CN1561969A

CN1561969A - 同载基因和药物的超微载体粒子及其制备方法

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Publication number: CN1561969A
Application number: CNA2004100187635A
Authority: CN
Inventors: 常津; 原续波; 胡云霞; 郭毅; 康春生; 浦佩玉
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2004-03-17
Filing date: 2004-03-17
Publication date: 2005-01-12

Abstract

本发明涉及同载基因和药物的超微载体粒子及其制备方法。本发明的同载基因和药物的超微载体粒子粒径小于1μm；制备方法包括以下步骤：1)将经超声分散过的药物和可生物降解高分子材料的初乳溶液，滴加到含乳化剂的外水相溶液中制得复乳溶液；2)连续使用电磁搅拌使复乳溶液中的有机溶剂挥发完全，通过高速离心收集载药微粒；3)通过物理络合的方式把基因药物或生物制剂引入到载药微粒上。本发明可以在室温、常压下实施，操作简单。同载药物和基因的微粒对肿瘤细胞的抑制效果远远高于单载药物或基因的粒子，因此，本发明提出的方法在药物控制载体系统、基因治疗、联合用药的方案实施中具有重要的应用前景。

Description

同载基因和药物的超微载体粒子及其制备方法

技术领域

本发明属于高分子材料技术领域，涉及同载基因和药物的超微载体粒子及其制备方法。

背景技术

基因治疗作为未来医药领域里极具潜力的一个发展方向，备受瞩目。基因治疗是通过基因工程技术，将正常的外源基因插入患者的组织细胞中补充、替代、修复原来有缺陷的基因，并抑制其表达。由此，改变细胞的遗传特性，并将其稳定的传递到子细胞中，从而达到基因治疗的目的和作用。

但是，基因治疗也存在着很多问题的。现阶段人们面临的一个重大问题就是：如何把这些外源基因输送到人体的靶细胞中，以便使其高效率的转染。通常裸露的基因无法穿越人体的免疫系统到达病患部位，而人们常采用的病毒类载体又对人体有较大毒性。因此，非病毒类的基因药物载体以其高稳定性、高靶向特异性和无毒性，越来越受到人们的重视。尤其是利用纳米技术，将基因浓缩至1-500纳米大小的微粒上，且使其表面带上负电荷，这将有利于其进入细胞核。

将药物包埋到高分子聚合物基质中形成微粒的技术有喷雾干燥法、超临界流体技术、共聚合法、相分离法、溶剂挥发法等。而相分离法和溶剂挥发法是制备亲水性药物及基因超微载体的最常用方法。但同载药物和基因超微载体的制备方法，尚未见到相关文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供同载基因和药物，兼具基因与化疗药物控释治疗于一体的超微载体粒子及其制备方法。

本发明的同载基因和药物的超微载体粒子粒径小于1μm，粒子上同载有基因和药物；基因和药物的分布结构包括以下几种形式：

1)内部包载药物表面吸附基因的超微粒子；

2)内部同时包载药物与基因的超微粒子；

3)内部同时包载药物与基因表面又吸附基因的超微粒子。

本发明同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，包括以下步骤：

1)将经超声分散过的药物和可生物降解高分子材料的初乳溶液，滴加到含乳化剂的外水相溶液中制得复乳溶液；

2)连续使用电磁搅拌使复乳溶液中的有机溶剂挥发完全，通过高速离心收集载药微粒；

3)通过物理络合的方式把基因药物或生物制剂引入到载药微粒上。

本发明的溶液包括：

A溶液：10-100份的药物溶液；

B溶液：50-200份的可生物降解高分子材料溶于有机溶剂中配成溶液；

C溶液：50-200份的带有氨基官能团的生物大分子，使其溶于去离子水中制得溶液；

D溶液：双蒸水溶液；

E溶液：10-50份的基因溶液；

根据不同的配置顺序的方法，可以只的制备分布结构不同的同载基因和药物的超微载体粒子。

1)内部包载药物表面吸附基因的超微粒子的制备：

将A溶液在超声或搅拌条件下滴加到B溶液中形成初乳溶液；将C溶液作为外水相在超声或搅拌条件下逐滴加入到初乳溶液中，制得复乳溶液；经挥发、离心、洗涤、冻干后可得到固化的微粒1#；称取50-200份量的1#粒子，将其分散在双蒸水溶液D中，然后置于恒温水浴中；将E溶液置于恒温水浴中；将D和E快速混合，用混匀震荡仪混匀，然后置于恒温水浴中反应；用冷冻离心机离心，收集粒子，清洗后冻干可得到固化的微粒；

2)内部同时包载药物与基因的超微粒子的制备：

将A溶液和E溶液在超声或搅拌条件下滴加到B溶液中形成初乳溶液；将C溶液作为外水相在超声或搅拌条件下逐滴加入到初乳溶液中，制得复乳溶液；将复乳液经挥发溶剂、离心、洗涤、冻干后可得到固化的微粒；

3)内部同时包载药物与基因表面又吸附基因的超微粒子的制备方法：

称取50-200份量的步骤2)制得的微粒，将其分散在双蒸水溶液D中，然后置于恒温水浴中；将10-50份量的基因溶液E置于恒温水浴中；将D和E快速混合，用摇匀震荡仪混匀，然后置于恒温水浴中反应；用冷冻离心机离心，收集粒子，清洗后冻干可得到固化的微粒。

本发明所采取的超微载体制备方法是对传统复乳法制备超微微粒的工艺进行了改进，从而得到了更小的，粒径分布更加均一的超微粒子。并针对超微粒子的不同应用以化学键合或物理络合的形式加入生物活性功能制剂，制得了多组分，具有生物稳定性，且兼具基因治疗、靶向定位与药物控释功能的超微载体粒子。

采用本制备方法可以包载各种药物，如消炎痛、阿克拉霉素、红霉素，以及阿霉素、表阿霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、顺铂、阿糖胞苷、博莱霉素等各种抗肿瘤药物。

本发明中采用的可生物降解高分子材料包括脂肪族聚酯类高分子材料：聚丙交酯(polylactide，PLA)和聚乙交酯(polyglycolide，PGA)及它们的共聚物(polylactide-co-glycolide，PLGA)；各种聚酸酐材料，如脂肪族聚酸酐、芳香聚酸酐、聚酯酸酐和交联聚酸酐等，典型的材料有：P(CPP-SA)、P(FA-SA)、P(FAD-SA)、P(RAM-SA)及P(CPH-SA)等。本发明中可以采用的溶解可生物降解高分子材料的溶剂可以为二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯等，或采用任意两种溶剂按一定配比混合使用。

本发明中采用的带有氨基官能团的生物大分子可以为多糖及其衍生物，如葡聚糖、O-羧甲基壳聚糖、水溶性低聚壳聚糖；及各种蛋白、氨基酸多聚物及衍生物，如多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚丝氨酸、多聚组氨酸等；还可以是多聚乙烯亚胺(PEI)、树状大分子PAMAM等阳离子多聚物。

本发明中采用的基因药物可以为各种DNA类药物，如反义寡核苷酸，质粒DNA、反义表皮生长因子受体(Antisense-EGFR)、成视网膜母细胞瘤基因(RB)、P53、P16、反义NEU等。

采用的靶向制剂，包括抗体及其片断，如M₄G₃人乳腺癌单抗、羊抗兔IgGF(ab’)₂片断；细胞因子与受体，转铁蛋白；其他活性功能制剂，如具有较高跨膜特性的TAT等多肽类物质、病理诊断类物质、干细胞。

在具体实施中，生物活性功能制剂可以是一种物质，也可以是几种物质的配合使用，主要的配合方式如下：

在药物治疗中，生物活性功能制剂可以是一种药物，亦可为靶向制剂、各类药物以及具有较高跨膜特性的TAT等多肽类物质的有机结合，这样即可增强靶向性与跨膜性，减少副作用，同时又增强了药效。

本发明提出的方法可以在室温、常压下实施，操作简单，所制得的微粒粒径小于1μm。同载药物和基因的微粒对肿瘤细胞的抑制效果远远高于单载药物或基因的粒子，最终实现提高抗肿瘤药物的药效，提高患者的生存质量。因此，本发明提出的方法在药物控制载体系统、基因治疗、联合用药的方案实施中具有重要的应用前景。

本发明得到的微粒粒径小于1μm。本发明的优点在于：(1)制得的超微粒子实现了抗癌药物与基因药物在同一微粒上的同载，大大提高了药效，达到了联合用药的目的。(2)采用生物大分子材料作为乳化剂，提高了复乳成球过程中乳滴的稳定性，避免采用其它乳化剂使微粒具有较强的细胞毒性。(3)生物大分子材料同时可用作微粒表面的修饰剂，为粒子表面带来了大量活性官能团，使制备兼具主动/被动靶向投递、药物控释和基因治疗三重功效的超微粒子成为现实。

本发明是同载药物和基因的超微粒子的制备方法，这些方法实现抗癌药物与基因联合治疗的方案，也使制备兼具主动/被动靶向投递、药物控释和基因治疗三重功效的超微粒子成为现实。制得的复合功能超微粒子加强了药效，提高了患者的生存质量。因此，这些方法在未来必将拥会有广阔的应用前景。

附图说明

图1：内部包载药物表面吸附基因的超微粒子示意图；

图2：内部同时包载药物与基因的超微粒子示意图；

图3：内部同时包载药物与基因表面又吸附基因的超微粒子；

图4：内部包载药物表面吸附基因的超微粒子的透射电镜照片；

图5：内部同时包载药物与基因的超微粒子示意图透射电镜照片；

图6：内部同时包载药物与基因表面又吸附基因的超微粒子透射电镜照片。

具体实施方式

实施例1：

采用内部包载药物表面吸附基因的超微粒子的制备方法，该例中的药物为5-Fu。将0.25g5-Fu溶于500μl去离子水中，得溶液A，B为1ml2％PLGA的二氯甲烷溶液，C为5ml0.3％O-羧甲基壳聚糖溶液，E为20μg 100μl质粒DNA(反义表皮生长因子受体)。将5-Fu溶液在超声分散的条件下(200W，30S)加入到PLGA溶液中。将O-羧甲基壳聚糖溶液在超声分散(60W，20S)条件下滴加到初乳溶液中。将复乳液在搅拌条件下(1,200r/min)进行溶剂挥发3小时。用高速离心机12,000r/min离心15分钟收集制得的粒子，用双蒸水洗涤3次，然后冷冻干燥24h备用。精确称取冻干所得粒子600μg分散在双蒸水中，然后置于55℃的恒温水浴中10分钟。再将质粒DNA置于55℃恒温水浴中10分钟。将二者快速混合，用摇匀震荡仪混匀10秒，然后置于55℃恒温水浴中反应2小时；用冻干离心机离心，收集粒子，清洗后冻干。

本发明实施例1制备的产物如图1所示，图1为产物的示意图，图4为其透射电子显微镜照片(日本电子光学公司JEM-100CXII型透射电子显微镜)，由图可见，用本方法制备的同载超微粒得多重核壳结构，平均粒径为350nm左右，且粒径分布较窄。

实施例2：

与实施例1不同的是B为1ml6％PLA的丙酮溶液。将5-Fu溶液在搅拌条件下(800r/min)加入到PLA溶液中。将O-羧甲基壳聚糖溶液在搅拌条件下(1000r/min)滴加到初乳溶液中。将复乳液在搅拌条件下(1,200r/min)进行溶剂挥发3小时。用高速离心机12,000r/min离心15分钟收集制得的粒子，用双蒸水洗涤3次，然后冷冻干燥24h备用。精确称取冻干所得粒子600μg分散在双蒸水中，然后置于55℃的恒温水浴中10分钟。再将质粒DNA(反义表皮生长因子受体)置于55℃恒温水浴中10分钟。将二者快速混合，用摇匀震荡仪混匀10秒，然后置于55℃恒温水浴中反应2小时；用冻干离心机离心，收集粒子，然后冻干。即得平均粒经为220nm的同载药物与基因的超微粒子。

实施例3：

采用内部同时包载药物与基因的超微粒子的制备方法，该例中的药物为5-Fu和质粒DNA(反义表皮生长因子受体)。A为0.25g 5-Fu 500μl溶液和25μg 100μl质粒DNA溶液，B为1ml2％PLGA的二氯甲烷溶液，C为5ml0.3％O-羧甲基壳聚糖溶液。E为20μg 100μl质粒DNA。将5-Fu溶液和质粒DNA溶液在超声分散的条件下(40W，20S)加入到PLGA溶液中。将O-羧甲基壳聚糖溶液在超声分散(60W，20S)滴加到初乳溶液中。将复乳液载搅拌条件下(1,200r/min)进行溶剂挥发3小时。用高速离心机12,000r/min离心15分钟收集制得的粒子，用双蒸水洗涤3次，然后冷冻干燥24h收集粒子，即得平均粒经为510nm的同载药物与基因的超微粒子。

本发明实施例3制备的产物如图2所示，图2为产物的示意图，图5为其透射电子显微镜照片(日本电子光学公司JEM-100CXII型透射电子显微镜)，由图可见，用本方法制备的同载超微粒得多重核壳结构，平均粒径为510nm左右。

实施例4

与实施例3不同的是该例中的药物为甲氨喋呤和质粒DNA(反义表皮生长因子受体)。A为0.50g甲氨喋呤500μl溶液和25μg 100μl质粒DNA溶液，B为1ml2％PLGA的二氯甲烷溶液，C为10ml0.6％O-羧甲基壳聚糖溶液。E为20μg 100μl质粒DNA。将甲氨喋呤溶液和质粒DNA溶液在在搅拌条件下(800r/min)加入到PLGA溶液中。将O-羧甲基壳聚糖溶液在搅拌条件下(1 000r/min)滴加到初乳溶液中。将复乳液在搅拌条件下(1,200r/min)进行溶剂挥发3小时。用高速离心机12,000r/min离心15分钟收集制得的粒子，用双蒸水洗涤3次，然后冷冻干燥24h后收集粒子，即得平均粒经为260nm的同载药物与基因的超微粒子。

实施例5

采用内部同时包载药物与基因表面又吸附基因的超微粒子的制备方法，该例中的药物为5-Fu和质粒DNA(反义表皮生长因子受体)。A为0.25g 5-Fu 500μl溶液和25μg 100μl质粒DNA溶液，B为1ml2％PLGA的二氯甲烷溶液，C为10ml0.3％O-羧甲基壳聚糖溶液。E为20μg 100μl质粒DNA。将5-Fu和质粒DNA溶液在超声分散的条件下(40W，30S)加入到PLGA溶液中。将O-羧甲基壳聚糖溶液在超声分散(60W，20S)滴加到初乳溶液中。将复乳液载搅拌条件下(1,200r/min)进行溶剂挥发3小时。用高速离心机12,000r/min离心15分钟收集制得的粒子，用双蒸水洗涤3次，然后冷冻干燥24h收集粒子。精确称取冻干所得粒子600μg分散在双蒸水中，然后置于55℃的恒温水浴中10分钟。再将质粒DNA置于55℃恒温水浴中10分钟。将二者快速混合，用摇匀震荡仪混匀10秒，然后置于55℃恒温水浴中反应2小时；用冻干离心机离心，收集粒子，清洗后冻干。即得平均粒径为470nm，对人脑胶质瘤细胞TJ905的抑制率在第六天达到73.6％。

本发明实施例5制备的产物如图3所示，图3为产物的示意图，图6为其透射电子显微镜照片(日本电子光学公司JEM-100CXII型透射电子显微镜)，由图可见，用本方法制备的同载超微粒得多重核壳结构，平均粒径为470nm左右。

实施例6

方法与实施例5相同，不同的是外水相采用10ml0.3％多聚赖氨酸溶液，其余条件原料相同。最后制得的超微粒子平均粒径为340nm。

实施例7

方法与实施例5相同，不同的是药采用0.25g 5-Fu 500μl溶液和25μg 100μl的反义寡核苷酸，其余条件原料相同。最后制得的超微粒子平均粒径为400nm。

实施例8

方法与实施例5相同，不同的是药采用0.50g甲氨喋呤500μl溶液和25μg 100μl的反义寡核苷酸，其余条件原料相同。最后制得的超微粒子平均粒径为250nm。

实施例9

方法与实施例5相同，不同的是外水相采用10ml0.3％多聚赖氨酸溶液，药采用0.25g 5-Fu500μl溶液和25μg 100μl的反义寡核苷酸，其余条件原料相同。最后制得的超微粒子平均粒径为300nm。

实施例10

方法与实施例5相同，不同的是外水相采用10ml0.3％多聚赖氨酸溶液，药采用0.50g甲氨喋呤500μl溶液和25μg 100μl的反义寡核苷酸，其余条件原料相同。最后制得的超微粒子平均粒径为320nm。

本发明公开和提出的制备方法和产品，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变原料、工艺参数、结构设计等环节实现。本发明的方法与产品已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和产品进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims

1.一种同载基因和药物的超微载体粒子，其特征是：粒子的粒径小于1μm，粒子上同载有基因和药物。

2.如权利要求1所述的一种同载基因和药物的超微载体粒子，其特征是所述的粒子上同载的基因和药物的分布结构包括以下几种形式：

1)内部包载药物表面吸附基因的超微粒子；

2)内部同时包载药物与基因的超微粒子；

3)内部同时包载药物与基因表面又吸附基因的超微粒子。

3.一种同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，包括以下步骤：

4.如权利要求3所述的一种同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，其特征是所述溶液包括：

A溶液：10-100份的药物溶液；

D溶液：双蒸水溶液；

E溶液：10-50份的基因溶液；

5.如权利要求4所述的一种同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，其特征是根据不同的配置顺序的方法，制备分布结构不同的同载基因和药物的超微载体粒子：所述不同的配置顺序的方法如下：

1)内部包载药物表面吸附基因的超微粒子的制备：

2)内部同时包载药物与基因的超微粒子的制备：

6.如权利要求4所述的一种同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，其特征是所述药物溶液包括各种抗肿瘤药物和消炎痛、阿克拉霉素、红霉素、阿霉素、表阿霉素、甲氨喋呤、氟尿嘧啶、顺铂、阿糖胞苷、博莱霉素。

7.如权利要求4所述的一种同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，其特征是所述可生物降解高分子材料包括脂肪族聚酯类高分子材料、聚丙交酯和聚乙交酯及它们的共聚物；包括各种聚酸酐材料，脂肪族聚酸酐、芳香聚酸酐、聚酯酸酐和交联聚酸酐。

8.如权利要求4所述的一种同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，其特征是所述带有氨基官能团的生物大分子为多糖及其衍生物，包括葡聚糖、O-羧甲基壳聚糖、水溶性低聚壳聚糖；各种蛋白、氨基酸多聚物及衍生物，包括多聚赖氨酸、多聚精氨酸、多聚丝氨酸、多聚组氨酸；还可以是多聚乙烯亚胺(PEI)、树状大分子PAMAM等阳离子多聚物。

9.如权利要求4所述的一种同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，其特征是所述的基因药物可以为各种DNA类药物，包括反义寡核苷酸，质粒DNA、反义表皮生长因子受体(Antisense-EGFR)、成视网膜母细胞瘤基因(RB)、P53、P16、反义NEU。

10.如权利要求4所述的一种同载基因和药物的超微载体粒子的制备方法，其特征是所述的靶向制剂，包括抗体及其片断，如M₄G₃人乳腺癌单抗、羊抗兔IgGF(ab’)₂片断；细胞因子与受体，转铁蛋白；其他活性功能制剂，包括具有较高跨膜特性的TAT等多肽类物质、病理诊断类物质、干细胞；生物活性功能制剂可以是一种物质，也可以是几种物质的配合使用。