CN1563125A - 用于自动切胶仪的聚丙烯酰胺凝胶的制备及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种适合商品自动切胶－酶解仪使用的聚丙烯酰胺胶的制备及其应用的方法。本发明在制胶玻板表面引入碳碳双键，使聚丙烯酰胺凝胶共价键合在制胶玻板的表面。此法制备的凝胶可以方便地进行自动切胶和酶解操作。本发明具有操作简单、成本低廉的优点，在蛋白质组学研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

Description

用于自动切胶仪的聚丙烯酰胺凝胶的制备及其应用方法

技术领域

本发明属生化分析技术领域，是一种适合自动切胶-酶解操作的聚丙烯酰胺凝胶的制备及其应用于自动化切胶-酶解仪的方法。

背景技术

随着人类基因组计划的顺利完成，生命科学的研究进入了后基因组时代，其中功能基因组学成为研究重点，蛋白质组学则是其中的重要支柱。二维凝胶电泳与质谱结合的方法是蛋白质组学研究中最流行和有效的技术平台。其常用的程序是经过两维聚丙烯酰胺电泳分离蛋白质，然后切胶，胶内酶解，质谱分析，最后通过数据库检索实现蛋白质鉴定。由于蛋白质组研究的对象是一种细胞、组织和完整生物体所拥有的全套蛋白质，所以二维电泳分离的蛋白质的分析和鉴定是一项十分复杂和繁重的工作。为此，Bio-Rad、AmershamBiosciences等公司相继推出了自动化切胶和酶解系统以提高工作效率，减低研究人员的劳动强度。可是聚丙烯酰胺凝胶在酶切仪的拉伸作用力下会发生变形，难以定位，自动切胶模式下容易发生错切；为此，上述公司开发了配合自动切胶仪使用的聚丙烯酰胺预制胶，通过一层塑料薄膜支撑凝胶来防止凝胶变形。可是预制胶不是在灌胶模具内原位聚合制备，预制胶难与灌胶模具的玻板紧密贴合，空隙的存在会在电泳时影响电场均匀分布，造成分离区带的变形和扭曲，影响蛋白质的有效分离。另一方面，目前可购买的商品预制胶种类单一，仅有浓度12.5％等几种规格，不利于根据样品需要调整胶的浓度，难以获得最佳的分离效果。此外，商品的预制胶价格昂贵(每块约80美元)，对国内开展此项研究的单位是一笔很大的经济负担。

发明内容

本发明的目的是获得一种制备方便、价格低廉、效果良好、可替代进口的适用于自动切胶和酶解系统的聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，以替代现有商品的薄膜预制胶。本发明的目的是获得一种将上述凝胶用于自动切胶仪的应用方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：通过硅烷化反应为制胶玻板表面引入双键，聚丙烯酰胺凝胶在制备过程中键合在制胶玻板短玻板的表面。

具体条件如下：

1玻板用0.1M的盐酸清洗以去除金属杂质离子，可以在120-160℃下干燥过夜，以去除玻璃表面物理吸附的水，保证硅烷化反应的效果；

2用含有双键的硅烷化试剂，例如，1％γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(甲醇和1％乙酸溶液)浸泡玻板5-30分钟，为制胶玻板表面引入双键；该类反应现有技术人员均能实施。

3用硅烷化处理的玻板替代制胶玻板的短玻板，在灌胶模具内制备聚丙烯酰胺凝胶，丙烯酰胺与玻板表面双键发生聚合反应键合在制胶玻板短玻板表面。

4灌胶模具放入电泳槽内，上样进行电泳分离。分离完毕经过染色、脱色、图像扫描等处理操作，选择待测的蛋白斑点进行自动切胶和酶解。

5使用后的玻板刮去残胶，用1M氢氧化钠溶液浸泡过夜，清水清洗后，可重复使用。

本发明是用含有双键的硅烷化试剂修饰制胶玻板，被修饰的玻板和丙烯酰胺发生聚合反应，过程如下：

            玻板    γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷

本发明通过玻板表面硅羟基与硅烷化试剂的反应，在制胶短玻板表面引入双键，使聚丙烯酰胺在聚合过程中键合在其表面。在玻板的支撑作用下凝胶在切胶过程中不会移动和变形，实现了与自动切胶和酶解操作。制备方便，效果良好。

本发明通过硅烷化反应为玻板表面引入可以与丙烯酸胺发生共价聚合反应的碳碳双键。

本发明制得的凝胶使用时将灌胶模具直接放入电泳槽内进行电泳，选定胶上斑点在自动切胶-酶解仪上被自动切割和酶解。

本发明的凝胶可作为一维凝胶电泳或二维凝胶电泳的第二相的电泳介质。

本发明制作的聚丙烯酰胺凝胶是在灌胶模具内原位聚合而成，凝胶与制胶玻板间紧密贴合，无间隙，并且凝胶浓度可根据样品性质灵活调整，克服了商品预制胶存在的种类单一、凝胶难与制胶玻板贴合，分离不佳的问题。

本发明所用的凝胶制备方法，操作简单、价格低廉，以10cm×7.3cm×1.0nm的玻板为例，每块售价仅0.3元。

本发明制作的凝胶适用于蛋白质、核酸以及多肽的电泳分离。本发明制作的凝胶可以取代商品的薄膜支撑预制胶应用于自动化操作的蛋白质组学研究中。

附图说明

图1为实例4的SDS-PAGE图，从图中可以看出，电泳区带平整，无扭曲。

图2为选定切胶位点图。

图3为自动化切胶操作后的实际图，从图2，3中可以看出，实际切胶位点与选定位点完全吻合。

具体实施方式

下面实例是对本发明所提供的玻板化学键合聚丙烯酰胺凝胶方法的进一步说明。实例1-3玻板的清洗和干燥

10cm×7.3cm×1.0mm玻璃薄板用0.1M的HCl浸泡过夜，二次蒸馏水清洗，分别在120℃、140℃、160℃下干燥过夜，干燥保存。

实例4-6玻板的衍生

用1％的γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷的甲醇溶液(含1％乙酸)浸泡实例1-3处理后的玻板分别5、10、30分钟，然后用甲醇清洗，烘干备用。

实例7用含有0.5％的乙酸的7-辛烯基三甲氧基硅烷，浸泡实例1-3处理后的玻板两小时，用甲醇清洗后烘干备用。

实例8十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶制备

配制浓度T(丙烯酰胺与甲叉丙烯酰胺浓度之和)12％、交联度C(甲叉丙烯酰胺的量除以甲叉丙烯酰胺和丙烯酰胺量的和)2.6％的丙烯酰胺分离胶单体溶液(0.1％SDS，0.375M Tris-HCl，pH8.8)，加入过硫酸铵(APS)和四甲基乙二胺(TEMED)，使APS和TEMED的浓度分别达到0.0025M和0.0075M。将溶液摇匀，立即灌入以涂层玻板为短玻板的灌胶模具内至距上边沿1.5厘米处，上以水饱和正丁醇溶液封胶。约半小时分离胶聚合后，倒掉水饱和正丁醇溶液。接着在分离胶上层再灌注约1厘米的T＝5％浓缩胶(0.375M Tris-HCl，pH6.8)并插入梳子，静置待凝胶聚合。

实例9样品制备

称取蔗糖2.5g、SDS 0.46g、Tris 0.15g、2-巯基乙醇1ml、溴酚蓝0.01g，用水溶解并定溶至10ml，配制样品缓冲液。

在离心管中加入蛋白质样品溶液(250ng/μL的细胞色素C、马心肌红蛋白、β-酪蛋白、鸡卵白蛋白和牛血清白蛋白水溶液)与等体积样品缓冲液，混合均匀，在沸水浴中加热3分钟，待用。

实例10十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳

称取Tris 3.78g，甘氨酸23.50g，SDS 1.25g，加去离子水溶解并定容至250ml配制成5×电泳缓冲液(pH8.3)，使用前稀释5倍。

待浓缩胶聚合后，安装电泳槽，加入已稀释的电泳缓冲液，小心拔出梳子，用移液器移取一定量蛋白质样品用液注入加样槽加样，使加入每种蛋白质的量从左至右依次为250ng×2(加样槽)，125ng×2，625ng×3，1250ng×3。接通电极电源开始电泳。电泳过程采用恒流方式，控制电泳电流为10微安/胶进行样品浓缩；一小时后选择蛋白质电泳分离电流为20微安/胶。当溴酚蓝前沿迁移至距分离胶底部近1厘米时停止电泳，取出电泳模具，剥离未涂层玻璃板，将键合在玻板上的聚丙烯酰胺凝胶放入1g/L的考马斯亮蓝染色液(50％乙醇-10％乙酸)中染色2小时后，用10％乙醇-10％乙酸水溶液脱色至凝胶蛋白质条带清晰凝胶背景透明。

实例11电泳后蛋白质条带自动切点酶解

将染色后凝胶贴上凝胶自动切胶仪识别定位标识进行图像扫描，用图像分析软件选定待切割蛋白质点，保存文件。打开切胶仪控制软件，调节切胶仪的针头高度，放置96孔板以接受所切胶粒。打开上述保存文件，用所贴凝胶定位标识定位切胶图像位置，运行切胶程序。所切割胶粒用于酶解试验。

Claims (5)

1.一种用于自动切胶仪的聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，其特征是聚丙烯酰胺胶键合在制胶玻板表面，在玻板的支撑下，进行自动切胶—酶解的操作，其具体制作过程如下：

(1)通过对制胶玻板短玻板表面的硅烷化反应为玻板引入能与丙烯酰胺发生共价聚合反应的双键；

(2)聚丙烯酰胺胶在灌胶模具内原位聚合制备的同时化学键合在双键修饰的制胶玻板表面；

(3)聚丙烯酰胺胶分离蛋白后，经染色、脱色处理步骤，选择待测的蛋白质斑点进行自动切胶—酶解。

2.按照权利要求1所述的用于自动切胶仪的聚丙烯酰胺凝胶的制备方法，其特征是通过硅烷化反应为玻板表面引入与丙烯酰胺发生共价聚合反应的碳碳双键。

3.按照权利要求1所述的用于自动切胶仪的聚丙烯酰胺凝胶的应用方法是灌胶模具直接放入电泳槽内进行电泳，选定胶上斑点在自动切胶—酶解仪上被自动切割和酶解。

4.按照权利要求1所述的用于自动切胶仪的聚丙烯酰胺凝胶作为一维凝胶电泳或二维凝胶电泳的第二相的电泳介质。

5.按照权利要求1所述的用于自动切胶仪的聚丙烯酰胺凝胶作为蛋白质、多肽、核酸的分离检测。

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