CN1513877A - 人工组合的抗葡萄球菌工程多肽及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工组合的抗菌工程多肽，该多肽由葡萄球菌信号传导多肽与可形成离子通道大肠菌素或其水性孔道结构域组成，分子结构为大肠菌素或其水性孔道结构域的羧基端与信号传导多肽的氨基端连接，分子量为20,000－70,000，可分别连接不同致病菌的信号传导多肽而组成对抗该菌的工程多肽。该多肽制备方法是利用点突变技术将葡萄球菌信号传导多肽基因插入到装载在工程质粒里的大肠菌素基因选定的位点上，再将突变质粒转染到工程菌里生产。该抗菌工程多肽优于传统抗菌素之处在于其可以杀灭对现有抗菌素耐药的葡萄球菌，而细菌不易对该多肽产生耐药性；另一优点是可以通过更换信号传导多肽来组成对抗产生该信号传导多肽的任何一种葡萄球菌的抗菌素。
Description
一、技术领域
本发明涉及一种人工组合的抗菌工程多肽及其制备方法，通过制备由不同的E1族可形成离子通道的大肠菌素和葡萄球菌信号传导多肽的功能结构域组合成的工程多肽(Engineered peptide)来达到抗菌目的。
二、背景技术
细菌感染仍然是人类生命和健康的主要威胁，自磺胺和青霉素问世以来，人类陆续发明的抗菌素主要以通过抑制细菌胞壁合成，抑制或干扰细菌的核酸和蛋白质的代谢与合成等途径来达到抗菌目的，然后这些抗菌途径容易诱使细菌发生突变而产生抗菌耐药性。因此人们一直在致力于开发新的抗菌素。在细菌胞膜上直接形成离子通道而致细菌死亡是比较有前途的抗菌素开发方向之一。自然界中，为数不少的细菌毒素就是以这种机制来杀死细菌的，其模式标本就是大肠杆菌(Escherichia coli)分泌的一种毒素蛋白一大肠菌素(colicin)，1952年Jacob发现其能特异的杀死其他株系的大肠杆菌和相关株系的某些痢疾杆菌，(Jacob et al，Sur Ia biosynthese d’unecolicine et son mode d’action.Annals of the Pasteur Institute.83：295-315(1952))。1978年Finkelstein等发现可形成离子通道的大肠菌素可以在人工脂质双分子膜上形成电压依赖性离子通道，从而从根本上揭示了这一类细菌毒素的抗菌机制(Schein et al，Colicin Kacts by forming voltage-dependent channelsin phospholipid bilayer membranes.Nature.276：159-163(1978))。1996年Qiu(丘小庆，专利发明人)和Finkelstein等揭示了大肠菌素Ia在人工脂质双分子膜上形成的离子通道开放和关闭时的跨膜立体结构(Qiu et al，Major transmembranemovement associated with colicin Ia channel gating.J.Gen.Physiology.107：313-328(1996))，为在分子水平上设计和制备新型的抗菌素奠定了结构基础。
近二十年，人们逐渐发现细菌也具有随外界环境变化而分泌的信号传导多肽(pheromone)，其作用是调节自身适应环境变化。而且细菌分泌信号传导多肽、制备信号传导多肽的胞膜受体及胞内调节蛋白的基因往往偶联在一起，协调的控制着细菌的生长和分裂。但该方向的研究一直进展缓慢，比如金黄色葡萄球菌的信号传导多肽，Agr D group I(Genebank U85097)，一直到1995年才最后搞清楚是一个八肽(Ji etal，Cell density control of staphylococcal virulence mediated by anoctapeptide pheromone.Proc Natl Acad Sci USA.92：12055-12059(1955))，1999年发现在金黄色葡萄球菌对数生长期的早期或中晚期加入人工合成的这种八肽可以刺激或抑制金黄色葡萄球菌的生长(Mayville et al，Structure-activity analysisof synthetic antoinducing thiolactone peptides from staphylococcus aureusresponsible for virulence.Proc Natl Sci USA.96：1218-1223(1999))。近五年来，人们陆续确定了金黄色葡萄球菌的其他三组AgrD信息素(Genebank AF001783，AF288215，AF001782)，表皮葡萄球菌(S.epidermidis)信息素(Z49220)和葡萄球菌lugdunensis(S.lugdunensis)信息素(AF173933)的氨基酸系列。
如上所述，大肠菌素是一种理想的离子通道抗菌素，缺点是只能作用于大肠杆菌。如果能够利用葡萄球菌特有的信号传导多肽作为诱导物，将大肠菌素或其水性孔道结构域诱导至这些葡萄球菌的胞膜附近形成离子通道来杀伤该致病菌，应该是一种理想的抗菌素开发方向。
三、发明内容
本发明针对现有抗菌素性能的不足，提供一种能杀灭对现有抗菌素已经产生耐药性的葡萄球菌的新型抗菌素及其制备方法。本发明的技术方案是：将可形成离子通道的大肠菌素(colicin El，Ia，Ib，A，B，N)或其水性孔道结构域(pore-formingdomain)与葡萄球菌分泌的信号传导多肽(pheromone)组合成工程多肽。在该工程多肽里，可与葡萄球菌胞膜受体结合的信号传导多肽作为诱导物诱导大肠菌素通道结构域穿过细菌细胞壁与膜间隙到达靶细菌胞膜附近，然后大肠菌素水性孔道结构域在靶细菌胞膜上形成离子通道，使靶细菌胞内内容物泄漏，致靶细菌死亡，从而达到杀菌的目的。
工程多肽的制备方法采用由专利发明人开发的技术路线(Qiu et al，Site-specific biotinylation of colicin Ia，a probe for protein conformationin the membrane.J Biol Chem 269：7483-7488(1994)，Qiu et al，Majortransmembrane movement associated with col icin Ia channel gating.J.Gen.Physiology.107：313-328(1996))。该技术路线的关键在于：利用点突变技术(美国Strategene公司Quick-change药箱)，将欲组合成的葡萄球菌信号传导多肽基因插入到装载在工程质粒里的大肠菌素基因选定的位点上，制备成人工组合抗菌工程多肽的质粒，再对该突变质粒进行测序以便确认突变成功。最后将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里制备多肽。
信号传导多肽与大肠菌素或其水性孔道结构域的组合方式可以有两种，将信号传导多肽或结合在大肠菌素或其水性孔道结构域的氨基端，或结合在羧基端，于是可以形成四种工程多肽。此外，可以通过改变信号传导多肽和大肠菌素或其水性孔道结构域的肽链的组成及结构来增强其抗菌活性或减少可能出现的副作用。由于这样的组成或改变将会增加或减少组成的工程多肽的氨基酸残基数量，因此其分子量将会在20,000-70,000范围内变动。
每一种葡萄球菌都有自己独特的信号传导多肽，因此只要采用其独特的信号传导多肽与可形成离子通道的大肠菌素或其水性孔道结构域连接，就可以组合成一种特异的、对抗该葡萄球菌的抗菌工程多肽。
本发明制备的人工组成的抗菌工程多肽优于传统抗菌素之处在于其不会诱使细菌产生传统的耐药性，众所周知，细菌可以通过突变产生B-内酰胺酶，减少摄入，变更药物作用位点等手段来改变其细胞壁结构，改变其蛋白质和核酸的代谢等对传统抗菌素产生耐药性。但是细菌却较难以通过突变来改变其细胞膜的磷脂双分子层的结构，而这恰好是本发明的独到之处，因为制备的工程多肽就是通过直接在靶细菌的胞膜上形成离子通道来杀菌的。
四、附图说明
附图为金黄色葡萄球菌在改良LB(1％胰蛋白胨，0.5％酵母，1％氯化钠，0.1％葡萄糖)培基中生长量随生长时间增多的生长曲线。不加入任何药物的金黄色葡萄球菌在数小时或十数小时后可以顺畅地进入对数生长期并最后到达稳定生长期，被氨苄青霉素和本发明制备的抗金黄色葡萄球菌工程多肽所抑制的金黄色葡萄球菌却难以进入对数生长期。纵坐标为光密度读数，横坐标为时间。
附图1.抗菌工程多肽杀灭耐青霉素金黄色葡萄球菌(ATCC29213，美国标准株)显示图。显示金黄色葡萄球菌Agr D信号传导多肽组合在大肠菌素Ia羧基端上制备的抗菌工程多肽金具有杀灭耐青霉素金葡菌的能力。符号标示：△对照(不加入任何药物)，▲抗菌工程多肽(终浓度1μg/ml)，●青霉素G钠(终浓度1μg/ml)。在第6小时将培养液全部置换以撤除青霉素及抗菌工程多肽。结果证明青霉素G钠不能杀死该菌，而抗菌工程多肽杀死了该菌。
附图2.两种分子量抗菌工程多肽杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCCBAA-42，美国标准株)显示图。显示金黄色葡萄球菌Agr D信号传导多肽组合在大肠菌素Ia水性孔道结构域羧基端上制备的两种抗菌工程多肽具有杀灭耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌的能力。符号标示：△对照(不加入任何药物)，□70,000分子量抗菌工程多肽(终浓度5μg/ml)，○ 20,000分子量抗菌工程多肽(终浓度5μg/ml)，●苯唑西林(终浓度5μg/ml，国内现在不生产甲氧西林，故仿国家药检局四川抗菌素研究所，用苯唑西林代替进行实验)。
附图3.抗菌工程多肽体内杀菌实验。18只昆明小鼠，雌雄各半，体重25-30克，腹腔注射耐青霉素金黄色葡萄球菌(ATCC 29213，美国标准株，由国家药检局四川抗菌素研究所药理室标定致死剂量并注射)1小时后随机分为3组，(1)腹腔注入0.5ml 0.9％生理盐水，每6小时1次共4次为对照组(n＝6)；(2)腹腔注入2.5mg青霉素G钠，每6小时1次共4次(n＝6)；(3)腹腔注入2mg 20,000分子量抗菌工程多肽，每6小时1次共4次(n＝6)。腹腔注射工程多肽组100小时后仍然全部存活。腹腔注射青霉素组20小时内有3只死亡，其余存活。对照组10时内全部死亡。统计学分析显示工程多肽组与对照组有显著差异，P＜0.0005。
五、具体实施方式
实施例1：
本实施例是将金黄色葡萄球菌的Agr D信号传导多肽连接到大肠菌素Ia的羧基端上，制备成人工组合抗金黄色葡萄球菌工程多肽的质粒，将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里，将菌大量繁殖(4L FB培基，225rpm，37℃；6h)，离心沉淀菌体(4℃，6000g，20min)，取4℃、50mM硼酸缓冲液+2mM EDTA+2mM DTT 50-80ml悬浮菌体，超声破碎(4℃，40W，1-2min)，高速离心破碎菌体(4℃，50000-70000g，1.5h)，取上清加入硫酸链霉素沉淀DNA，4℃、50mM硼酸缓冲液+2mM EDTA+2mM DTT2L透析过夜后，上清上样于CM离子交换柱，4℃、0.3M NaCl+50mM硼酸缓冲液洗脱后得到了抗金黄色葡萄球菌工程多肽，分子量63,000。为证实该工程多肽的抗菌能力，将耐青霉素金黄色葡萄球菌(ATCC 29213，美国标准株)菌液5μl(108CFUS/ml)置入LB培基10ml中，225rpm，37℃孵育三小时后，加入该抗菌工程多肽(终浓度0.5μg/ml)，继续以225rpm，37℃孵育，每半小时采样经分光光度计(A595nm)比色测试，以青霉素G钠(终浓度1μg/ml)，不加入任何药物的金黄色葡萄球菌作为对照(见附图1)，结果表明：该抗菌工程多肽具有杀灭耐青霉素金黄色葡萄球菌能力。
实施例2：
木实施例是将金黄色葡萄球菌的Agr D信号传导多肽连接到大肠菌素Ia水性孔道结构域的羧基端上，制备质粒，再经过实例一中使用的技术步骤，得到了比实例一更小的抗金黄色葡萄球菌工程多肽，分子量为20,000。为证实该工程多肽的抗菌能力，将耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(ATCC BAA-42，美国标准株)菌液5μl(108CFUS/ml)置入加葡萄糖LB培基10ml中，225rpm，37℃孵育三小时后，加入该抗菌工程多肽(终浓度0.5μg/ml)，继续以225rpm，37℃孵育，每一小时采样经分光光度计((A595nm)比色测试，以苯唑西林(Oxacillin，终浓度5μg/ml)和不加入任何药物的金黄色葡萄球菌作为对照(见附图2)，结果表明：在对照组的金黄色葡萄球菌已进入稳定生长期之后，该抗菌工程多肽能杀灭耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生长。
实施例3：
本实施例是根据上述技术路线，我们对制备的20,000分子量抗金葡菌工程多肽进行了体内杀菌实验。取18只昆明小鼠，雌雄各半，体重25-30克，腹腔注射耐青霉素金黄色葡萄球菌(ATCC 29213，美国标准株，由国家药检局四川抗菌素研究所药理室标定致死剂量并注射)1小时后随机分为3组，(1)腹腔注入0.5ml 0.9％生理盐水，每6小时1次共4次为对照组(n＝6)；(2)腹腔注入2.5mg青霉素G钠，每6小时1次共4次(n＝6)；(3)腹腔注入2mg 20,000分子量抗菌工程多肽，每6小时1次共4次(n＝6)。腹腔注射工程多肽组100小时后仍然全部存活。腹腔注射青霉素组20小时内有3只死亡，其余存活。对照组10时内全部死亡。统计学分析显示工程多肽组与对照组有显著差异，P＜0.0005(请见附图3)。
实施例4：
本实施例是根据上述技术路线，我们将表皮葡萄球菌的信号传导多肽连接到大肠菌素Ia的羧基端上，制备质粒后，再经过实例一中使用的技术步骤，得到了分子量为70,000的工程多肽。预实验显示该多肽具有抗表皮葡萄球菌能力。
实施例5：
本实施例是根据上述技术路线，我们将金黄色葡萄球菌的Agr D信号传导多肽连接到大肠菌素Ia的氨基端上，制备质粒后，再经过实例一中使用的技术步骤，得到了分子量为70,000的工程多肽。预实验显示该多肽具有抗金黄色葡萄球菌能力。
Claims (4)
1.一种人工组合的抗葡萄球菌工程多肽，其特征在于该多肽由葡萄球菌信号传导多肽与可形成离子通道大肠菌素或其水性孔道结构域组成，其分子结构为可形成离子通道大肠菌素或其水性孔道结构域的羧基端与信号传导多肽的氨基端连接，或者为信号传导多肽的羧基端与可形成离子通道的大肠菌素或其水性孔道结构域的氨基端连接，分子量为20,000-70,000。
2.根据权利要求1所述的人工组合的抗葡萄球菌工程多肽，其特征在于该工程多肽具有葡萄球菌信号传导多肽的变构肽链和/或可形成离子通道大肠菌素的水性孔道结构域的变构肽链。
3.一种人工组合的抗葡萄球菌工程多肽的制备方法，其特征在于利用点突变技术将葡萄球菌信号传导多肽基因插入到装载在工程质粒里的大肠菌素基因选定的位点上，再将突变好的质粒转染到不含质粒的工程菌里，经大量繁殖菌，超声破碎，高速离心沉淀破碎菌体，沉淀DNA，透析之后由离子交换柱收获制备的抗菌工程多肽。
4.根据权利要求3所述的人工组合的抗菌工程多肽的制备方法，其特征在于葡萄球菌信号传导多肽基因在大肠菌素基因的插入位点以人工组合的抗菌工程多肽的分子结构为准。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007083175A1 (en) * | 2006-01-17 | 2007-07-26 | West China Hospital, Sichuan University | Antiviral bifunctional molecules, methods of construction and methods of treating virus-induced cancer therewith |
| CN101643501B (zh) * | 2008-11-07 | 2012-06-20 | 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 | 一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用 |
-
2002
- 2002-11-12 CN CNA021340420A patent/CN1513877A/zh active Pending
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