CN1563082A - 一种微囊藻毒素纯化的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公布了一种微囊藻毒素纯化的方法。本方法以富营养化湖泊的水华蓝藻或室内培养蓝藻为原料,用适当溶液提取藻毒素后,利用一种有机萃取剂可有效去除大量色素及其它杂质,大大简化了后续的纯化步骤,方法简便,易于操作,所用有机萃取剂可回收利用,成本低,在萃取过程中微囊藻毒素损失小,回收率高达95%以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种微囊藻毒素纯化的方法,特别适合于野外水华蓝藻及室内培养微囊藻提取纯化微囊藻毒素过程中杂质的去除。
背景技术
近十余年来,随着水环境污染的逐步加重,我国许多水体的富营养化程度加剧,引起藻类特别是蓝藻的大量繁殖,蓝藻水华的暴发也越来越严重。更为严重的是,我国80%的蓝藻水华都含有次生代谢产物—微囊藻毒素,微囊藻毒素对水环境和人群健康的危害已成为全球关注的重大环境问题之一。随着对微囊藻毒素进行科学研究的深入,对微囊藻毒素纯品的需要也越来越大。目前微囊藻毒素纯品仅有美、日、德等等少数几家公司(如Sigma、CalBiochem和Kanto Reagents等)可提供少量的这类纯品,其价格在每克40万美元左右。近年来我国对蓝藻毒素的研究日益增多,但受制于毒素纯品难于获得,许多研究工作无法深入开展。可以说,蓝藻毒素纯品的稀缺已成为困扰研究人员进行深入研究的主要“瓶颈”。2002以来,随着国际间将微囊藻毒素列入生化武器(Bioweapon)一类的“禁药”,我国从国外定购这类产品变得越来越困难。在这种背景下,研制开发微囊藻毒素纯品成为亟需解决的问题。
提取纯化微囊藻毒素一般要包括以下几个步骤:①原材料选择;②溶剂提取;③杂质去除和藻毒素初步分离;④通过各种色谱方法进一步纯化。其中,原料来源有两种,一种是野外收集的水华蓝藻,另一种是室内培养的产毒蓝藻。无论采用何种原料,经适当溶剂提取后,粗提液中都会含有大量的色素等杂质,因此杂质的去除是进行第三步“杂质去除和藻毒素初步分离”中最重要和关键的技术。C18反相柱是常用的藻毒素富集和去除杂质的方法,在洗脱过程中,一部分色素与藻毒素同时被洗下来,很难分离,给后续的分离纯化工作带来很大影响;另一部分保留在柱子上导致柱子污染而报废。我们曾用调节溶液pH的方法来去除色素,但这一方法只对极性较强的藻蓝蛋白具有较好的去除效果,而对叶绿素a等色素的去除不理想。
发明内容
本发明的目的在于提供一种微囊藻毒素提取纯化的方法。方法简单,操作简便,所用溶济可回收利用,成本低。
为了达到上述目的,本发明经过大量试验,最终筛选出了一种有机萃取剂(二氯甲烷、三氯甲烷,单独使用或任意配比混合使用)。利用这种萃取剂对水华蓝藻粗提液进行萃取,可以除掉大部分色素。其步骤如下:
A、藻毒素提取:称取一定量的干藻粉,按20~50ml/g的比例加入75%甲醇,室温15~25℃下置于摇床上振荡40~120min或在搅拌器上连续搅拌40~120min,取出后以3000~4500r/min的转速离心10~30min,取出上清液。按此步骤重复提取1~3次,并将几次提取的上清液合并,进行下一步处理。
B、杂质去除:将所得的上清液与有机萃取剂按10∶1~1∶2的比例加入分液漏斗,混和摇匀,静置15~60min,分层后弃去有机萃取剂。再次加入上述比例的萃取剂重复萃取一次,弃去有机萃取剂。剩余溶液用旋转蒸发器减压蒸发除去有机溶剂,进入后续的藻毒素初步分离步骤。
C、回收率测定:用HPLC法测定萃取前后溶液中的微囊藻毒素含量,后者与前者的比例即为回收率。色谱条件:分析柱Hypersil ODS-BP(5μm,4.6×250mm);流动相:甲醇∶0.01%三氟乙酸=68∶32等梯度洗脱;流速:1ml/min。检测波长:238nm;进样量10μL。
根据滇池收集的水华蓝藻75%甲醇提取液萃取前后对比,可以清楚看出,萃取后溶液的色素比萃取前少得多。回收率测定表明,萃取操作过程中二种微囊藻毒素MC-RR和MC-LR的回收率均达到95%以上。
本发明与已有的杂质去除技术相比,有以下的优点和效果:
1、杂质去除效率高,效果明显:经有机溶剂萃取后,大量色素得以去除,微囊藻毒素的回收率高达95%以上。
2、操作简便:萃取方法是一种常用的实验室方法,除分液漏斗外,无需使用特殊设备。
3、成本低:有机萃取溶剂经蒸馏回收,可反复利用。
附图说明
图1为室内培养的产毒蓝藻(含MC-LR,无MC-RR)75%甲醇提取液萃取前的HPLC图谱。
图2为提取液萃取后的HPLC图谱。
图3为萃取后有机萃取剂的HPLC图谱。
从以上三图可以看出,经有机溶剂萃取后,甲醇相中的杂质峰1和杂质峰3被萃取到了有机相中,杂技峰4的量也大大减少,去除杂质的效果十分明显,大大简化了后续的纯化MC-LR的步骤。
具体实施方式
1、藻毒素提取:称取10g的干藻粉,加入300ml 75%甲醇,室温下置于摇床上振荡90min或在搅拌器上连续搅拌90min,取出后以4000r/min的转速离心20min,取出上清液。按此步骤重复提取两次,将三次提取的上清液合并,进行下一步处理。
2、杂质去除:将所得的上清液与有机萃取剂按3∶1的比例加入分液漏斗,混和摇匀,静置30min,分层后弃去有机萃取剂。再次加入上述比例的萃取剂重复萃取一次,弃去有机萃取剂。剩余溶液用旋转蒸发器减压蒸发除去有机溶剂,进入后续的藻毒素初步分离步骤。
3、回收率测定:用HPLC法测定萃取前后溶液中的微囊藻毒素含量,后者与前者的比例即为回收率。色谱条件:分析柱Hypersil ODS-BP(5μm,4.6×250mm);流动相:甲醇∶0.01%三氟乙酸=68∶32等梯度洗脱;流速:1ml/min。检测波长:238nm;进样量10μL。
Claims (1)
1、一种微囊藻毒素纯化的方法,它包括下列步骤:
A、藻毒素提取:称取干藻粉,按20~50ml/g的比例加入75%甲醇,室温下置于摇床上振荡40~120min或在搅拌器上连续搅拌40~120min,取出后以3000~4500r/min的转速离心10-30min,取出上清液;
B、杂质去除:将所得的上清液与有机萃取剂按10∶1~1∶2的比例加入分液漏斗,混和摇匀,静置15~60min,分层后弃去有机萃取剂,再次加入上述比例的萃取剂重复萃取一次,弃去有机萃取剂;
C、回收率测定:用HPLC法测定萃取前后提取液中的微囊藻毒素含量,后者与前者的比例即为回收率,色谱条件:分析柱Hypersil ODS-BP 5μm,4.6×250mm,流动相:甲醇∶0.01%三氟乙酸=68∶32等梯度洗脱,流速1ml/min,检测波长238nm,进样量10μL。
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