CN1566941A - 一种测定制剂中神经生长因子含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定制剂中神经生长因子含量的方法，该方法为凝胶色谱法，使用高效液相色谱仪检测，色谱条件为：(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10,000～500,000道尔顿、孔径为200～300埃的凝胶柱；(2)流动相：pH值为6.5～7.2，浓度为0.01M～0.07M的磷酸盐缓冲液；(3)柱温：室温；(4)流速：0.6～1.0ml/min；(5)检测波长：205～220nm。本发明的优点是：凝胶色谱法特异性强、重复性好、自动化程度高，可有效排除制剂中包括人血白蛋白在内的辅料的干扰，对NGF定量准确。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定制剂中神经生长因子含量的方法，尤指凝胶色谱法测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法。
背景技术
神经生长因子(NGF)是神经系统最主要的活性成分之一，它能维持交感神经和感觉神经细胞的生存，影响中枢神经元的存活，促进神经细胞的分化，对保护神经系统的正常功能具有重要的作用，我国已经批准神经生长因子制剂作为药物销售和使用。
现有的神经生长因子制剂中NGF的含量在4～30ug/ml，采用人血白蛋白作为保护剂，由于人血白蛋白与NGF同为蛋白质而且在制剂中的含量明显高于NGF，因而严重影响了NGF的准确定量。为了解决这个难题，人们尝试了多种检测方法，如Lowry法、紫外吸收法、Bradford法、和ELISA法等，但都因无法排除人血白蛋白干扰或受检测方法本身的灵敏度所限而失败。因此，目前我国NGF制剂生产厂家在产品检定过程中仍按照各自制定的标准执行，而缺少一种行之有效的国家标准，既不利于产品质量控制，更有碍于药品监督管理。有鉴于此，急需一种能够有效排除人血白蛋白保护剂干扰的测定制剂中神经生长因子含量的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种测定制剂中神经生长因子含量的方法，该方法为凝胶色谱法，使用高效液相色谱仪检测，色谱条件为：
(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10,000～500,000道尔顿、孔径为200～300埃的凝胶柱；
(2)流动相：pH值为6.5～7.2，浓度为0.01～0.07M的磷酸盐缓冲液；
(3)柱温：室温；
(4)流速：0.6～1.0ml/min；
(5)检测波长：205～220nm。
使用高效液相色谱法中的凝胶色谱法对制剂中NGF的含量进行测定，其基本原理是通过流经色谱柱的各种物质的分子量的差异将其分离，分子量越大，保留时间越短。由于每种物质在一定条件下具有特定的保留时间，因此可通过色谱图上的保留时间获知目的峰的位置和相关参数，并通过该参数计算所得到的目的物质的含量。选用凝胶柱的最基本原则是其检测范围包含待检物质的分子量。NGF单体的分子量为13.6kD，其二聚体的分子量为26kD，故本专利选用了分子量检测范围在10,000～50,000道尔顿的凝胶柱作为分析用色谱柱。波长选取的标准与待检物质的光吸收性质有关，对一种蛋白质或多肽来讲，其最大吸收波长是固定的。通过紫外扫描，发现NGF在205～220nm波长均有光吸收，可作为检测波长。
所述凝胶色谱柱选自TSK G3000 SW XL，7.8×300，5μ，(TOSOH，日本)、SHODEXProtein KW-804(SHODEX，日本)和BSA-7(MN，德国)，Phenomenex K3(Phenomenex，美国)中的一种。这些柱子的分子量范围均在10,000～500,000道尔顿，孔径为200～300埃。
通过实验，摸索出本发明的较佳实施方案，其中流动相的pH值为7.0，流速为0.6～1.0ml/min，检测波长为214nm。
以上凝胶色谱法可以使用标准曲线法或外标法对制剂进行测定。
所述的标准曲线法包括如下步骤：
(1)作标准曲线：取含量已知的NGF纯品为标准品，梯度稀释，以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，得到标准曲线；
(2)测定NGF含量：将待测制剂溶液以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，并将NGF对应的相关参数代入标准曲线得到其含量值。
所述外标法包括如下步骤：
(1)作标准曲线：取含量已知的NGF纯品为标准品，梯度稀释，以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，得到标准曲线和线性范围；
(2)外标法测定NGF含量：在线性范围内选择合适的浓度，配制对照溶液和样品溶液，在选定的色谱条件下进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
本发明的优点是：凝胶色谱法特异性强、重复性好、自动化程度高，可有效排除制剂中包括人血白蛋白在内的辅料的干扰，对NGF定量准确。
附图说明
图1-1为制定标准曲线时NGF含量为0.02mg/ml时HPLC图谱；
图1-2为制定标准曲线时NGF含量为0.04mg/ml时HPLC图谱；
图1-3为制定标准曲线时NGF含量为0.06mg/ml时HPLC图谱；
图1-4为制定标准曲线时NGF含量为0.08mg/ml时HPLC图谱；
图1-5为制定标准曲线时NGF含量为0.10mg/ml时HPLC图谱；
图2为流动相(PBS)的HPLC图谱；
图3为白蛋白、甘露醇辅料溶液HPLC图谱；
图4为含白蛋白、甘露醇等辅料的NGF制剂的HPLC图谱；
图5为含氨基酸、表面活性剂、甘露醇等辅料的NGF制剂的HPLC图谱。
具体实施方式
实施例1：标准曲线法测定含人血白蛋白保护剂的NGF制剂中NGF的含量
一、色谱条件：
仪器：使用日本岛津Shimadzu LC-10Avp高效液相色谱仪；
凝胶色谱柱：TSK G3000 SW XL，7.8×300，5μ；
流动相：PBS(0.05M磷酸缓冲液，pH7.0)；
流速：0.8ml/min；
柱温：室温；
波长：214nm。
二、实验步骤：
1、作出标准曲线：
a、取含量已知的NGF纯品(取小鼠颌下腺，经离子交换层析和分子筛分离纯化出NGF，按《中国生物制品规程2000版》要求方法检验纯度＞98％)为标准品，加PBS将其梯度稀释成0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/ml的溶液，摇匀；
b、取各稀释点对照品溶液各20μl依次通过凝胶柱，以磷酸缓冲液为流动相，在214nm波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，以浓度对峰面积进行线性回归，得到标准曲线和线性方程，计算回归系数；
重复上述步骤以验证本方法重现性。
如图1-1至图1-5所示，图谱上出现两个峰，依次为NGF的二聚体和单体，两种状态下的NGF都具有生物学活性。本发明以二聚体形式的NGF为目标检测物质，两次测定获得的各项参数见表1：
表1：NGF标准曲线测定结果
NGF浓度 第1次测定 第2次测定
(mg/ml) 峰的编号 保留时间 峰面积 峰的编号 保留时间 峰面积
0.02 1 12.52 30050 1 12.50 31495
2 14.63 1623 2 14.62 1381
0.04 1 12.50 88041 1 12.48 90168
2 14.63 8248 2 14.62 4659
0.06 1 12.47 155716 1 12.47 160030
2 14.62 5590 2 14.62 5978
0.08 1 12.47 228912 1 12.47 226718
2 14.63 12793 2 14.63 7796
0.10 1 12.47 226718 1 12.45 299812
2 14.63 7796 2 14.62 14354
c、经计算得到两次回归方程分别为：
(1)Y＝3×106X-34613，r＝0.9990
(2)Y＝3×106X-39897，r＝0.9995
Y为目的峰峰面积，X为样品浓度。
2、测定NGF含量
分别取流动相PBS、制剂中相应的辅料溶液(含0.1％白蛋白、6.0％甘露醇的水溶液)各20μl依次通过上述凝胶柱进行检测，以确定辅料中各添加成分的色谱峰位置。如图2所示，流动相PBS不产生吸收峰，对检测NGF的含量无干扰；如图3所示，辅料溶液经紫外检测出现四个峰，其保留时间与在同样条件下测定的NGF纯品的保留时间均不相同，因此可有效排除来自辅料物质的干扰。
取含有人血白蛋白保护剂NGF制剂(本公司制剂室自制)，加PBS配制成待测溶液，取20μl以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在214nm波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，并将NGF对应的相关参数代入线性方程得到其含量值。
如图4所示，色谱图上保留时间为12.467的吸收峰为NGF的特征峰，直接将检测出的峰面积值代入回归方程，即可测得制剂中NGF的含量。
重复检测5次，结果见表2。
表2含白蛋白制剂中NGF含量检测结果
项目 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5
峰面积 87725 89809 84903 86103 88503
NGF含量(μg/ml) 42.5 43.2 41.6 42.0 42.8
五次所检测样品的均值为42.5μg/ml，未加人血白蛋白、甘露醇等辅料时NGF的含量为41.0μg/ml，则变异系数为42.5-41.0/41.0(％)＝3.65％，说明本方法具有良好的重现性。
实施例2：标准曲线法测定辅料为氨基酸、甘露醇和非离子表面活性剂的NGF制剂中NGF的含量
一、色谱条件：
同实施例1。
二、实验步骤：
实验步骤同实施例1，但进样时，分别取流动相PBS、制剂相应的氨基酸(丙氨酸、甘氨酸和精氨酸)、甘露醇和非离子表面活性剂(吐温-80)溶液和含上述氨基酸、甘露醇和非离子表面活性剂的NGF制剂各20μl依次进样进行检测(图5)，结果见表3。由于氨基酸和表面活性剂保留时间远远超过同样条件下的NGF的保留时间，因此不存在对检测的干扰。
表3含氨基酸、甘露醇和非离子表面活性剂制剂中NGF含量检测结果
样品序号 1 2 3 4 5
加辅料前NGF含量(μg/ml) 30.0 30.0 30.0 30.0 30.0
加辅料后NGF含量(μg/ml) 31.2 30.03 29.83 30.9 31.1
所检测样品的均值＝30.61μg/ml
变异系数＝(30.61-30.0)/30.0(％)＝2.03％
实施例3：标准曲线法的回收率实验
一、色谱条件：
同实施例1。
二、实验步骤：
1、标准曲线和回归方程的确定同实施例1。
2、样品溶液的制备：分别取含白蛋白(含量为0.1％)、甘露醇(含量为6.0％)的辅料溶液和含氨基酸(14mg/ml)、表面活性剂(0.01％)、甘露醇(6.0％)的辅料溶液各10ml和NGF纯品适量，分别用两种辅料溶液配制NGF浓度为43.7/ml的制剂溶液，摇匀，待用。
3.取步骤2配制d两种样品溶液，每种取3份，每份精密量取20μl通过上述凝胶柱进行检测，记录色谱图，将NGF的峰面积代入线性方程，得出NGF的含量。根据加入量，计算回收率，结果见表4。
表4 NGF回收率实验结果
样品序号 1 2 3 4 5 6
测得量(μg/ml) 43.8 43.4 43.5 43.3 44.0 44.1
回收率(％) 100.2 99.4 99.6 99.1 100.8 100.9
RSD＝0.75
6份样品回收率均在99-101％之间，表明本法回收率良好，准确度高，符合测试要求。
实施例4：外标法测定含人血白蛋白保护剂的NGF制剂中NGF含量
一、色谱条件：
仪器：使用日本岛津Shimadzu LC-10Avp高效液相色谱仪；
凝胶色谱柱：Protein KW-804，8.0×300，5μ，SHODEX；
流动相：PBS(0.03M磷酸缓冲液，pH7.0)；
流速：1.0ml/min；
柱温：室温；
波长：214nm。
二、实验步骤：
1、线性范围：
a、取含量已知的NGF纯品(取小鼠颌下腺，经离子交换层析和分子筛分离纯化出NGF，按《中国生物制品规程2000版》要求方法检验纯度＞98％)为标准品，加PBS将其梯度稀释成0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/ml的溶液，摇匀；
b、取各稀释点对照品溶液各20μl依次通过凝胶柱，以磷酸缓冲液为流动相，在214nm波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，以浓度对峰面积进行线性回归，得到线性方程，计算回归系数；
表5：NGF标准曲线测定结果
NGF(mg/ml) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
峰面积 28095 87137 153048 227807 295796
c、经计算回归方程为：Y＝3×106X-44445，r＝0.9992
Y为目的峰峰面积，X为样品浓度。
2、测定NGF含量
分别取流动相PBS、制剂中相应的辅料溶液(含0.1％白蛋白、6.0％甘露醇的水溶液)各20μl依次通过上述凝胶柱进行检测，以确定辅料中各添加成分的色谱峰位置。结果表明：流动相PBS和辅料溶液均对检测NGF的含量无干扰。
取含量已知的NGF纯品，加PBS配制成40μg/ml的溶液，作为对照溶液；另取含有人血白蛋白保护剂NGF制剂(本公司制剂室自制)，加PBS配制成40μg/ml的溶液，取20μl以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在214nm波长下检测，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得NGF含量。重复检测5次，结果见表6。
表6含白蛋白制剂中NGF含量检测结果
序号 对照 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5
峰面积 84614 85217 81719 84011 84614 85719
含量(μg/ml) 40.0 42.4 40.7 41.8 42.1 42.7
实施例5：外标法测定含人血白蛋白保护剂的NGF制剂中NGF含量
一、色谱条件：
仪器：使用日本岛津Shimadzu LC-10Avp高效液相色谱仪；
凝胶色谱柱：BSA-7，7.8×300，5μ，MN；
流动相：PBS(0.05M磷酸缓冲液，pH7.0)；
流速：1.0ml/min；
柱温：室温；
波长：214nm。
二、实验步骤：
1、线性范围：
a、取含量已知的NGF纯品(取小鼠颌下腺，经离子交换层析和分子筛分离纯化出NGF，按《中国生物制品规程2000版》要求方法检验纯度＞98％)为标准品，加PBS将其梯度稀释成0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/ml的溶液，摇匀；
b、取各稀释点对照品溶液各20μl依次通过凝胶柱，以磷酸缓冲液为流动相，在214nm波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，以浓度对峰面积进行线性回归，得到线性方程，计算回归系数；
表7：NGF标准曲线测定结果
NGF(mg/ml) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
峰面积 30153 92041 158321 227802 301213
c、经计算线性方程为：Y＝3×106X-41458，r＝0.9994
Y为目的峰峰面积，X为样品浓度。
2、测定NGF含量
分别取流动相PBS、制剂中相应的辅料溶液(含0.1％白蛋白、6.0％甘露醇的水溶液)各20μl依次通过上述凝胶柱进行检测，以确定辅料中各添加成分的色谱峰位置。结果表明：流动相PBS和辅料溶液均对检测NGF的含量无干扰。
取含量已知的NGF纯品，加PBS配制成40μg/ml的溶液，作为对照溶液；另取含有人血白蛋白保护剂NGF制剂(本公司制剂室自制)，加PBS配制成40μg/ml的溶液，取20μl以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在214nm波长下检测，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。重复检测5次，结果见表8。
表8含白蛋白制剂中NGF含量检测结果
序号 对照 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5
峰面积 92404 95139 92952 96252 94851 93846
含量(μg/ml) 40.0 42.5 41.5 43.0 42.4 42.0
实施例6：外标法测定含人血白蛋白保护剂的NGF制剂中NGF含量
一、色谱条件：
仪器：使用日本岛津Shimadzu LC-10Avp高效液相色谱仪；
凝胶色谱柱：Phenomenex K3，8.0×300，5μ
流动相：PBS(0.05M磷酸缓冲液，pH7.0)；
流速：1.0ml/min；
柱温：室温；
波长：214nm。
二、实验步骤：
1、线性范围：
a、取含量已知的NGF纯品(取小鼠颌下腺，经离子交换层析和分子筛分离纯化出NGF，按《中国生物制品规程2000版》要求方法检验纯度＞98％)为标准品，加PBS将其梯度稀释成0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/ml的溶液，摇匀；
b、取各稀释点对照品溶液各20μl依次通过凝胶柱，以磷酸缓冲液为流动相，在214nm波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，以浓度对峰面积进行线性回归，得到线性方程，计算回归系数；
表9：NGF标准曲线测定结果
NGF(mg/ml) 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10
峰面积 31839 93101 170012 236972 313909
c、经计算回归方程为：Y＝3×106X-43237，r＝0.9993
Y为目的峰峰面积，X为样品浓度。
2、测定NGF含量
分别取流动相PBS、制剂中相应的辅料溶液各20μl依次通过上述凝胶柱进行检测，以确定辅料中各添加成分的色谱峰位置。结果表明：流动相PBS和辅料溶液均对检测NGF的含量无干扰。
取含量已知的NGF纯品，加PBS配制成40μg/ml的溶液，作为对照溶液；另取含有人血白蛋白保护剂NGF制剂(本公司制剂室自制)，加PBS配制成40μg/ml的溶液，取20μl以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在214nm波长下检测，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。重复检测5次，结果见表10。
表10含白蛋白制剂中NGF含量检测结果
序号 对照 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5
峰面积 93533 98729 96242 94107 94953 99732
含量(μg/ml) 40.0 42.4 41.4 40.5 40.8 42.9
Claims (8)
1、一种测定制剂中神经生长因子含量的方法，其特征在于：该方法为凝胶色谱法，使用高效液相色谱仪检测，色谱条件为：
(1)凝胶色谱柱：分子量检测范围为10,000～500,000道尔顿、孔径为200～300埃的凝胶柱；
(2)流动相：pH值为6.5～7.2，浓度为0.01M～0.07M的磷酸盐缓冲液；
(3)柱温：室温；
(4)流速：0.6～1.0ml/min；
(5)检测波长：205～220nm。
2、根据权利要求1所述的测定制剂中神经生长因子含量的方法，其特征在于：所述凝胶色谱柱选自TSK G3000 SW XL、或SHODEX Protein KW-804、或BSA-7，和Phenomenex K3中的一种。
3、根据权利要求1所述的测定制剂中神经生长因子含量的方法，其特征在于：所述流动相的pH值为7.0。
4、根据权利要求1所述的测定制剂中神经生长因子含量的方法，其特征在于：所述流速为0.8ml/min。
5、根据权利要求1所述的测定制剂中神经生长因子含量的方法，其特征在于：所述检测波长为214nm。
6、根据权利要求1至5中任何一项所述的测定制剂中神经生长因子含量的方法，其特征在于：所述的方法为标准曲线法或外标法。
7、根据权利要求6所述的测定制剂中神经生长因子含量的方法，其特征在于：所述的标准曲线法包括如下步骤：
(1)作标准曲线：取含量已知的NGF纯品为标准品，梯度稀释，以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，得到标准曲线；
(2)测定NGF含量：将待测制剂溶液以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，并将NGF对应的相关参数代入标准曲线得到其含量值。
8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述外标法包括如下步骤：
(1)作标准曲线：取含量已知的NGF纯品为标准品，梯度稀释，以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，得到标准曲线和线性范围；
(2)外标法测定NGF含量：在线性范围内选择合适的浓度，配制对照溶液和样品溶液，在选定的色谱条件下进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。
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