CN1560115A - 蚕丝蛋白纳米微球及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于一种全新的纳米微球及其制备方法。制备过程运用生物纳米技术，使蚕丝蛋白质在适当条件下发生自组装形成纳米微球，整个制备过程中无需加入任何引发剂、表面活性剂、交联剂等，从而彻底解决了现有传统载药纳米微球制备方法引入上述物质对人体存在潜在威胁的问题。本发明制备工艺简单易行，可以制备粒径80～2000nm的单分散纳米微球，制备的纳米微球稳定性和再分散性好，可长时间稳定保存。

Description

蚕丝蛋白纳米微球及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米技术、高分子化学、生物化学、蛋白质、医药学、生物技术领域，具体涉及一种天然生物大分子—蚕丝蛋白纳米微球及其制备方法。
背景技术
蚕丝是人类最早利用的天然蛋白之一，是一种由丝蛋白(70～80％)和丝胶组成的蛋白质纤维，作为性能优良的天然纤维一直用于纺织行业。近年来，随着生物医药技术的迅速发展，丝蛋白由于其良好的生物相容性、无抗原性、易降解性等特性，已广泛应用于保健品、医药、生物技术、精细化工等诸多领域，如医用缝合线、组织工程、医用敷料、智能水凝胶、载药缓释膜以及生物传感器等。本发明人曾用丝蛋白溶液和脲酶、葡萄糖氧化酶混合制备灵敏度很高的酶电极。
纳米生物技术是国际生物技术领域的前沿和热点问题，在医药卫生领域有着广泛的应用和明确的产业化前景，特别是纳米药物载体、纳米生物传感器和成像技术以及微型智能化医疗器械等，将在疾病的诊断、治疗和卫生保健方面发挥重要作用。近年来纳米生物技术取得了重大进展，纳米微粒作为基因、抗癌药、蛋白质以及多肽药物和抗生素等载体，在生物医药界引起了广泛的兴趣与重视。载药纳米微粒作为一种药物缓释和控释的新剂型在药物输送方面具有许多优越的性能，药物纳米载体具有高度靶向、药物控制释放、提高难溶药物的溶解率和吸收率等优点，还可提高药物疗效和降低毒副作用，提高药物的生物利用度，还可提高药物的稳定，建立新的给药途径，为蛋白质或多肽类药物口服提供了可能。
目前，纳米药物载体，主要为天然或人工合成的可降解高分子为基质。常用的天然生物高分子有：白蛋白、明胶、海藻酸钠、壳聚糖等；人工合成的高分子材料有：聚酯、聚酸酐、聚氨酯等，如聚丙交脂(PLA)、聚己交脂(PGA)、聚己内脂(PCL)、PMMA、聚苯乙烯(PS)、纤维素-聚乙烯、聚羟基丙酸脂等。
由于合成高分子材料中痕量的引发剂和有毒有机物以及其它杂质的残留问题在生物安全要求日益严格的今天越来越成为了一个有待争议的问题。近年来，天然生物高分子材料由于其独特的生物相容性而颇受人们的关注。特别是海藻酸钠、壳聚糖、白蛋白等已部分进入临床试验研究。
蚕丝蛋白由十八种氨基酸组成，可以通过外界或集体本身的作用，将丝蛋白降解为有益人体健康的小分子多肽甚至游离氨基酸，进而被机体组织完全吸收或排除。
目前，蚕丝蛋白用于药物释放载体的研究刚刚起步，剂型比较单一，主要为膜和水凝胶的形式。由于丝蛋白溶液在外界扰动等外界影响下很容易变性，用常规的方法很难得到微粒或纳米微粒，这大大的限制了他的应用范围。目前广泛研究几类天然高分子纳米微粒均或多或少存在诸如抗原性、引发剂残留、表面活性剂残留以及需加交联剂等一系列问题，对人体存在潜在的威胁。
基于以上的情况，本发明用蛋白质易变性的特点，在特定条件下诱导蛋白质自组装形成纳米微球，从根本上彻底解决了以上问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全新的蛋白质纳米微球及其制备方法。
本发明提出的制备纳米微球的方法，是一种蚕丝蛋白自组装的方法，具体以再生丝蛋白为原料，用甲醇等有机溶剂作变性剂诱导蛋白质变性，然后冷冻-解冻后得乳白色乳液；对乳液进行离心处理，去除上清液，再经真空干燥或冷冻干燥，即得到纳米微球。
上述方法中，所用的丝蛋白由工业废蚕丝，经脱胶、中性盐溶解后透析制备获得，浓度为0.1～10％。
上述方法中，添加的变性剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、乙二醇、丙三醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、丙酮等之一种或几种。变性剂的用量为丝蛋白溶液体积的0.01～10倍。
上述方法中，冷冻温度为-80～0℃，时间为12～96小时。解冻可以在室温下解冻。
上述方法的操作步骤如下：将废蚕丝用0.1～3.0％的NaHCO3或NaCO3溶液，或0.1～1.0mol/l的硼酸-硼砂缓冲溶液，在90～100℃的温度下处理20～90分钟，然后用去离子水漂洗干净；按需要重复1～5次以完全脱除丝胶；65～40℃下干燥20～30小时，接着将脱胶干燥后的丝蛋白用中性盐(如7～10mol/L的BrLi溶液)或CaCl2-H2O-C2H5OH三元体系恒温25～90℃搅拌下溶解，溶液灌入通量为10,000～1,4000的纤维素透析袋中，用去离子水透析60-80小时，制备的丝蛋白调配成浓度为0.1～10.0％的溶液。
取5ml丝蛋白溶液，在20-30℃低速搅拌下滴加0.1～20ml变性剂，放入变温冰箱冷冻12～96小时。取出结冰的丝蛋白溶液室温下解冻之后即得到白色乳液，乳液经10000-15000G高速离心5～30min，去除上层清液再放入真空干燥机干燥或低温冷冻干燥即得到丝蛋白纳米微粒。
上述方法制备的丝蛋白纳米微球具有很好的单分散性和外形规整性，用扫描电子显微镜和光散射检测如附图1、2所示。其粒径为80-2000nm，单分散指数为0.04-0.36。制备时可以通过调节丝蛋白浓度、变性剂添加量、冷冻时间、冷冻温度等参数控制粒径大小。产物稳定性、再分散性良好。
与现有技术相比，采用本发明的的有益效果如下：
本发明的技术方案比已有的技术有显著的进步和创新：本发明利用变性剂诱导丝蛋白构象转变后在低温下自组装制得单分散性好的球形纳米微粒，整个工艺工程无需添加任何引发剂、表面活性剂、交联剂和有毒有机溶剂，具有更高的生物安全性。此外，丝蛋白是一种弱的两性聚电解质，pI为3.9～4.2，具有潜在的pH敏感性，可以在不同的pH条件下控制释放。同时丝蛋白是一种纯天然生物大分子，在体内可完全降解，是作为药物载体的理想材料。本发明的工艺过程简单，成本低廉，因此，本发明在生物医药领域具有重要的应用价值。
具体实施方式
以下利用实施例进一步详细说明本发明。
实施例1：将20g左右废蚕丝浸入1L 0.5％NaHCO3溶液中，搅拌煮沸45min后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作一次后将蚕丝65℃下烘干备用。
称取上述处理后的脱胶蚕丝5g溶解于100ml浓度为9.6mol/L的BrLi溶液中，45℃下恒温低速磁力搅拌下溶解。将此蛋白质溶液灌入纤维素透析袋中，用去离子水透析三天，得到浓度为4.32％的丝蛋白水溶液。
取上述丝蛋白溶液5ml，25℃恒温水浴下滴加1ml甲醇，稳定5min后放入低温冰箱-5℃下冷冻96h。丝蛋白冷冻96h后形成乳白色冰块，室温下解冻形成牛奶状乳白色乳液，乳液经1,2000G高速离心10min，去除上层清液再真空干燥即得到粒径335.8nm、多分散指数PI为0.332的丝蛋白纳米微粒。
实施例2：将15g左右废蚕丝浸入1L 0.5％Na2CO3溶液中，搅拌煮沸50min后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作两次后将蚕丝65℃下烘干备用。
称取上述处理后的脱胶蚕丝5g溶解于100ml浓度为10.0mol/L的BrLi溶液中，45℃下恒温低速磁力搅拌下溶解。将此蛋白质溶液灌入纤维素透析袋中，用去离子水透析三天，得到浓度为3％的丝蛋白水溶液，再通过稀释，调节丝蛋白溶液浓度为1.5％。
取上述丝蛋白溶液10ml，25℃恒温水浴下滴加3ml丙酮，稳定5min后放入低温冰箱-20℃下冷冻48h。丝蛋白冷冻后形成乳白色冰块，室温下解冻形成牛奶状乳白色乳液，乳液经1,2000G高速离心10min，去除上层清液再真空干燥即得到粒径270.3nm、多分散指数PI为0.04的丝蛋白纳米微粒。
实施例3：将20g左右废蚕丝浸入2L 0.5mol/L的硼酸-硼砂缓冲溶液溶液中，搅拌煮沸60min后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作一次后将蚕丝65℃下烘干备用。
称取上述处理后的脱胶蚕丝4g溶解于100ml浓度为10.0mol/L的BrLi溶液中，45℃下恒温低速磁力搅拌下溶解。将此蛋白质溶液灌入纤维素透析袋中，用去离子水透析三天，得到浓度为2.0％的丝蛋白水溶液。
取上述丝蛋白溶液10ml，25℃恒温水浴下滴加5ml乙醇，稳定5min后放入低温冰箱-40℃下冷冻36h。丝蛋白冷冻后形成乳白色冰块，室温下解冻形成牛奶状乳白色乳液，乳液经1,2000G高速离心25min，去除上层清液再真空干燥即得到粒径276.1nm、多分散指数PI为0.16的丝蛋白纳米微粒。
实施例4：将20g左右废蚕丝浸入2L 0.5mol/L的硼酸-硼砂缓冲溶液溶液中，搅拌煮沸60min后取出，用去离子水洗涤干净。重复以上操作一次后将蚕丝65℃下烘干备用。
称取上述处理后的脱胶蚕丝10g溶解于100ml浓度为CaCl2-H2O-C2H5OH三元溶液中，80℃下恒温低速磁力搅拌下溶解。将此蛋白质溶液灌入纤维素透析袋中，用去离子水透析三天，得到浓度为5.0％的丝蛋白水溶液。
取上述丝蛋白溶液5ml，25℃恒温水浴下滴加3.0ml丙醇，稳定5min后放入低温冰箱-80℃下冷冻36h。丝蛋白冷冻后形成乳白色冰块，室温下解冻形成牛奶状乳白色乳液，乳液经1,5000G高速离心30min，去除上层清液再真空干燥即得到粒径667.5nm、多分散指数PI为0.356的丝蛋白纳米微粒。

Claims (7)

1.一种蚕丝蛋白纳米微球，其特征在于粒径为80～2000nm，单分散指数为0.04～0.36。
2.根据权利要求1所述的蚕丝蛋白纳米微球，其特征在于粒径为100～1000nm。
3.一种如权利要求1所述的蚕丝蛋白纳米微球的制备方法，其特征在于丝蛋白溶液和有机溶剂混合，经冷冻-解冻后获得白色乳液；乳液经离心除去上层清液后再经真空干燥或冷冻干燥得到丝白色纳米微球。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于丝蛋白的浓度为0.1～10％。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于有机溶剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丙三醇、丁醇、异丁醇、叔丁醇、乙二醇、丙酮之一种或几种。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：有机溶剂加入的体积为蚕丝蛋白溶液体积的0.01～10倍。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于冷冻温度为-80～0℃，冷冻时间为12～96小时。
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