CN1546486A - 枫杨素及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及枫杨素及其制备方法和用途。本发明从东京枫杨树中提取了二苯基环氧庚烷类新化合物。经实验证实,该类化合物可作为细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂或抗肿瘤剂。
Description
技术领域:
本发明涉及枫杨素(Pterocarine)及其制备方法和用途。具体涉及从东京枫杨中提取的二苯基环氧庚烷类新化合物、该类化合物和制备方法,以及这类物质作为细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂或肿瘤细胞杀伤剂即抗肿瘤剂的用途。
背景技术:
二苯基环氧庚烷类化合物已有一些文献报道,如文献[Motohiko Morihara,e.al.,Twonovel diarylheptanoid glucosides from Myrica gale var.tomentosa and absolute structure ofplane-chiral galleon.Chem.Pharm.Bull.,1997,45(5):820-823]和文献[Gabriela IslasGonzalez,et al.,A unified strategy toward the synthesis of acerogenin-type macrocycles:Totalsyntheses of acerogenina A,B,C,and L and aceroside IV.J.Org.Chem.,1999,64,914-924]曾分别报道了二苯基环氧庚烷类天然和人工合成的化合物,但尚未见该类化合物具有细胞周期抑制和细胞凋亡诱导活性的报道。
东京枫杨Pterocarya tonkinesis(Franch.)Dode.是一种胡桃科枫杨属植物,在我国部分地区作为民间药物用于治疗癌症,但其提取物的化学及药理研究至今尚未见有报道。也未见从东京枫杨中分离得到天然二苯基环氧庚烷类化合物的文献报道。
发明内容:
本发明旨在提供一类具有抑制细胞周期周转、诱发癌细胞凋亡以及抑制癌细胞增殖等抗肿瘤活性的新化合物。
本发明首次发现东京枫杨的粗提物有很好的细胞凋亡诱导、细胞周期抑制及对癌细胞的增殖抑制等抗肿瘤活性,遂对其活性成分进行了研究。发现下述通式I所示二苯基环氧庚烷类新枫杨素类化合物具有抗肿瘤活性:
式I
式I中,R1为羟基、烷氧基、酰氧基或氢原子;R2为羟基、烷氧基、酰氧基或氢原子。
上述式I化合物的制备方法是,用醇或含水醇提取东京枫杨的干燥茎皮,得粗浸膏,然后从粗浸膏中分离纯化而得到。
所述醇是甲醇、乙醇;所述含水醇是60~70%的含水乙醇;所述分离纯化包括利用本领域技术人员熟知的天然产物分离纯化的常规方法,如液液萃取、柱层析、薄层层析及重结晶等。其中柱层析和重结晶精制可反复进行多次。
经实验证实,本发明发现的式I化合物对肿瘤细胞具有抑制细胞周期、诱发凋亡以及抑制增殖等作用,因此可用作细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂、或肿瘤增殖抑制剂。
本发明采用丽丝胺罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)法和流式细胞术结合显微镜下检测细胞形态特征的方法,测试了式I化合物对小鼠乳腺癌tsFT210细胞、人慢性髓性白血病K562细胞及人大肠癌HCT-15细胞的细胞周期抑制和细胞凋亡诱导以及对该细胞的增殖抑制等作用。
本发明的枫杨素类化合物对肿瘤细胞的生物学作用特征是:在不同浓度或不同作用时间的条件下,对癌细胞可通过或抑制癌细胞的细胞周期周转,或诱发癌细胞凋亡,来显示抑制肿瘤细胞增殖的生物学活性,从而发挥其抗肿瘤作用。
本发明的枫杨素类化合物可通过加入药物或试剂可接受的辅料或溶剂制成抗肿瘤剂或细胞周期抑制剂和细胞凋亡诱导剂,来用于肿瘤的治疗或生命科学研究。在生命科学研究中作为抑制细胞周期或诱发细胞凋亡的低分子生物探针加以利用时,本发明的化合物可溶于甲醇、含水甲醇或水中使用,也可以用二甲基亚砜的含水溶液溶解使用。
附图说明:
图1是化合物I在甲醇中的紫外吸收光谱;
图2是化合物I的红外吸收光谱(KBr);
图3是化合物I在氘代吡啶中的1H核磁共振谱;
图4是化合物I在氘代吡啶中的13C核磁共振谱;
图5是人慢性髓性白血病K562细胞经不同浓度的化合物I处理24小时后测得的流式细胞术直方图。左上图为空白对照组,其余为不同浓度的化合物I(浓度见每个图右上方)处理组,图中曲线部为实测数据,黑色填充部为计算值。
具体实施方式:
实施例1 化合物I的分离精制
化合物I
式中,阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位。
取东京枫杨的干燥茎皮(3.5公斤)粉碎,用10升60%的乙醇室温浸泡6天,滤取含水乙醇溶液(同样提取共进行8次),合并提取液,减压浓缩至不含乙醇(约2升),用等体积的氯仿萃取4次,合并氯仿萃取液,浓缩干燥,得到氯仿萃取物10.4克。
取氯仿萃取物(10.4克),用适量氯仿溶解后加10克薄层层析硅胶G拌样,用194克硅胶H干法上减压柱,用氯仿→甲醇梯度洗脱层析分离,得到34个流份。对各流份进行薄层检查及在每毫升50微克浓度下的活性测试,并根据结果合并相关流份,得到活性组份Fr-5(2.1克,氯仿洗脱部分)。将Fr-5全部上Sephadex-LH20柱,用氯仿-甲醇(1∶1)洗脱层析,共得到130个流份,经合并相关流分,得活性组分Fr-5-4共1.6克。用适量氯仿溶解组份Fr-5-4(1.6克),并加入5克薄层层析硅胶G拌样,用35克硅胶H上减压柱,石油醚-氯仿梯度洗脱层析,从石油醚-氯仿(30∶70)洗脱流份中得到活性组份Fr-5-4-14(25毫克)。该组份Fr-5-4-14经制备硅胶薄层层析(氯仿-甲醇95∶5展开)分离,刮取极性大的(Rf=0.2)条带,用氯仿-甲醇(90∶10)洗脱并将获得的化合物I粗品通过ODS滴管小柱(甲醇洗脱)精制,得化合物I纯品5.8毫克。
化合物I 白色无定形粉末,[α]D 27+60.5(c1.0,CHCl3),分子式C19H20O4,TOF-MS m/z:313[M+H]+;Positive HR-TOF-MS m/z:实测值313.1452[M+H]+,计算值313.1440(C19H21O4[M+H]+)。UVλmaxnm(logε)in MeOH:281.5(3.42),222.5sh(3.95),204.5(4.37,末端吸收)。IRνmax cm-1(KBr):3404(OH),3032(olefin protons),293,28581(methyleneprotons),1708(ketocarbonyl),1597,1517,1503(aromatic rings),1439,1368,1343,1288,1269,1225(C-O),1187,1116,953(m),887(vs),828(s),743(w),645(w),600(w),452(w)。1H及13CNMR数据见表1。
表1化合物I在氘代氯仿中的600MHz1H和150MHz13CNMR数据a)
位置标号 δH(Jin Hz) 1H-1H COSYb) δC HMBCc)
1 2.82d)AB type 1(δ2.87),2 27.26t 2,2′,6′
2.87d)AB type 1(δ2.82)
2 2.28ddd(16.7,8.3,2.7) 41.12t 1
1,2(δ2.36)
2.36ddd(16.7,8.8,2.8)
3 —— 210.47s 1,2,4
4 1.82e)AB type 4(δ1.89),5 46.43t 5,6
1.89e)AB type
5 1.56(2H)m 4,6 18.99t 4,6,7
6 1.64m 5,6(δ1.68),7 27.22t 4,5,7
1.68m
7 2.67f)AB type 6,7(δ2.71) 35.60t 6,2″,5,6″
2.71f)AB type 6,7(δ2.67)
1′ —— 133.95s 1,2,2′,5′
2′ 5.57g)d(2.2) 6′ 112.51d 1,6′
3′ —— 146.77s 2′,5′
4′ —— 142.87s 2′,6′
5′ 6.83d(8.0) 6′ 115.57d 6′
6′ 6.64dd(8.0,2.2) 2′,5′ 122.75d 1,2′
1″ —— 140.58s 2″,5″,6,7
2″ 6.94d(1.9) 6″ 117.95d 6″,7
3″ —— 148.79s 2″,5″
4″ —— 140.61s 2″,6″
5″ 6.89d(8.0) 6″ 123.41d
6″ 6.82dd(8.0,1.9) 2″,5″ 122.88d 2″,7
4′-O
H 5.79brs ——
3″-O
H 5.71h)brs ——
a)本表信号归属基于DEPT、PFG1H-1H COSY、PFG HMQC及PFG HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。b)此栏中的数字和代号分别代表在PFG1H-1H COSY谱中与相应行中的1H给出偶合相关信号的1H核。c)此栏中的数字和代号分别代表在PFGHMBC(1JCH=8Hz)中与相应行中的碳信号给出远程杂核相关(HMBC)信号的1H核。d)从PFG1H-1H COSY谱中在2′-H和6′-H之间检测相隔四根键的远程相关信号。
e)在PFG1H-1H COSY谱中该氢与6-H(δ1.68)之间检测到W-型远程相关信号。f)该氢与2″-H之间在PFG 1H-1H COSY谱中给出远程相关信号。g)在PFG NOESY谱中,在2′-H与″-H之间以及在2′-H与3″-OH之间分别检测到NOE。h)在PFG NOESY谱中,在3″-OH与2′-H之间以及在3″-OH与4′-OH之间分别检测到NOE。
实施例2 对癌细胞细胞增殖和细胞周期的抑制活性及细胞凋亡诱导活性测试
1实验样品及实验方法
被测样品溶液的配制 取上述实施例1中分离精制的纯品化合物I,精密称取适量,用甲醇配制成所需浓度的溶液,供测活性。
细胞系及细胞培养 活性测试采用小鼠乳腺癌tsFT210细胞、人慢性髓性白血病K562细胞及人大肠癌HCT-15细胞等哺乳动物的癌细胞系。各种细胞均用含10%FBS的RPMI-1640培养基,在32℃(tsFT210细胞)或在37℃(K562细胞及HCT-15细胞)于通入5%二氧化碳的培养箱中继代培养。
细胞增殖抑制活性测试方法(SRB法)
本法明采用SRB(sulforhodamine B,丽丝胺罗丹明B)法,测试评价了被测试样品对癌细胞增殖的抑制活性。
取对数生长期的tsFT210、K562或HCT-15细胞,用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液,按每孔200微升接种于96孔板中,每孔加入2微升不同浓度的样品溶液,32℃下培养17小时(tsFT210细胞)或37℃下培养24小时(K562细胞和HCT-15细胞)。取药物作用下培养后的细胞,首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化,判断有无细胞周期抑制,细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征,继而在4℃、3000转/分钟条件下下离心3分钟,吸去上清。每孔细胞中加入20%三氯醋酸50微升,置于4℃固定1小时,用水冲洗5次并空气干燥。每孔加入0.4%SRB的醋酸溶液50微升并在室温静置30分钟。用1%醋酸水清洗4次,除去未结合的游离SRB染料。每孔加入150微升Tris缓冲液(10mmol/L,pH10.5)溶解蛋白结合染料并利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在520nm处的光密度(OD)值。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔,另设三孔作为空白对照。取三孔平均OD值按IR%=(OD空白对照-OD样品)/OD空白对照×100%式计算每个浓度下的细胞增殖抑制率(IR%),再利用Bliss方法,由各种浓度的抑制率(IR%)求得半数抑制浓度(IC50)。同样的测试和计算分别进行三次,求得IC50的平均值和标准差。
细胞周期抑制和细胞凋亡诱导活性的流式细胞术测试方法
取对数生长期的tsFT210、K562或HCT-15细胞,用新鲜的RPMI-1640培养基配制成密度为每毫升2×105个细胞的细胞悬液,按每孔0.5毫升接种于24孔板中,每孔加入5微升不同浓度的样品溶液,32℃下培养17小时(tsFT210细胞)或37℃下培养24小时(K562细胞和HCT-15细胞)。取药物作用下培养后的细胞,首先在光学显微镜下观察药物处理引起的形态学变化,判断有无细胞周期抑制,细胞凋亡或细胞坏死的形态学特征,必要时进行拍照。继而将细胞分别从24孔板转移至1.5毫升Eppendorf离心管中,4℃下3000转/分离心3分钟,吸去上清液,加0.5毫升磷酸缓冲溶液(PBS)震荡洗涤一次,相同条件下离心收集细胞,加150微升碘化丙啶(PI)水溶液(在100毫升水中含5毫克PI、100毫克柠檬酸纳和200毫克NP-40),4℃下染色30分钟后,加入150微升PBS稀释,用流式细胞仪分析测定细胞中DNA的含量分布。细胞在细胞周期各时相中的分布利用库尔特公司产计算机软件WinCycle进行分析计算。
2实验结果
SRB法测试结果:在每毫升100微克的浓度下化合物I对小鼠乳腺癌tsFT210细胞的增殖抑制率为20.2±2.4%,对人大肠癌HCT-15细胞的增殖抑制率为23.8±2.4%;化合物I对人慢性髓性白血病K562细胞的活性更强,其半数抑制浓度(IC50)为81.8±15.6%。
流式细胞术分析结果:用不同浓度的化合物I分别处理tsFT210细胞17小时、K562和HCT-15细胞各24小后,用流式细胞术分析测得的化合物I的细胞周期抑制及细胞凋亡诱导活性测试结果见表2。
表2化合物I对细胞周期作用的流式细胞术分析结果(平均值±标准差,n=3)
细胞系 浓度(μg/ml) sub-G0/G1% G0/G1% S% G2/M%
tsFT210 空白对照 0.2±0.02 35.7±1.0 47.8±0.6 16.4±0.8
100.0 0.2±0.03 46.4±1.7 41.5±1.0 12.1±0.8
空白对照 6.8±0.8 36.9±2.2 47.1±0.2 16.0±2.1
HCT-15
100.0 18.8±4.4 51.2±2.4 30.1±2.7 12.4±0.7
空白对照 2.2±0.5 30.5±0.6 53.3±0.9 15.8±0.6
60.0 3.3±0.7 49.4±0.6 43.1±3.0 7.5±2.4
K562
80.0 9.0±3.3 44.0±4.8 40.0±0.1 15.5±5.1
100.0 11.3±0.3 34.9±3.0 50.8±3.2 13.9±0.2
注:本表数据系将药物处理后的细胞经碘化丙啶染色后用流式细胞术分析测得结果。
表2数据表明,化合物I在每毫升100微克和每毫升60微克以上时分别将tsFT210及HCT-15细胞和K562细胞的细胞周期抑制在G0/G1期,而在80微克以上时同时还诱发了K562发生显著凋亡。
化合物对癌细胞作用的形态学检测结果:
在光学倒置显微镜下观察到,K562细胞当用每毫升80毫克以上浓度的化合物I处理时,在视野中有显著的凋亡细胞即雪花瓣状细胞或膜裹着细胞碎片。每毫升100毫克的化合物I处理后的HCT-15细胞中可检测到非常显著的凋亡细胞,而每毫升100毫克的化合物I处理后的tsFT210细胞中则观测不到比空白对照更为显著的凋亡现象,满视野中体积小的细胞数显著增多,呈典型的小而较均匀的G0/G1期抑制的形态特征。
3结论
上述实验结果表明,化合物I通过抑制细胞周期周转并诱发细胞发生凋亡,来发挥其对tsFT210、K562、HCT-15等癌细胞增殖的抗肿瘤作用。因此,本发明的枫杨素类化合物可作为抗肿瘤剂(即抗肿瘤药物)用于肿瘤的治疗,也可作为抑制细胞周期周转或诱发细胞凋亡的低分子生物探针用于探索生命现象本质的生命科学实验研究中。
Claims (7)
2.权利要求1所述的式I化合物,其中,R1和R2为羟基。
3. 权利要求1所述的式I化合物的制备方法,用醇或含水醇提取东京枫杨的干燥茎皮,得粗浸膏,继而从粗浸膏中分离纯化而得到。
4.权利要求3所述的式I化合物的制备方法,所述醇是甲醇、乙醇;所述含水醇是60~70%的含水乙醇;所述分离纯化包括液液萃取、柱层析、薄层层析及重结晶。
5.权利要求1所述的式I化合物用作细胞周期抑制剂、细胞凋亡诱导剂和肿瘤细胞杀伤剂的用途。
6.权利要求1所述的式I化合物用于抑制肿瘤细胞增殖的用途。
7.权利要求1所述的式I化合物用于制备抗肿瘤药物的用途。
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