CN1519312A

CN1519312A - 一种产生生物乳化剂和降解多环芳烃的赤红球菌Em及用途

Info

Publication number: CN1519312A
Application number: CNA03101920XA
Authority: CN
Inventors: 刘志培; 李习武; 刘双江; 杨惠芳; 贾省芬; 沈锡辉; 吴建峰
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2003-01-23
Filing date: 2003-01-23
Publication date: 2004-08-11
Anticipated expiration: 2023-01-23
Also published as: CN1223673C

Abstract

本发明涉及一株赤红球菌(Rhodococcus ruber)EmCGMCC No.0868菌株，该菌株的生长细胞、细胞悬浮液、固定化细胞均可降解十六烷等烷烃以及蒽、菲、芘等多环芳烃；该菌株能以烷烃或多环芳烃为唯一碳源和能源生长，同时产生脂类生物乳化剂；该乳化剂能明显降低水溶液的表面张力、具有很强的油脂类物质的乳化能力、提高烷烃和多环芳烃在水中的溶解度、明显促进活性菌株对烷烃和多环芳烃的降解。该菌株及其产生的生物乳化剂适用于含油废水的生物处理和石油污染土壤的生物修复(生物整治)。

Description

一种产生生物乳化剂和降解多环芳烃的赤红球菌Em及用途

技术领域

本发明属于微生物生物技术和环境生物技术领域，具体地说，它涉及一株赤红球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868菌株，该菌株的生长细胞、细胞悬浮液、固定化细胞均可降解十六烷等烷烃以及蒽、菲、芘等多环芳烃；该菌株能以烷烃或多环芳烃为唯一碳源和能源生长，同时产生脂类生物乳化剂；该乳化剂能明显降低水溶液的表面张力、具有很强的油脂类物质的乳化能力、提高烷烃和多环芳烃在水中的溶解度、明显促进活性菌株对烷烃和多环芳烃的降解。该菌株及其产生的生物乳化剂适用于含油废水的生物处理和石油污染土壤的生物修复(生物整治)。

技术背景

石油是重要的能源之一，在世界各国都占有非常重要的地位，据统计全世界每天约消耗2.76×10⁹加仑的原油。由于石油的开采、储存、运输、加工、石化等过程的漏油、溢油以及突发性事故等原因，全球每年大约有1800多万吨的石油或石油烃进入环境，造成严重的污染，已成为全球性公害之一，特别是油田、输油管线和石化工厂周围的土壤、水体等环境的石油污染尤为严重，石油烃类已成为海洋污染的第二大污染源，如1989年的阿拉斯加原油泄漏造成的海洋和海岸线污染、海湾战争造成的原油污染、以及前不久在西班牙海域的油轮事故造成的海洋原油污染，造成了严重的环境生态问题，引起人们的恐慌，世界各国的广泛关注和重视石油污染问题。石油污染的危害主要表现在对土壤生态系统的结构与功能的破坏，严重影响了土壤的透气性、渗水性等，造成土壤肥力下降、粮草不长，使良田荒芜；石油进入地下水系，直接污染地下水源；在水体表面形成油膜，使水中溶解氧急剧下降，造成水生生物的大量死亡等；海洋石油开采和运输的事故常有发生，造成海洋的大面积污染；石油污染中含有大量的有毒成分，具有致畸致癌作用，可通过各种渠道(如食物链)进入人体，直接对人们的身体健康构成威胁。因此，清除环境中的石油污染已成为目前世界各国关注的紧迫问题。

我国是石油生产、石化工业大国之一，石油泄漏和石油、石化工业污水污染，已成为我国目前严重环境污染的主要污染源之一，约占每年数千起事故性环境污染的5％，统计全国每年有60多万吨的原油因采油、运输、事故等原因而泄漏，此外，我国石油炼制过程中的损失率为1.54％，现在全国每年加工2亿吨原油，每年也有300万吨石油烃排入环境，因此总计全国每年有360多万吨石油烃排入环境，由此可见石油污染对我国环境是量大、面广的污染(中国经济时报，1998年5月)，严重污染和威胁着油田、石化厂周围的环境质量和河流、湖泊的水质，如地处广大可耕作区内的华北油田有4000多口油井，胜利油田有11000多口油井，每口油井至少污染了5亩的农田，总计至少有80000亩以上的农田因石油污染而成为粮草不长的荒地，全国预计有100-200万亩的可耕地由于石油污染而荒废；此外，黄河水系年平均含油最高可达4.82mg/L，辽河水系年平均最高可达7.68mg/L，明显地超过了国家三级地面水标准(＜1mg/L)，直接排放到我国的近海水域；有的甚至污染到地下水资源(如淄博地区地下水的石油含量已达100mg/L)，影响了居民用水和农田灌溉。最近几年随着我国海上油田的开发，海洋石油污染也日益严重，根据国家海洋局《1998年中国海洋环境年报》，石油污染已成为我国海洋环境的主要污染源，1998年我国近岸海域就发生了一起大型溢油事故和20余起小型溢油事故，一半以上的近岸水体，包括渤海和黄海，以及近大陆架海河的石油污染已严重影响生态环境和渔业资源，到了非治理不可的地步。

我国目前依然主要采用机械刮油、化学吸附等方法来处理环境中的石油污染，这些方法成本高、投资大，如对一平方公里的污染区域用化学吸附法进行处理，需要几百吨至上千吨的化学吸附剂，需要几百万元的投资，且费时费力，还有二次污染，吸附后的吸附剂的处理和再生更是一个大问题，所以这些方法并不是解决石油污染的最优方法。根据国外生物修复(Bioremediation)技术治理环境中石油污染的成功经验，以及生物修复技术本身所具有的优点诸如成本低，同样处理一平方公里的污染区域，使用生物修复技术只需要投加几吨至几十吨的微生物菌剂和营养添加剂，只需投资几十万至百多万元，可节省大量的投资，而且该方法还具有省时省力、没有二次污染等优点，可以认为生物修复是解决我国目前石油污染的较为理想的方法，生物修复技术将在我国石油污染的治理作出重要贡献，具有广阔的应用前景。因此本技术将是今后我国治理环境中石油污染的优选技术。

生物修复(Bioremediation)或称生物整治是20世纪80年代中期以来出现和发展的清除和治理环境污染的生物工程技术，生物修复是利用处理系统中微生物的代谢作用减少污染现场有害物质的浓度或使其完全无害化，是治理环境污染的重要方法，主要特点是可以对大面积的环境污染进行治理，使之得到完全恢复，达到污染前的状况，目前生物修复技术的主要处理对象是环境中的石油污染和农药污染。最成功的例子是清除Alaska Exxon Valdez的海岸石油污染。生物修复技术区别于其他技术的最显著特点就在于它是污染物的消除技术而非污染物分离技术，因此它具有无二次污染等优点，此外，生物修复技术还具有成本低的优点，一般是其他技术的1/3～1/5。生物修复是采用诸如提高通气效率、补充营养(对石油污染而言，主要是补充N、P)，投加优良菌种、改善环境条件等办法来提高微生物的代谢作用和降解活性水平，以促进对污染物的降解速度，从而达到治理污染环境的目的。欧洲各国如德国、丹麦、荷兰对生物修复技术非常重视，全欧洲从事该项技术的研究机构和商业公司大约有近百个，他们的研究证明，利用微生物分解有毒有害物质的生物修复技术是治理大面积污染区域的一种有价值的方法。美国国家环保局(USEPA)积极推进生物修复技术的研究和应用。美国的一些州也对生物修复技术持积极态度，如新泽西州、威斯康星州规定将该技术列为净化受储油罐泄漏污染土壤治理的首选方法。美国能源部(EPA)制定了90年代土壤和地下水的生物修复计划，并组织了一个由联邦政府、学术和实业界人员组成的“生物修复行动委员会”(Bioremediation Action Committee)来负责生物修复技术的研究和具体应用实施。在含石油污水的生物处理和石油污染土壤的生物修复中的最根本的基础是微生物对石油烃的降解，因此高活性的降解菌以及提高降解菌与油滴作用面积----生物乳化剂的应用在治理石油污染非常关键。针对世界各地不同的石油污染情况，人们采用了不同的生物修复措施，如Gruize等应用高效降解微生物和通气相结合的方法处理土壤石油污染运转2个月后，土壤中的污染物明显减少；美国Chakrabarty采用遗传工程菌处理海湾战争造成的石油污染取得显著效果；Chianelli RR等(Chianelli，R.R.et al.1991)应用投加营养和降解石油烃的微生物对1989年阿拉斯加的Exxon Valdez海湾石油泄漏造成的污染进行的处理，取得非常明显的效果，使得近百公里海岸的环境质量得到明显改善，是生物修复在清除石油污染中最成功的例子。有关石油污染的生物修复技术，有的成果已申请专利，有些公司开发了各种除油菌剂和疏水性营养添加剂，但尚未形成石油污染生物修复技术的产业化。我国也曾引进国外的菌剂和营养添加剂，但效果并不好，主要原因是石油污染的成分不同、环境条件不同造成的，因此要解决我国的石油污染，必须着眼于我国的石油污染状况，走自力更生、自我发展的道路，开拓我们自己的石油污染评价方法、生物修复技术和工艺、微生物菌种资源。

发明内容

本发明的目的在于针对石油污染对环境造成的严重危害，提供了一种赤红球菌Em和该菌用于治理石油污染的生物修复技术，该菌是具有降解多种石油烷烃和多环芳烃以及产生生物乳化剂的赤红球菌，在治理环境石油污染中可以应用。具体地说，涉及一株赤红球菌(Rhodococcusruber)Em CGMCC No.0868菌株，该菌株的生长细胞、细胞悬浮液、固定化细胞均可降解十六烷等烷烃以及蒽、菲、芘等多环芳烃；该菌株能以烷烃或多环芳烃为唯一碳源和能源生长，同时产生脂类生物乳化剂；该乳化剂能明显降低水溶液的表面张力、具有很强的油脂类物质的乳化能力、提高烷烃和多环芳烃在水中的溶解度、明显促进活性菌株对烷烃和多环芳烃的降解。该菌株及其产生的生物乳化剂适用于含油废水的生物处理和石油污染土壤的生物修复(生物整治)。

本发明提供的赤红球菌(Rhodococcus rubber)Em菌株，于2002年12月20日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.0868；其特征在于：

赤红球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868的菌落特征：在LB平板上培养2天的菌落大小为直径3～4mm，菌落呈圆形，表面干燥粗糙，边缘整齐，凸出，橙色。

赤红球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868的细胞形态特征：适宜于pH5～9范围内常温培养，其细胞为杆状，但不同菌龄的细胞有球杆变化，幼龄细胞为杆状，老龄细胞(培养4天后)变为球形，革兰氏染色阳性，细胞大小为直径0.8μm，无规则排列。

赤红球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868的生理生化特征：抗酸染色阴性，不产芽孢或孢子，接触酶阳性，还原硝酸盐，能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-果糖、乳糖、D-半乳糖、鼠李糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、D-木糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、棉籽糖、丙三醇，且皆发酵产酸，还能利用甘露糖、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸；不能利用肌醇、琥珀酸、甘氨酸、乳酸、L-精氨酸。降解烷烃和多环芳烃，产生生物乳化剂。

赤红球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868的16S rRNA基因序列特征：CGMCC No.0868接种于LB培养基，30℃摇床培养(200rpm)18小时，离心收集细胞，重新悬浮，加溶菌酶破壁，由酚-氯仿法提取DNA，并采用正向引物27f (5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1541r(5’-AAGGAGGTGATCC AGCC-3’)这对通用引物对其16SrDNA进行PCR扩增，将扩增产物送上海基康公司进行测序。PCR条件为：95℃，10min；94℃，1min，48℃，1min，72℃，1min；30个循环，72℃，5min，4℃保存。16S rDNA序列长度为1398bp，在GenBank中的序列登录号为AF529079，与菌株Rhodococcus rubber DSM43338T的16S rDNA(登录号为X80625)序列的相似性为99％。其16S rDNA的序列如图1和序列表1所示。

参照《Bergey’s Mannual of Systematic Bacteriology》Vol.VIII的内容，根据其形态特征和生理生化特征，以及根据其16S rRNA基因序列在GenBank中的搜索结果，鉴定Em菌为一新菌株，属于赤红球菌(Rhodococcus ruber)。

赤红球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868可以在营养培养基，如：普通牛肉汁、LB、营养琼脂中培养，也可以在以石油烃，如：烷烃、芳烃和多环芳烃为唯一碳源的基础培养基中培养。应用前如在以多环芳烃为底物的基础培养基中驯化则效果更好，菌株在25～35℃之间的一适当温度下，进行好氧生长。

该菌具有较高的降解石油烃的能力，降解底物范围广，可降解C10～C24的烷烃、芳烃和多环芳烃(苯、萘、蒽、菲、芘)。用Em菌生长细胞进行降解实验的结果表明，降解0.3和0.4g/L的苯时OD₄₆₀可达0.15和0.13，在降解0.2和0.3g/L的萘时OD₄₆₀可达0.16和0.17。在初始pH值为7.0，细胞抽提物浓度为0.025g/L，蒽的浓度为0.1g/L，30℃下以200转/分钟转速摇床培养72小时，降解率可达39％。

本发明提供的CGMCC No.0868菌能以石油烃为唯一碳源的基础培养基中发酵培养生产生物乳化剂，其中优选以十六烷为碳源时，培养基组成(％)：正十六烷，8g；酵母提取物，1g；K₂HPO₄·3H₂O，1g；KH₂PO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NH₄NO₃，1g；CaCl₂，0.02g；FeCl₃痕量；pH7.0，121℃灭菌30min，培养产生的生物乳化剂的效果最好。所产乳化剂可使培养液的表面张力在培养后24小时降至30mN/m，乳化剂浓度在5天时可达最大值68倍，即在稀释了68倍后，乃具有很高的表面活性，可使水的表面张力下降到56mN/m。粗乳化剂的乳化能力在培养24小时即可达100％，且乳化稳定(图2)。采用山东淄博科森公司的Auto-tensiometerZL-2型表面张力测定仪测定培养液的表面张力，稀释培养液直至培养液中乳化剂的浓度达到CMC(临界胶团浓度)以下，培养液的表面张力骤降，用这一稀释倍数表示培养液中的乳化剂浓度(图3)。

CGMCC No.0868菌所产生的生物乳化剂做a-萘酚试验判定糖类，用Bradford比色法测定蛋白，初步表明该乳化剂不含蛋白质、不含多糖，其化学性质为脂类物质。

CGMCC No.0868菌所产的生物乳化剂具有很强的表面活性作用，可以明显降低水的表面张力，不加乳化剂时水的表面张力为72.1mN/m，而加粗乳化剂时，只要粗乳化剂的稀释倍数在41倍以下，水的表面张力都可以下降到30mN/m左右，稀释了51倍的粗乳化剂仍能使水的表面张力下降到50.3mN/m。该结果表明CGMCC No.0868菌所产的生物乳化剂的性能以及乳化剂的含量，其水平之高，至今未见国内外的相关技术的报道。

CGMCC No.0868菌所产生物乳化剂具有明显的乳化能力。目前国际上对乳化能力的测定，通常以煤油为乳化对象，乳化剂与煤油按同等体积混合，激烈震荡30min，静置2hr，然后测定剩余没有被乳化的煤油的量，以乳化的量与所加煤油总量的百分比(％)表示乳化能力。结果表明，在乳化剂∶煤油＝1∶1的条件下，Em菌株经过1天的培养即可达到100％的乳化；在在乳化剂∶煤油＝1∶10的条件下，培养1天即可乳化13％的煤油，培养2天基本上达到了最高的乳化能力。

CGMCC No.0868菌所产生物乳化剂具有明显的使多环芳烃、脂类物质在水中增溶能力，如图4所示，加入1/30(V/V)的乳化剂发酵液，蒽在水中的溶解度从0.06mg/L增加到0.83mg/L、菲从0.84mg/L增加到9.97mg/L、芘从0.2mg/L增加到2.32mg/L，都提高了10倍以上。CGMCC No.0868菌所产生物乳化剂可以明显促进活性菌种降解石油烃的作用。在初始pH值为7.0，酵母抽提物浓度为25mg/L，蒽的浓度为100mg/L，30℃下以200转/分钟转速摇床培养，不同时间取样测定蒽的剩余量，结果如图5所示，加入1/30(V/V)的乳化剂可使蒽的降解率增大约30个百分点。培养3天时的降解量从19mg/L提高到46mg/L，增加了约1.5倍。

附图说明

图1 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌的16S rDNA序列

图2 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌株以正十六烷为碳

源的培养液的表面张力随时间变化曲线

图3 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌株以正十六烷为碳源的培养液的乳化剂浓度和乳化能力随时间变化曲线

图4 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌株所产乳化剂对蒽菲芘的增溶作用

图5 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌株所产乳化剂对微生物降解降解蒽的促进作用

图6-1 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌株对苯的降解

图6-2 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌株对萘的降解

图6-3 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌株对蒽的降解

图6-4 Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868菌株对芘的降解

体实施方案

为了更好地理解本发明，通过以下实施实例予以进一步说明，但并非对本发明的限定。

实施例1：本发明提供的Rhodococcus ruber Em菌株的分离筛选

从华北油田采油场油井周围的原油污染土壤采集土壤样品，取样品50克悬浮于50mL无菌生理盐水中，摇床振荡30min使充分悬浮，静置30min，取10mL上层悬浮液接种于100mL无机盐培养基中(培养基组成：K₂HPO₄·3H₂O，1g；KH₂PO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NH₄NO₃，1g；CaCl₂，0.02g；FeCl₃痕量；烷烃类，1g或芳烃类，0.1g；蒸馏水，1000mL；pH7.0；121℃灭菌30min)，30℃摇床(200rpm)培养7天，取10mL培养液接种新鲜培养基，按相同操作条件连续驯化3次，然后在无机盐培养基平板中划线分离，待形成单菌落后，挑取单菌落接种于相应的斜面，斜面培养物在LB平板或普通牛肉汁平板上纯化，直至显微镜检查获得纯培养为止。得到的纯菌株分别接种含不同石油烃(烷烃类2000mg/L，芳烃和多环芳烃为100mg/L)的无机盐培养基以及产生物乳化剂的培养基(培养基组成：正十六烷，8g；酵母抽提物，1g；K₂HPO₄·3H₂O，1g；KH₂PO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NH₄NO₃，1g；/L CaCl₂，0.02g；FeCl₃痕量；pH7.0，121℃灭菌30min)分别培养4天和2天。以正己烷萃取培养液，HPLC方法检测石油烃的剩余量，以测定水的表面张力下降量来衡量发酵培养液的乳化活性，选取降解活性最高、乳化能力最强的菌株为进一步实验菌株，得到Rhodococcus ruber Em菌株。

实施例2：Rhodococcus ruber Em菌株的16S rRNA基因的PCR扩增和序列测定

Rhodococcus ruber Em菌株接种LB培养基，30℃摇床培养(200rpm)18小时，离心收集细胞，重新悬浮，加溶菌酶破壁，由酚-氯仿法提取DNA，并采用正向引物27f(5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和反向引物1541r(5’-AAGGAGGTGATCC AGCC-3’)这对通用引物对其16S rDNA进行PCR扩增，将扩增产物送上海基康公司进行测序。PCR条件为：95℃，10min；94℃，1min，48℃，1min，72℃，1min；30个循环，72℃，5min，4℃保存。16S rDNA序列长度为1398bp，在GenBank中的序列登录号为AF529079，与菌株Rhodococcus rubber DSM43338^T的16S rDNA(登录号为X80625)序列的相似性为99％。其16S rDNA的序列见序列表1和图1。

实施例3：本发明提供的Rhodococcus ruber Em菌株对多环芳烃的降解

取该菌株的新鲜斜面菌种，接种一接种环于装有100mL含不同石油烃为碳源的无机盐培养基(培养基组成同实施例1)的三角瓶中，30℃摇床培养(200rpm)3天，测定菌的生长量(OD₄₆₀表示)和烃类的降解(HPLC)，结果如图6所示，图6-1表明，对200mg/L的苯，经过3天的培养，降解率可以达到95％；图6-2表明，对100mg/L的萘，降解率可以达到99％；图6-3表明，对50mg/L的蒽，降解率可以达到67％；图6-4表明，对50mg/L的芘，降解率可以达到13％。

实施例4：本发明提供的Rhodococcus ruber Em菌株产生生物乳化剂的条件

通过改变培养基种类和组分、培养条件(温度、pH、通气量等)等试验，获得该Rhodococcus ruber Em菌株产生物乳化剂的最佳培养基为：正十六烷，8g；酵母抽提物，1g；K₂HPO₄·3H₂O，1g；KH₂PO₄，1g；MgSO₄·7H₂O，0.5；NH₄NO₃，1g；CaCl₂，0.02g；痕量的FeCl₃。最佳培养条件为：初始pH值为7.0，30℃，200转/分钟培养48小时。在该培养条件下，经3天的培养，培养液稀释60倍，仍可使水的表面张力下降到50mN/m左右。

实施例5：本发明提供的Rhodococcus ruber Em菌株所产的生物乳化剂的表面活性作用

Rhodococcus ruber Em菌株所产的生物乳化剂的表面活性作用，可以明显地降低水的表面张力，采用山东淄博科森公司的Auto-tensiometerZL-2型表面张力测定仪测定培养液的表面张力，如表1所示，不加乳化剂时水的表面张力为72.1mN/m，而加粗乳化剂时，只要粗乳化剂的稀释倍数在41倍以下，水的表面张力都可以下降到30mN/m左右，稀释了51倍的粗乳化剂仍能使水的表面张力下降到50.3mN/m，说明Rhodococcus ruber Em菌株所产的生物乳化剂，不论是乳化剂的性能以及乳化剂的含量是未见报道的。

实施例6：本发明提供的Rhodococcus ruber Em菌株所产生物乳化剂对煤油的乳化能力

按照国际上对乳化能力的测定，通常以煤油为乳化对象，乳化剂与煤油按同等体积混合，激烈震荡30min，静置2hr，然后测定剩余没有被乳化的煤油的量，以乳化的量与所加煤油总量的百分比(％)表示乳化能力。如表2所示，结果表明，在乳化剂∶煤油＝1∶1的条件下，Em菌株经过1天的培养即可达到100％的乳化；在在乳化剂∶煤油＝1∶10的条件下，培养1天即可乳化13％的煤油，培养2天基本上达到了最高的乳化能力。

表1 Rhodococcus ruber Em菌株所产的生物乳化剂的乳化能力

培养时间(天)	0.5	1	2	8
培养时间(天)	0.5	1	2	8	乳化活性(乳化剂∶煤油＝1∶1)	0	0	100％	100％	100％
乳化活性(乳化剂∶煤油＝1∶10)	0	13％	15％	16％	乳化活性(乳化剂∶煤油＝1∶1)	0	0	100％	100％	100％

实施例7：本发明提供的Rhodococcus ruber Em菌株所产的生物乳化剂的化学性质

Rhodococcus ruber Em菌株在产生物乳化剂的培养基和条件下(同实施例4)培养发酵，发酵液用等同体积的正己烷萃取，a-萘酚试验判定糖类、用Bradford比色法测定蛋白和脂类定性试验，结果说明该生物乳化剂不含多糖、不含蛋白，是一种脂类化合物。进一步用薄层层析(TLC)法分析该生物乳化剂的组分，具体操作如下：取5mL正己烷萃取液，点样在硅胶层析板(青岛海洋化工厂分厂，厚度为0.2～0.25mm，大小为150×100mm)上，经氯仿∶甲醇∶水＝18∶6∶1的展层剂展开，干燥后用碘染色，可以发现在迁移率分别为Rf＝0.12和Rf＝0.8的条带，分别刮下这两条带，用正己烷溶解，挥发正己烷，溶解于30mL水中，测定溶液的表面张力(蒸馏水为对照)，结果：蒸馏水的表面张力为72.2mN/m，Rf＝0.12的组分的水溶液的表面张力为63.7mN/m，Rf＝0.8的组分的水溶液的表面张力为56.4mN/m，说明这两种组分均具有一定的表面活性作用。经过定性分析(方法同上)，这两种组分均不含多糖和蛋白，是脂类物质。

实施例8：本发明提供的Rhodococcus ruber Em菌株所产生物乳化剂对菌株降解多环芳烃的促进作用。

在无机盐培养基(组成成分同实施例1)加入不同浓度的各种石油烃，以加乳化剂(分不同的加量)和不加乳化剂进行对比试验，培养不同时间取样，以HPLC法测定培养液中的石油烃剩余量。以蒽为代表，结果表明(图5)，加入1/30(V/V)的乳化剂可使蒽的降解率增大约30个百分点。培养3天时的降解量从19mg/L提高到46mg/L，增加了约1.5倍。

SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种产生生物乳化剂和降解多环芳烃的赤红球菌Em及用途

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1398

<212>DNA

<213>Rhodococcus ruber Em CGMCC No.0868

<400>1

tgagccgtgc ttacacatgc gagtcgaacg atgcagccca gcttgctggg tggattagtg 60

gcgaacgggt gagtaacacg tgggtgatct gccctgcact tcgggataag cctgggaaac 120

tgggtctaat accggatagg acctcgggat gcatgttccg gggtggaaag gttttccggt 180

gcaggatggg cccgcggcct atcagcttgt tggtggggta acggcccacc aaggcgacga 240

cgggtagccg gcctgagagg gcgaccggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300

tacgggaggc agcagtgggg aatattgcac aatgggcgca agcctgatgc agcgacgccg 360

cgtgagggat gacggccttc gggttgtaaa cctctttcag taccgacgaa gcgcaagtga 420

cggtaggtac agaagaagca ccggccaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggg 480

tgcgagcgtt gtccggaatt actgggcgta aagagctcgt aggcggtttg tcgcgtcgtc 540

tgtgaaaacc cgcagctcaa ctgcgggctt gcaggcgata cgggcagact tgagtactgc 600

aggggagact ggaattcctg gtgtagcggt gaaatgcgca gatatcagga ggaacaccgg 660

tggcgaaggc gggtctctgg gcagtaactg acgctgagga gcgaaagcgt gggtagcgaa 720

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacggtgg gcgctaggtg tgggtttcct 780

tccacgggat ccgtgccgta gctaacgcat taagcgcccc gcctggggag tacggccgca 840

aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat gtggattaat 900

tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt ttgacataca ccggaccgcc ccagagatgg 960

ggtttccctt gtggtcggtg tacaggtggt gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga 1020

tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgtcctg tgttgccagc acgtaatggt 1080

ggggactcgc aggagactgc cggggtcaac tcggaggaag gtggggacga cgtcaagtca 1140

tcatgcccct tatgtccagg gcttcacaca tgctacaatg gccggtacag agggctgcga 1200

taccgcgagg tggagcgaat cccttaaagc cggtctcagt tcggatcggg gtctgcaact 1260

cgaccccgtg aagtcggagt cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg gtgaatacgt 1320

tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcacg tcatgaaagt cggtaacacc cgaagccgga 1380

gacctaactc ctcctcaa 1398

Claims

1.一株具有降解烷烃及多环芳烃和产生生物乳化剂的赤红球菌(Rhodococcus ruber)Em CGMCC No.0868菌。

2.根据权利要求1所述的菌，其特征在于其16S rDNA的核甘酸序列如序列表1所示。

3.根据权利要求1所述的菌，其特征在于该菌的生长细胞、细胞悬浮液、其固定化细胞均能降解烷烃以及蒽、菲、芘多环芳烃。

4.根据权利要求1所述的菌，其特征在于该菌能以烷烃或多环芳烃为唯一碳源和能源生长，同时产生脂类生物乳化剂。

5.根据权利要求4所述的菌产生的脂类生物乳化剂是以十六烷为碳源时，培养基组成(％)：正十六烷，8g；酵母抽提物1g；K₂HPO₄·3H₂O1g；KH₂PO₄ 1g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；NH₄NO₃ 1g；CaCl₂ 0.02g；FeCl₃痕量；pH7.0，培养CGMCC No.0868产生的生物乳化剂。

6.根据权利要求4或5所述的菌产生的脂类生物乳化剂能在降低水溶液的表面张力、油脂类物质的乳化、提高烷烃和多环芳烃在水中的溶解度中应用。

7.根据权利要求4或5所述的菌产生的脂类生物乳化剂用于含油废水的生物处理和石油污染土壤的生物修复。

8.根据权利要求1所述的菌，其特征在于其菌落特征在LB平板上培养2天的菌落大小为直径3～4mm，菌落呈圆形，表面干燥粗糙，边缘整齐，凸出，橙色；细胞形态特征幼龄细胞为杆壮，老龄细胞，培养4天后变为球形，革兰氏染色阳性，细胞大小为直径0.8μm，无规则排列；生理生化特征具有抗酸染色阴性，不产芽孢或孢子，接触酶阳性，还原硝酸盐，能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、D-果糖、乳糖、D-半乳糖、鼠李糖、海藻糖、甘露醇、山梨醇、D-木糖、L-阿拉伯糖、纤维二糖、棉籽糖、丙三醇，且皆发酵产酸，还能利用甘露糖、L-谷氨酸、L-缬氨酸、L-脯氨酸；不能利用肌醇、琥珀酸、甘氨酸、乳酸、L-精氨酸。

9.根据权利要求1所述的菌，赤红球菌(Rhodococcus ruber)EmCGMCC No.0868在降低水溶液的表面张力、油脂类物质的乳化、提高烷烃和多环芳烃在水中的溶解度中应用。

10.根据权利要求1所述的菌，赤红球菌(Rhodococcus ruber)EmCGMCC No.0868在含油废水生物处理或/和石油污染土壤的生物修复中应用。