ + + - - - - -
)
Seraclone ++ + + - - - - -
用不同生产厂家生产的抗B抗体检测插入B型糖脂的红细胞,结果在表6中列出。
表6.用抗B抗体检测插入B型糖脂的O型红细胞,结果按照评分高低顺序排列
转化基质中B型糖脂的浓度(mg/ml)
生产厂家
9.6 7.2 4.8 3.6 2.4 1.9 1.2 0.6
*CSL +++ +++ +++ +++ ++ + + -
*XXX5 ++ ++ ++ + + - - -
*XXX3 ++ ++ ++ + - - - -
Bioclone + + W - - - - -
Biolab W - - - - - - -
Biolab(human - - - - - - - -
)
Epiclone - - - - - - - -
Epiclone - - - - - - - -
*XXX4 - - - - - - - -
Novaclone - - - - - - - -
Monoclone - - - - - - - -
Gammaclone - - - - - - - -
Seraclone - - - - - - - -
Immucor - - - - - - - -
Lorne - - - - - - - -
*处于开发中的抗体
只有很少的一些抗B抗体能够检测到插入的B型抗原。在这部分抗体中,只有Bioclone的产品是商品化的。其他抗体尚处于开发之中。
用不同生产厂家生产的抗AB抗体检测插入B型糖脂的红细胞,结果在表7中列出。
表7.用抗AB抗体检测插入B型糖脂的O型红细胞
转化基质中B型糖脂的浓度(mg/ml)
生产厂家
9.6 7.2 4.8 3.6 2.4 1.9 1.2 0.6
Biolab(human +++ ++ ++ + + - - -
)
Biolab + W W - - - -
Immucor - - - - - - - -
Seraclone - - - - - - - -
Seraclone - - - - - - - -
Gamma-clone - - - - - - - -
只有Biolab生产的抗AB抗体能够检测到插入的B型抗原。这是一个抗人A+B抗原的多克隆抗体,目前已不再进行商品化提供。
实施例8
含Leb抗原的糖脂也可以被插入红细胞膜上。将Leh糖脂悬浮于基质中,并按照不同比例与红细胞混合,37℃孵育2小时。结果列出于表8。
表8.不表达Leb抗原的细胞,对Leb抗原的摄入量
红细胞Leb:红细胞(v∶v)与抗血清的即刻反与抗血清的反应一周
应
Leb抗体 Laa抗体 Leb抗体 Laa抗体
插入前仅携
带Laa抗原,
不携带Lab抗
原
插入前 - ++ - ++
插入后 1∶2 ++ ++ +++ ++
1∶3 ++ ++ +++ ++
1∶5 ++++ ++ +++ ++
1∶7 ++ ++ +++ ++
1∶10 ++ ++ +++ ++
插入前不携
带Laa抗原和
Lab抗原
插入前 - - - -
1∶2 + - ++ -
1∶3 ++ - ++ -
1∶5 +++ - ++++ -
1∶7 ++ - ++ -
1∶10 ++ - ++ -
实施例9
本例讲述了流式细胞仪分析的程序。
流式细胞仪分析在一台Facsort仪器(Becton Dickinson,San Jose,CA)上进行,使用Lysis II软件进行操作。淋洗过的大鼠红细胞用20倍体积的10%福尔马林溶液固定,并在室温下孵育过夜。固定后的细胞用PBS淋洗4遍,在与Lewis抗体孵育前,使用配制在缓冲液1(含50mMNaCl的磷酸缓冲液,PH值8.0)中的0.5%BSA溶液,调细胞终浓度为5×106细胞/ml。参照Murai等(Clinical Chimica Acta,1994,226,21-28)的方法制定荧光标记条件。分析时,将100ul固定后的红细胞悬液与100ul抗Leb抗体(Gamma 25-1,GammaBiologicals inc.,Tx,用缓冲液1进行1∶2稀释)4℃孵育1小时,用1ml缓冲液1淋洗2次,然后与100ul生物素标记的抗鼠IgM(E0465,DakoA/s,Denmark;与缓冲液2进行1∶400稀释,缓冲液2系含有200 mMNaCl的磷酸缓冲液,PH值8.0)4℃孵育1小时。标记好的细胞用1ml缓冲液2淋洗2次,与100ul的链霉蛋白抗生素(R0428 Dako A/s,与缓冲液3进行1∶15稀释,缓冲液3系含有200 mMNaCl的磷酸缓冲液,PH值7.0),在4℃孵育10分钟,用缓冲液3淋洗,并重悬于500ul的缓冲液3中。流式细胞仪分析持续一小时,每个样本中各有5000各细胞被计数。
实施例10
大鼠外周红细胞的体内转化,可根据下法实现。
选用体重250-300g的雄性同系Lewis大鼠。这些大鼠不表达Lea或Leb糖脂抗原。
糖脂乳化成输液用乳剂,含有20%的大豆油,1.2%的卵磷脂/蛋白,和22%的甘油(重量体积比)。
用13.3ug/ul的储备液连续稀释,制备浓度范围在0.03到2.0mg/150的糖脂溶液。用8%的水合氯醛3.3ml/kg麻醉动物,手术暴露动物颈静脉,将150ul上述制得的乳剂输入静脉中。然后缝合手术部位。
24小时后取血。将动物放置于灯泡下保持体温,止血钳夹住动物尾巴,用微量注射器次入尾静脉中,取出约50ul血液。遂用离心方法从全血中获取红细胞,淋洗三次。其他细胞(如血小板、白细胞)亦可用其他适宜技术分离。开展血清学和流式细胞仪分析,结果见实施例A到C。
实施例A
用抗Leb抗体测试体内转化得到的红细胞。给大鼠静脉注射不同剂量的Leb-6糖脂。按照表9中列出的时间点取血。抗Leb抗体与红细胞凝集反应的严重程度从无(-)到很强(++++)。
表9 注射糖脂后,按时间点取血,并进行血清学检测
大鼠 | Mg | 1 | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 | 12 | 14 | 16 | 18 | 20 |
Leb | ||||||||||||
a | 2.0 | ++++ | +++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | ++ | ++ | ++ |
b | 1.0 | +++ | ++++ | +++ | ++++ | +++ | +++ | ++++ | +++ | ++ | ++ | ++ |
c | 0.50 | ++ | ++ | ++ | ++ | +++ | +++ | +++ | ++ | + | + | + |
d | 0.25 | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ | + | - | - | - |
e | 0.10 | + | + | + | + | - | - | - | - | - | - | - |
f | 0.05 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
g | 0.03 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
h | 0 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
大鼠 | Mg | 22 | 24 | 26 | 28 | 30 | 32 | 34 | 36 |
Leb | |||||||||
a | 2.0 | ++ | ++ | ++ | ++ | + | + | - | - |
b | 1.0 | ++ | ++ | ++ | + | - | - | - | - |
c | 0.50 | + | - | - | - | - | - | - | - |
d | 0.25 | - | - | - | - | - | - | - | - |
e | 0.10 | - | - | - | - | - | - | - | - |
f | 0.05 | - | - | - | - | - | - | - | - |
g | 0.03 | - | - | - | - | - | - | - | - |
h | 0 | - | - | - | - | - | - | - | - |
实施例B
用流式细胞仪分析体内糖脂抗原和抗Leb抗体之间的反应。给不同大鼠注射不同剂量的Leb糖脂抗原,一天后取血。结果见图1。血清学结果呈阳性的区域表示为1个+到4个+。注射最大剂量(2mg)的糖脂用于转化后,即呈现黑色填充的曲线。在2mg曲线左侧的未填充的曲线表示糖脂数量下降时,获得的血清学结果。用于本试验的糖脂剂量为2mg,1mg,0.5mg,0.25mg,0.13mg,0.06mg,0.03mg和0mg.
实施例C
流式细胞仪技术,使用抗Leb抗体分析体内转化的大鼠红细胞。给大鼠注射2mg的Leb糖脂抗原,并在第1,2,6,8,10,12,16,18,20,22,24,26,28天采血。最大程度的转化可见于黑色填充的曲线。在图2中,结果按照抗原表达数量的降序排列,即从右向左排列时,天数分别是第1,2,6,8,10,12,14和阴性对照。在图3中,则是第16,18,20,22,24,26,28和阴性对照。
实施例11
家兔外周红细胞可用以下方法进行体内转化。
按如下方法制备糖脂:将从小肠中获得的200mg总糖脂(Ale(a-b+)型)溶于100ul的热乙醇中。热的脂肪乳剂(pharmacia出品)2ml在经过简单的超声处理后加入前述溶液中。糖脂抗原经耳缘静脉缓慢注射。在注射前后均对家兔进行取血(大约0.2-0.5ml),随后用抗-Lewis抗体(抗Leb抗体,GammaBiological LBM26-1和抗Lea抗体,Gamma Biological LAM25-1)进行血清学检测(见实施例D)。在后期的实验中,仍可对之前的样本重新进行检测,作为对储存细胞稳定性的研究。细胞4℃保存在红细胞保存溶液中(Celpresol,CSL Austrilia)。
实施例D
表10.MO家兔的血清学检测
取样日期 | 第n天 | 测试日期 | 抗Leb抗体 | 抗Lea抗体 |
前(10月5日) | -1 | 10月12日 | - | - |
前(10月5日) | -1 | 10月8日 | - | - |
注射即日(10月6日) | 0 | 10月12日 | - | - |
后(10月7日) | 1 | 10月8日 | +++ | - |
后(10月7日) | 1 | 10月12日 | +++ | - |
后(10月9日) | 3 | 10月12日 | +++ | - |
后(10月11日) | 5 | 10月12日 | +++ | - |
后(10月11日) | 5 | 10月17日 | +++ | - |
后(10月11日) | 5 | 10月24日 | +++ | - |
后(10月16日) | 11 | 10月17日 | +++ | - |
后(10月16日) | 19 | 10月25日 | +++ | - |
表11.BK家兔的血清学检测
取样日期 | 第n天 | 测试日期 | 抗Leb抗体 | |
前(8月8日) | 8月8日 | - | ||
注射即日(10月18日) | 0 | |||
后(10月19日) | 1 | 10月20日 | +++ | |
后(10月24日) | 6 | 10月25日 | +++ | |
后(10月31日) | 13 | 11月3日 | +++ |
表12.CO家兔的血清学检测
取样日期 | 第n天 | 测试日期 | 抗Leb抗体 | 抗Lea抗体 |
前(10月5日) | -13 | - | - | |
前(10月11日) | -7 | - | - | |
注射即日(10月18日) | 0 | |||
后(10月19日) | 1 | 10月20日 | +++ | |
后(10月24日) | 6 | 10月25日 | +++ | |
后(10月31日) | 13 | 11月3日 | +++ |
实施例12
大鼠红细胞的体外转化可按照以下方法进行。
正常的大鼠血浆被用于稀释糖脂抗原(其他稀释液亦可使用)。用1ml血浆配制含250ug
Leb抗原的储备液。如有需要即可从该储备液稀释制备所需浓度的溶液。
将等体积的含有Lewis糖脂(600ul)加入等体积的经淋洗后的红细胞溶液中,并进行正确的孵育。在选定的时间间隔,75ul的混合液被移出,并用生理盐水淋洗细胞中止反应,遂将细胞重悬于生理盐水中。在血清学检测前,细胞4℃保存。血清学检测使用抗Leb抗体。(见实施例E)
实施例E
用不同浓度的Leb糖脂抗原体外转化红细胞,在不同反应时间时的血清学检测。结果见表13。表13.
Leb | 孵育时间(小时) | ||||||||
浓度 | 0.5 | 1 | 2 | 4 | 8 | 12 | 24 | 36 | 48 |
25 | ++ | +++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ |
12.5 | ++ | ++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++++ | ++ |
6.3 | + | ++ | +++ | +++ | ++++ | ++++ | ++++ | +++ | ++ |
3.2 | - | + | ++ | ++ | +++ | +++ | ++++ | ++ | + |
1.6 | - | - | + | + | ++ | ++ | ++ | + | - |
0.8 | - | - | - | - | + | + | + | - | - |
0.4 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
0 | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
浓度=ug Leb抗原/ml大鼠血浆
实施例13
用流式细胞仪技术分析温度的动力学效应。
在本实验中,首先检验了流式细胞仪方法的灵敏度。使用敏感细胞与不同浓度的Leb抗原在37℃下孵育3小时,检验流式细胞仪方法的灵敏度。结果显示流式细胞仪技术在检测高浓度糖脂(>100ug/ml)转化的细胞时,最为可靠,孵育期间的凝集反应评分可达3个+到4个+(结果未给出)。结合这些实验结果,使用含250ug/ml(25ug/管)的转化溶液进行转化反应,最长反应时间为8小时,反应温度设置为4℃,22℃和37℃,并用流式细胞仪检测。实验结果在实施例F1和F2中给出。
实施例F1
37℃下用Leb抗原体外转化人Le(a-b-)红细胞。用两种不同的抗Leb抗体经流式细胞仪检测其反应性。结果在图4中列出。黑色填充的曲线代表阴性对照,例如未转化的细胞。未填充曲线向左侧延伸代表反应时间减少,向右延伸代表反应时间延长。结果按序排列,从坐至右是0,1,2,3,4,5,6,7和8小时。
实施例F2
22℃下用Leb抗原体外转化人Le(a-b-)红细胞。用两种不同的抗Leb抗体经流式细胞仪检测其反应性。结果在图5中列出。黑色填充的曲线代表阴性对照,例如未转化的细胞。未填充曲线向左侧延伸代表反应时间减少,向右延伸代表反应时间延长。结果按序排列,从坐至右是0,1,2,3,4,5,6,7和8小时。
4℃下用Leb抗原体外转化人Le(a-b-)红细胞。用两种不同的抗Leb抗体经流式细胞仪检测其反应性。结果在图6中列出。黑色填充的曲线代表阴性对照,例如未转化的细胞。未填充曲线向左侧延伸代表反应时间减少,向右延伸代表反应时间延长。结果按序排列,从坐至右是0,1,3,5和7小时。
实施例14
按照下法,明确如何制备干燥的糖脂抗原及其PBS盐,以及如何重新配置其溶液:
实施例G1
按以下方法制备糖脂样品,并将其干燥:
●用氯仿∶甲醇(2∶1)溶液溶解糖脂,并调浓度为50mg/ml
●500ul溶解后的糖脂被转移到玻璃试管中。500ul磷酸缓冲液(PBS)或者50ul 10×PBS随后加入。然后加入小量甲醇,以利于形成单相溶液。
●70℃下用氮气挥干溶液。在挥干过程中,溶液可周期性地分成两相,因此需不时加入小量甲醇,使之变回单相,有利于挥发。用这种办法即可使糖脂溶液完全挥发。或者,可将糖脂溶液冻存于零下85℃冰箱中冻干。
实施例G1
按以下方法将干燥的糖脂重新配置称溶液:
●加500ul去离子水到干燥的糖脂样品,形成一个50mg/ml的糖脂的PBS溶液。将试管超声2分钟,保证样品完全溶解。然后可用1×PBS工作液将此溶液稀释到所需浓度。
实施例15
以下是一个备选的,甚至是更好的将抗原插入红细胞的方法,因为它利用了前文提及的3∶1的比例。
●20ul 10mg/ml的A型糖脂抗原溶液和60ul淋洗过的O型红细胞被加入到一个Eppendorf管中
● 25℃水浴加热四小时,每隔一小时混匀一次(室温时,插入步骤效果较37℃时有所下降,但与37℃时相比较,其发生的溶血现象可以忽略不计)
●转化后细胞用3×PBS溶液淋洗,并用细胞保存溶液调成适宜于血清学实验的浓度
表14中列出了插入糖脂后1天,25天和62天后,保存在4℃的转化细胞的血清学实验结果。
表14.用抗Leb抗体(SCR A40-1-2/A40-1-1)和Seraclone出品的抗A抗体(KIL 2901 E6-2/E6-3)进行转化后红细胞的血清学检验。注:Leb糖脂用高效液相色谱仪(HPLC)进行了纯化,而A型糖脂则没有,因此还有其他的脂类杂质。
糖脂浓度(mg/ml) | Leb | A | |||
第1天 | 第25天 | 第62天 | 第1天 | 第25天 | |
10 | ++++ | Nd | ++/+++ | +++ | ++ |
5 | ++++ | Nd | ++/+++ | ++ | ++ |
2 | +++ | Nd | +/++ | 0 | + |
1 | ++++ | Nd | ++ | 0 | + |
0.1 | +++ | ++ | 0 | 0 | Nd |
0.01 | ++ | ++ | 0 | 0 | Nd |
0.001 | ++ | ++ | 0 | 0 | Nd |
0.0001 | ++ | 0 | 0 | 0 | Nd |
阴性对照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Nd表示不能测出
实施例16
实施例H1
细胞凝集反应使用Diamed-ID微型分型系统结合传统的试管血清学反应进行。实验中使用的胶卡是NaCl,酶反应和冷凝集反应胶卡,事先不用任何抗血清或其他抗体进行预处理。使得此胶卡可用于特异性抗血清的检测。
表15和表16显示了用这个系统检测凝集反应的结果。
表15.用Diamed-ID微型分型系统检测A型糖脂提前8天预处理的O型红细胞的凝集反应。实验中使用的抗体是Seraclone出品的抗A抗体(实验KIL2202E16-1)。
泳道/培养孔 | 转化用糖脂浓度mg/ml | 评分 |
188-1 | 阴性对照 | 无反应(未转化的红细胞) |
185-0 | 10 | +++ |
185-1 | 5 | +++ |
185-2 | 2 | ++ |
185-3 | 1 | 0 |
185-4 | 0.1 | 0 |
表16.用Diamed-ID微型分型系统检测A型糖脂提前17天预处理的O型红细胞的凝集反应。实验中使用的抗体是Seraclone出品的抗A抗体(实验KIL2202E41-2)。
泳道/培养孔 | 转化用糖脂浓度mg/ml | 评分 |
8-1 | 对照 | ++++ |
185-0 | 10 | +++ |
185-1 | 5 | ++ |
185-2 | 2 | 0 |
185-3 | 1 | 0 |
190-1 | 0 | 无反应(未转化的红细胞) |
实施例H2
使用试管法和Diamed系统开展对比实验,以检验两种方法的表现。实验中使用Seraclone和Alba-clone出品的抗A抗体,观察它们在使用两种方法检测时,其血清学特征是否相同。表17列出了实验结果。
表17.使用两种不同的抗A抗体--Seraclone和Alba-clone出品,所得的凝集反应结果。细胞和抗体使用试管法和Diamed进行实验。
A糖脂浓度(mg/ml) | ||||||
10 | 5 | 2 | 1 | 0 | ||
试管法 | ||||||
Seraclone | 3+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | |
Alba-clone | 3+ | 2+ | 0 | 0 | 0 |
Diamed | ||||||
Seraclone | 3+ | 2+ | 1+ | +w | 0 | |
Alba-clone | 2+ | 2+ | 0 | 0 | 0 |
实施例17
糖脂插入的稳定性用以下方法进。
采用不同浓度的A型糖脂对两套细胞进行转化。一套细胞在转化后第1周和第6周进行凝集反应,另一套则每周进行凝集反应。表18显示了试管法和Diamed系统测得的凝集反应结果。每周均作测试的那套细胞,分别保存在两种保存液—CellStab和Celpresol中,以观察这两种的液体的表现。所有细胞均保存在平底培养瓶中。凝集反应和溶血反应显示两种保存液体的表现并无显著差异。任何时刻,细胞不发生或仅发生极微量的溶血反应。
表18.不同浓度糖脂转化细胞后凝集反应结果。转化后29天始,使用Alba-clone出品的抗A抗体,其余时间均使用Seraclone出品的抗体(在表17中,可见这两种抗体的效果相等)。
10 | 5 | 2 | 1 | 0.1 | 阴性对照 | ||
长期测试 | |||||||
第1天 | 试管法 | 4+ | 3+ | 2+ | 1+ | +w | 0 |
Diamed | 3+ | 3+ | +w | 0 | 0 | 0 | |
第17天 | 试管法 | 3+ | 2+ | 0 | 0 | Nd | 0 |
Diamed | 3+ | 2+ | 1+ | 0 | nd | 0 | |
每周测试 | |||||||
第1天 | 试管法 | 3+ | nd | 2+ | nd | 0 | 0 |
Diamed | 3+ | nd | 0 | nd | 0 | 0 |
第8天 | 试管法 | 1+ | nd | 2+ | nd | 0 | 0 |
Diamed | 3+ | nd | 0 | nd | 0 | 0 | |
第15天 | 试管法 | 1+ | nd | 0 | nd | 0 | 0 |
Diamed | 3+ | nd | 2+ | nd | 0 | 0 | |
第22天 | 试管法 | 3+ | nd | 0 | nd | 0 | 0 |
Diamed | 3+ | nd | 0 | nd | 0 | 0 | |
第29天 | 试管法 | 1+.w | nd | 0 | nd | 2+ | 0 |
Diamed | 4+ | nd | 3+ | nd | 0 | 0 | |
第36天 | 试管法 | 4+ | nd | 2+ | nd | 0 | 0 |
Diamed | 4+ | nd | 3+ | nd | 0 | 0 | |
第43天 | 试管法 | 4+ | nd | 3+ | nd | 0 | 0 |
Diamed | 3+ | nd | 0 | nd | 0 | 0 | |
第49天 | 试管法 | 1+ | nd | nd | nd | nd | 0 |
Diamed | nd | nd | nd | nd | nd | 0 | |
第57天 | 试管法 | 2+ | nd | nd | nd | nd | 0 |
Diamed | 2+ | nd | nd | nd | nd | 0 |
实施例19
生物素化的神经节苷脂(BioG)制备。
神经节苷脂(BioG)的制备系参考Wilchek和Bayer(1987)的方法基础上加以改良。
●从猪脑中提纯的神经节苷脂用PBS重新配成溶液,并用超声助溶。
●用高碘酸钠氧化神经节苷脂的含硅铝离子的残基
●溶液透析24小时,去处反应中形成的过氧化物
●用生物素-氨癸酰基酰肼(Sigma B-3770)与氧化的神经节苷脂孵育1小时
●所得溶液继续用水透析过夜,以去处多余的生物素-氨癸酰基酰肼
●所得溶液用旋转蒸发的方法挥干,并用50%的甲醇-水混合液重新配制。并用氮气在负压干燥器中过夜,进一步挥干。
●神经节苷脂样品(50mg/ml)可以用PBS工作液稀释至所需浓度卵白素的制备。
●卵白素用PBS工作液溶解并稀释至1mg/ml。生物素化的糖的制备。
●冰冻干燥的生物素化的糖从Syntesome购得。
1.A-PAA-生物素批号=Syntesome Cat No 165-BP
2.B-PAA-生物素批号=Syntesome Cat No 186-BP
●生物素化的糖用去离子水重悬并调浓度为1mg/ml,并可用PBS工作液稀释至所需浓度。
转化方法
人工转化的程序,分为三个连续的步骤。第一步,将生物素化的神经节苷脂插入到红细胞膜上;接着将卵白素连接到与神经节苷脂结合的生物素上;最后将生物素化的糖(如A-PAA或B-PAA)连接到卵白素分子上。开始的实验均使用A-PAA。
生物素化的神经节苷脂的插入
●生物素化的神经节苷脂BioG(20ul,0.01mg/ml,用于A-PAA的连接),和淋洗过的O型红细胞(60ul)被加入到Eppendorf管中。
●25℃水浴孵育Eppendorf管四小时,每隔一小时混匀一次(室温下插入反应(室温时,插入步骤效果较37℃时有所下降,但与37℃时相比较,其发生的溶血现象可以忽略不计)
●转化后的红细胞用3×PBS淋洗。
卵白素的连接。
●40ul,1mg/ml的卵白素加入Eppendorf管中,此管含有上述步骤制得的淋洗过的连有生物素化神经节苷脂的红细胞
●室温孵育30分钟,每隔10分钟混匀一次。
●卵白素-生物素化神经节苷脂-红细胞用3×PBS淋洗生物素化糖的连接
●60ul,0.001mg/ml的生物素化糖加入Eppendorf管中,此管含有上述步骤制得的淋洗过的卵白素-生物素化神经节苷脂-红细胞
●室温孵育30分钟,每隔10分钟混匀一次。
●卵白素-生物素化神经节苷脂-A-PAA-红细胞用3×PBS淋洗,并用Celpresol重悬,调浓度为5%,用于血清学实验。
实施例20
开展抗体滴度实验,使用抗A抗体,验证使转化后红细胞能够产生凝集反应阳性时,所需生物素化神经节苷脂和生物素化糖的最小浓度。结果显示在表19和表20中。
表19.用Seraclone出品的抗A抗体,进行抗体滴度实验,验证所需生物素化糖A-PAA的最小浓度。
生物素化神经节苷脂的浓度(mg/ml) | 生物素化糖A-PAA的浓度(mg/ml) | ||||||
0.01 | 0.005 | 0.0025 | 0.0012 | 0.0006 | 0 | ||
0.03 | ++++ | ++++ | +++ | ++ | + | 0 | |
0.02 | ++++ | ++++ | +++ | ++ | ++ | 0 | |
0.01 | +++ | +++ | ++ | + | ++ | 0 |
表20.升高生物素化神经节苷脂的浓度,再进行抗体滴度实验。实验显示,缺少生物素化神经节苷脂和生物素化糖A-PAA两者之一,或者全部缺失,都将显示阴性结果。抗A抗体系Seraclone出品。
生物素化神经节苷脂的浓度(mg/ml) | 生物素化糖A-PAA的浓度(mg/ml) | ||||||
0.01 | 0.005 | 0.0025 | 0.0012 | 0.0006 | 0 | ||
6 | ++++ | ++++ | ++ | + | (+) | (+) | |
3 | ++++ | ++++ | ++ | +w | (+) | (+) | |
1.5 | ++++ | ++++ | ++ | Vw | 0 | 0 | |
0.75 | ++++ | +++ | ++ | Vw | 0 | 0 | |
0.4 | ++++ | +++ | ++ | 0 | 0 | 0 | |
0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
实施例21
生物素化神经节苷脂浓度的稳定性用下法进行。用上文建立的方法,控制生物素化糖A-PAA的浓度为0.01和0.0025mg/ml,生物素化神经节苷脂浓度分别为0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.12mg/ml和0.05mg/ml。取0.01mg/ml的细胞溶液每周进行血清学实验。在实验过程中,未见溶血现象。
表21.本表列举了使用不同浓度生物素化神经节苷脂和生物素化糖浓度时,进行血清学反应时的凝集反应结果。第一天之后,使用Albaclone出品的抗A抗体,其他抗体均系Seraclone出品的抗A抗体(表6显示了这两种抗体的血清学等效性)。
生物素化神经节苷脂的浓度(mg/ml) | |||||||
0.5 | 0.25 | 0.12 | 0.05 | 0 | |||
生物素化糖浓度(0.0025mg/ml) | |||||||
第一天 | 试管法 | 1+ | 1+ | 2+ | 2+ | 0 | |
Diamed | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 0 | ||
生物素化糖浓度(0.0025mg/ml) | |||||||
第一天 | 试管法 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | ||
第8天 | 试管法 | nd | nd | nd | Nd | Nd | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | ||
第15天 | 试管法 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | ||
第22天 | 试管法 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | ||
第29天 | 试管法 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | ||
第36天 | 试管法 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | ||
第43天 | 试管法 | 4+ | 4+ | 4+ | 2+ | 0 | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | ||
第49天 | 试管法 | 4+ | 4+ | 4+ | 2+ | 0 | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 | ||
第56天 | 试管法 | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 0 | |
Diamed | 4+ | 4+ | 4+ | 3+ | 0 |
nd表示不能测出
用试管法进行比较试验证明,Seraclone和Albaclone出品的抗A抗体的血清学表现相同。转化细胞系使用表22中列出的生物素化神经节苷脂的浓度,和0.01mg/ml的生物素化糖浓度。
表22.试管法检验两种不同的抗A抗体—Seraclone和Albaclone出品—的凝集反应结果。
抗体 | 生物素化神经节苷脂浓度(mg/ml) | ||||
0.5 | 0.25 | 0.12 | 0.05 | 0 | |
Seraclone | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 |
Albaclone | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 0 |
实施例22
使用0.5,0.25,0.12mg/ml的生物素化神经节苷脂和10,7.5ug/ml的生物素化糖转化红细胞,然后用几个过期的抗体进行滴度试验。使用的抗体列出在表23中,滴度试验结果列出在表24中。
表23.生物素化神经节苷脂-卵白素-生物素化A型三糖系统转化的红细胞,进行比较性试验时,使用的抗体列表。
抗A抗体 | |||
编号 | 生产厂家 | 批号 | 保质期限 |
I | Albaclone,SNBTS | Z0010680 | 1.2.03 |
II | Bioclone | 01102 | |
III | Bio Labs | 8606 | 4.87 |
IV | Epiclone,CSL | 20901 | 11.93 |
V | Gamma Clone | AM30-1 | 19.7.93 |
VI | Immucor | 1A6137A | 22.4.93 |
VII | Lorne Labs | 60086D | 8.01 |
VIII | Nova Clone | NA00503 | 8.5.93 |
IX | Organon | 112Z15A | 19.12.93 |
X | Seraclone | 132051 | 29.5.93 |
表24.抗体比较试验的凝集反应结果
生物素化神经节苷脂 | 生物素化糖 | 抗A抗体 | |||||||||
mg/ml | ug/ml | I | II | III | IV | V | VI | VII | VIII | IX | X |
0.5 | 10 | 2+ | 1+ | 0 | +w | 0 | 0 | 0 | 0 | +w | 2+ |
7.5 | 3+ | 2+ | 1+ | 2+ | 2+ | 2+ | +w | 0 | 1+ | 4+ | |
5 | 3+ | 3+ | 1+ | 1+ | 0 | 0 | 0 | +w | 2+ | 2+ | |
0.25 | 10 | 4+ | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4+ |
7.5 | 3+ | 2+ | 0 | 1+ | 0 | 0 | 0 | 0 | 1+ | 4+ | |
5 | 4+ | 2+ | 0 | +w | 0 | 0 | 0 | 0 | +w | 4+ | |
0.12 | 10 | 3+ | 1+ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | +w | 2+ |
7.5 | 1+ | 1+ | 0 | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3+ | |
5 | +w | +w | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | +w | |
0.05 | 10 | +w | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1+ |
7.5 | 2+ | +w | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2+ | |
5 | +w | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1+ | |
阴性对照 | 0 | 0 | (+) | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
阳性对照 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | +4 | +4 | 4+ | 4+ | 4+ |
I-Albaclone II-Bioclone III-Bio Labs IV-CSLV-Gamma Clone VI-Immucor
VII-Lorne Labs VIII-Nova Clone IX-Organon X-Seraclone
这其中的一些抗体也用Diamed系统进行了检测,部分结果列于表25,26,27。
表25.采用特定浓度的生物素化神经节苷脂和生物素化糖进行转化后的红细胞,与抗体进行凝集反应,用Diamed微型分型系统进行检测。使用的抗体系Albaclone出品的抗A抗体(实验KIL2403 E93-1-1)
泳道/培养孔 | 生物素化神经节苷脂(mg/ml)生物素化糖(ug/ml) | 评分 |
04-2 | 阳性对照-A型红细胞 | ++++ |
66-1-1 | 0.5mg/ml,10ug/ml | ++ |
66-1-2 | 0.25mg/ml,10ug/ml | +++ |
66-1-3 | 0.12mg/ml,10ug/ml | ++ |
66-1-4 | 0.05mg/ml,10ug/ml | 0 |
66-4 | 阴性对照—O型红细胞 | 0 |
表26采用特定浓度的生物素化神经节苷脂和生物素化糖进行转化后的红细胞,与抗体进行凝集反应,用Diamed微型分型系统进行检测。使用的抗体系Albaclone出品的抗A抗体(实验KIL2403 E93-1-2)
泳道/培养孔 | 生物素化神经节苷脂(mg/ml)生物素化糖(ug/ml) | 评分 |
04-2 | 阳性对照—A型红细胞 | ++++ |
66-1-1 | 0.5mg/ml,7.5ug/ml | ++++ |
66-1-2 | 0.25mg/ml,7.5ug/ml | +++ |
66-1-3 | 0.12mg/ml,7.5ug/ml | ++ |
66-1-4 | 0.05mg/ml,7.5ug/ml | 0 |
66-4 | 阴性对照—O型红细胞 | 0 |
表27.采用特定浓度的生物素化神经节苷脂和生物素化糖进行转化后的红细胞,与抗体进行凝集反应,用Diamed微型分型系统进行检测。使用的抗体系Seraclone出品的抗A抗体(实验KIL2403 E93-2-3)
泳道/培养孔 | 生物素化神经节苷脂(mg/ml)生物素化糖(ug/ml) | 评分 |
04-2 | 阳性对照-A型红细胞 | ++++ |
66-1-1 | 0.5mg/ml,5ug/ml | +++ |
66-1-2 | 0.25mg/ml,5ug/ml | +++ |
66-1-3 | 0.12mg/ml,5ug/ml | 0 |
66-1-4 | 0.05mg/ml,5ug/ml | 0 |
66-4 | 阴性对照-O型红细胞 | 0 |
对O型红细胞进行人工改造,使用PAA接头将一个生物素化的B型三糖与红细胞连接。生物素化神经节苷脂浓度为0.5mg/ml,0.25mg/ml,0.12mg/ml和0.05mg/ml,B型三糖-PAA复合物的浓度为10ug/ml,7.5ug/ml和5ug/ml。
实验中使用的B型抗体列表见于表28,试验结果见表29。
表28.生物素化神经节苷脂-卵白素-生物素化B型三糖系统转化的红细胞,进行比较性试验时,使用的抗体列表。
抗B抗体 | |||
编号 | 生产厂家 | 批号 | 保质期限 |
I | Albaclone,SNBTS | Z0110600 | 27.4.03 |
II | Bioclone | 01103 | |
III | Bio Labs | 8625 | 7.87 |
IV | Epiclone,CSL | 23801 | 5.00 |
V | Epiclone,CSL | 20801 | 11.93 |
VI | Lorne Labs | 61003A | 8.01 |
VII | Organon | 112X19B | 16.12.93 |
VIII | Ortho ClinicalDiagnostics | BBB589A | 21.11.99 |
表29.抗B抗体比较试验的凝集反应结果
生物素化神经节苷脂 | B型生物素化三糖 | 抗B抗体 | |||||||
mg/ml | ug/ml | I | II | III | IV | V | VI | VII | VIII |
0.5 | 10 | 2+ | 3+ | 1+ | +w | 0 | 2+ | 0 | 4+ |
7.5 | 0 | 0 | 2+ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
5 | 0 | 0 | +1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2+ | |
0.25 | 10 | 2+ | 2+ | 1+ | 0 | 0 | 3+ | 0 | 4+ |
7.5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
5 | 0 | 0 | 1+ | 0 | 0 | 0 | 0 | 2+ | |
0.12 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 2+ |
7.5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1+ | |
5 | 0 | 0 | +w | 0 | 0 | 0 | 0 | 2+ | |
0.05 | 10 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | +w |
7.5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | +w | |
阴性对照 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
阳性对照 | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ | 4+ |
I-Albaclone II-Bioclone III-Bio Labs IV & V-CSL VI-Lorne Labs
VII- Ortho Clinical Diagnostics VIII-Organon
尽管前文以实施例的形式阐述本发明,但只要不违背权利声明允许的范围,作变动和修改亦被认可。而且,针对某些特点,若存在已知的等价的观点时,只要在详细说明中述及,这些等价观点亦可被包括入本发明中。
Claims (21)
1.一种血型测定的灵敏度控制物制备方法,包括:
●将一定量的抗原溶解于水中(亦可是一种或多种可溶性盐的溶液),制备浓度确定的抗原溶液;和
●将抗原溶液与已知浓度的液态细胞溶液接触一段时间,在可使抗原分子能够插入细胞膜中的温度,形成人工改造的细胞;或者
●将抗原溶液与已知浓度的液态细胞(已经过修饰,在膜上插入了连接分子)溶液接触一段时间,在可使抗原分子能够和连接分子结合的温度,形成人工改造的细胞;和
●用洗液洗涤经改造的细胞,并将洗后的改造细胞悬浮于水中,亦可选择加入一种或多种可溶性盐,得到改造细胞的溶液;和
●测定改造细胞的浓度,并调整浓度使其能够用于血型检测时的灵敏度控制。
2.如权利要求1所述的方法,其中待改造细胞未经任何修饰,改造后的细胞包含着直接插入细胞膜的抗原分子。
3.如权利要求1所述的方法,其中待改造细胞经修饰,被插入一个连接分子;改造后的细胞包含的抗原分子系通过此连接分子才与细胞膜相连。
4.如权利要求3所述的方法,其中连接分子含一个脂质尾巴和一个“桥”结构,通过此“桥”结构将抗原分子与脂质尾巴与抗原分子连接。
5.如权利要求4所述的方法,其中“桥”结构为生物素-卵白素桥。
6.如权利要求3所述的方法,其中连接分子包括生物素化的糖脂。
7.如前述任一权利要求所述的方法,其中的细胞是动物细胞,植物细胞,细菌细胞或者具有人工细胞膜结构的细胞或囊泡。
8.如权利要求7所述的方法,其中动物细胞为人类细胞。
9.如权利要求8所述的方法,其中人类细胞为红细胞。
10.如权利要求9所述的方法,其中红细胞是O型红细胞。
11.如权利要求1-10的任意一个所述的方法,其中抗原是糖脂或者是生物素化的糖类。
12.如权利要求11所述的方法,其中糖脂包括血型相关的糖脂,诸如,A型,B型,H型,Lewis(Leb或Lea),或者是Gal(alpha)鞘糖脂。
13.如权利要求11所述的方法,其中生物素化的糖类系指生物素化的血型相关的糖类,诸如A型,B型,H型,Lewis(Leb或Lea),或者是Gal(alpha)鞘糖脂。
14.通过权利要求1-13中任意一个的方法制备而成的改造细胞。
15.如权利要求14所述的改造细胞,其被用于血型分型时,抗体或检测系统的灵敏度控制。
16.进行抗体或检测系统的灵敏度控制的方法,包括:
●将权利声明1至13中所述方法制备的细胞与分型用抗体或检测系统接触,使改造后细胞与抗体或检测系统发生抗原-抗体反应。
●检测抗原-抗体反应程度。
●测出分型用抗体或检测系统的灵敏度。
17.如权利要求16所述的方法,其中抗原-抗体反应程度,由直接的凝集反应或者诱导的凝集反应来测定。
18 如权利要求17所述的方法,其中诱导凝集可以通过强化反应,或使用抗免疫球蛋白分子,或者使用酶反应来实现。
19.如权利要求16所述的方法,其中抗原-抗体反应程度通过酶标记法,放射标记法或者荧光标记法进行。
20.通过权利要求1-13的任一种方法获得的灵敏度控制物,可衡量一种或多种试剂或者用于血型检测之检测系统的有效性。
21.一含有用于进行血型测定的组件的试剂盒,其中试剂盒包括权利要求1-13中任意一个的方法制得的灵敏度控制物。
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