CN1487294A - 一种快速检测生物样品中β2—受体兴奋剂的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供的快速检测生物样品中β2－受体兴奋剂的方法，是将衍生化固相微萃取技术与气相色谱/质谱联用，利用待测物对固相微萃取纤维表面涂层的吸附亲和力，使其从样品中分离，并富集于SPME纤维上；再将纤维置于衍生剂的气相顶空中进行衍生化反应；最后于GC/MS系统中检测，采用选择离子检测方式，以峰面积定量，用所得峰面积对照标准曲线计算出待测样品中β2－受体兴奋剂的浓度；具有操作简单、分析快速、准确性好、灵敏度高、所需有机溶剂少、经济、无毒害、无污染等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物样品中β2-受体兴奋剂的快速检测方法，特别是克仑特罗的快速检测方法。
背景技术
β2-肾上腺素受体兴奋剂(以下简称β2-受体兴奋剂)是一类人工合成的药物，可选择性地作用于β2-肾上腺素受体，在治疗剂量下有强而持久地松弛支气管平滑肌的作用，临床上用于防治支气管哮喘型慢性支气管炎、肺气肿等呼吸系统疾病所致的支气管痉挛。当作为饲料添加剂的一种成份大剂量用于家畜饲养时，可使家畜体内能量从脂肪组织向肌肉组织转移，促进家畜肌肉组织蛋白质的合成，加速脂肪的转化和分解，使家畜生长速度加快，瘦肉相对增加，但其在家畜内脏及肌肉组织中的残留可严重危害人类健康，过量摄入人体可引起交感神经兴奋，出现肌肉震颤，心慌，头昏，头痛，呕吐等中毒症状，对高血压、心脏病等疾病患者甚至可导致死亡(Gas chromatography-mass spectrometry analysis of β2-agoinst in bovine retina，Anal.Chim.Acta.，2000，408：285-290)。
克仑特罗(化学名为羟甲叔丁基肾上腺素)是最常使用的β2-受体兴奋剂之一。一般来说，饲料中添加适量克伦特罗后，可使畜禽生长速率、饲料转化率、胴体瘦肉率提高10％以上，所以又将其称为″瘦肉精″。克仑特罗进入人体后分布快、代谢缓慢，易引起中毒。
1990年西班牙发生了第1例克仑特罗中毒的报道，患者是在食用含有克仑特罗的动物肝脏后出现肌肉震颤、心动过速、心悸、眩晕等症状，持续时间平均为40小时。于是国际上颁布法规禁止将β2-受体兴奋剂作为生长促进剂使用，世界卫生组织也规定了农畜产品中克仑特罗的最高残留限量为1μg/l(maximum residual level，MRL)。1998年5月，香港居民因食用内地供应的猪内脏，造成17人中毒的“瘦肉精”中毒事件。我国农业部发文“严禁生产和使用β-兴奋剂类产品和未经农业部批准的兽药及饲料药物添加剂”，并于1999年发布《中华人民共和国动物及动物源食品中残留物质监控计划》明令禁止在家畜饲养中使用β2-受体兴奋剂。但由于缺乏快速、准确、灵敏的检测畜产品中β2-受体兴奋剂残留量的方法和标准，在一定程度上给查禁工作带来困难，中毒事件仍时有发生。最近，广东、浙江发生的数起“毒猪肉”中毒事件就是因为食用了含“瘦肉精”的猪肉或猪内脏所致。因此如何快速、准确地测定克仑特罗在食品中残留水平成为我国食品卫生部门、检验检疫部门所关注的问题。
目前已有的检测β2-受体兴奋剂的方法包括酶联免疫分析法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)和气相色谱/质谱法(GC/MS)。其中酶联免疫分析法速度快、灵敏度高(检出限可达0.1μg/l)，但由于存在较高的假阳性率，只能用作筛选方法[参见“酶联免疫吸附分析法检测克仑特罗时假阳性问题的探讨”一文，载于《检验检疫科学》，2000，10(1)：41-43]；高效液相色谱法准确性较好，但灵敏度较低(检出限仅为1mg/l)，限制了该法在实际检测中的应用[参见“家畜及饲料中克仑特罗等β-兴奋剂的检测与确证技术的近况”一文，载于《现代商检科技》，1998，8(5)：52-56]；目前多采用GC/MS法作为确证方法，但该法采用固相萃取(SPE)对样品进行前处理，操作过程繁琐，需要大量有机溶剂[参见Determinationof clenbuterol in bovine urine using gas chromatography-mass spectrometry followingclean-up on an ion-eschange resin，1999，728：67-73]。现有检测方法的局限性和不足，在一定程度上限制了对包括克仑特罗在内的β2-受体兴奋剂的有效监测。因此，寻找一种速度快、准确性好、灵敏度高、假阳性率低、操作简单、有机溶剂消耗少的检测β2-受体兴奋剂的新方法，是该领域当前所共同面临的课题。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法及其在盐酸克仑特罗检测中的应用，使其具有速度快、准确性好、灵敏度高、假阳性率低、操作简单、有机溶剂消耗少等优点，以克服现有检测方法的不足。
本发明提供的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法依次包括以下步骤：
a.将待检测的生物样品经葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶酶解，使其中所含结合状态的β2-受体兴奋剂变为游离态；
b.以固相微萃取方法对样品中的β2-受体兴奋剂进行萃取；
c.将萃取后的固相微萃取纤维立即进行衍生化反应；
d.将吸附了待测物后经衍生化反应的固相微萃取纤维插入气相色谱/质谱(GC/MS)进样器中解析，质谱采用电子轰击(Electron Impact Ion Source，EI)电离方式；采用选择离子检测方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面积定量，用SIM所得峰面积对照标准曲线计算出待测样品中β2-受体兴奋剂的浓度。
本发明快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂方法的具体实施方法是：
1.酶解，即步骤a
生物样品需要经葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶的酶解，因摄入生物体内的β2-受体兴奋剂部分会与葡萄糖醛酸或硫酸根结合以结合物的形式存在，亲水性强，不能被SPME纤维有效地萃取，酶解使这部分结合状态的β2-受体兴奋剂变为游离态，更易于被SPME纤维所吸附。尿样需用乙酸调节pH值到5.2，加入β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶于37℃水浴中孵育1小时；组织样(肝脏、肺、肌肉组织等)经绞碎、匀浆后，用乙酸调节pH值到5.2，加入β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶于37℃水浴中孵育1小时，然后过滤。
2.萃取，即步骤b
取8ml待测样品(尿样或组织样滤液)于洁净10ml萃取小瓶中(预先放入磁力搅拌子)，在搅拌(磁力搅拌子)状态下直接用SPME装置进行萃取。通过试验(如正交试验)确定溶液最佳pH值、最佳盐浓度、最佳萃取温度及最佳萃取时间，以获得最大萃取量。萃取时间选择萃取达到平衡的时间(即待测物在固相涂层/液相之间分配达到平衡状态的时间)，如果平衡时间过长也可以选择非平衡点萃取，但此时要获得较好的重现性需控制萃取时间严格一致。pH值的选择应使待测物在溶液中呈中性分子形式，而非带电荷的离子形式，这样易于被SPME纤维吸附，β2-受体兴奋剂多为碱性物质，因而在碱性条件下多以中性分子形式存在，有较大萃取量。在溶液中加盐(NaCl或Na2SO4)可提高溶液的离子强度，从而提高β2-受体兴奋剂的固相涂层/液相分配系数，可增加萃取量。
3.衍生，即步骤c
β2-受体兴奋剂的衍生多用硅烷化试剂，硅烷化试剂遇水会发生反应，采用顶空气相衍生化(Headspace Derivazation，HSD)方式可避免衍生剂与水溶液直接接触，同时也避免了纤维与衍生剂液体的直接接触，防止衍生剂对纤维涂层造成损害。萃取后的SPME纤维立即插入预先封有5μl衍生剂的小瓶(体积为2ml)中，将纤维暴露于衍生剂气相顶空中，于60℃衍生反应10min。衍生反应时间和温度需经优化，以使衍生反应进行完全。
4.解析测定，即步骤d
将吸附了待测物的纤维插入GC/MS的进样器中，于270℃解析3min。解析温度和解析时间需经优化，以使解析完全；离子化采用电子轰击(Electron Impact Ion Source，EI)电离或化学离子化；采用选择离子检测方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面积定量，用SIM所得峰面积对照标准曲线计算出待测样品中β2-受体兴奋剂的浓度。
当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，其固相微萃取方法是使用带有聚丙烯酸酯(PA)涂层纤维萃取头的固相微萃取装置，以直接法，即将纤维萃取头直接插入样品中进行萃取；所说的衍生化反应是以N，O-双三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生剂，采用顶空衍生法进行衍生化反应；所说的选择离子检测方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量离子。
本发明将衍生化固相微萃取(Solid phase microextraction，SPME)技术与气相色谱/质谱(GC/MS)联用同时检测一种或多种β2-受体兴奋剂，其原理是利用待测物对活性固体表面(SPME纤维表面的涂层)有一定的吸附亲和力，使其从样品中分离，并富集于SPME纤维上；再将纤维置于衍生剂的气相顶空中进行衍生化反应；最后于GC/MS系统中检测。该方法克服原有方法假阳性率高、灵敏度低、前处理操作过程繁琐，需要大量有机溶剂的缺点，可有效应用于家畜尿样及组织(如肝脏、肾脏、肌肉、视网膜等)样品中β2-受体兴奋剂残留量的检测，具有操作简单、分析快速、准确性好、灵敏度高、所需有机溶剂少、经济、无毒害、无污染等优点，可同时测定一种或多种β2-受体兴奋剂。本方法还可用于法医鉴定中人类尿样、发样中β2-受体兴奋剂的分析及家畜尿样及组织样品中抗生素类药物的分析。
本发明方法的样品的萃取、衍生、进样过程全部在纤维上完成，操作简单；单个样品的分析时间小于2小时，检测快速，克服原有GC/MS法操作繁琐，检测时间长的缺点；采用质谱作检测器，分析准确度高，克服了ELISA法假阳性率高的缺点；且该方法有较高的灵敏度，检出限可达0.25μg/l，克服了HPLC法灵敏度低的问题。
下面通过对本发明方法在检测β2-受体兴奋剂克仑特罗中的应用，对本发明作进一步的说明。
附图说明
图1为尿液中克仑特罗标准曲线；
图2为实施例中1号样品的SIM色谱图及质谱图；
图3为实施例中2号样品的SIM色谱图及质谱图；
图4为实施例中3号样品的SIM色谱图及质谱图。
具体实施方式
本发明方法在检测猪尿样品中盐酸克仑特罗(俗称“瘦肉精”)残留量中的应用。
取猪尿样品三份，各10ml，用乙酸调节pH值到5.2，分别加入100μlβ-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶(30U/ml)，震荡，于37℃水浴中孵育1小时。
再用pH值为9浓度为0.1M的硼酸缓冲溶液稀释尿样(按1∶3的比例)，稀释的目的是防止加盐后样品产生浑浊，或者用过滤的方法除去浑浊。加入10.0g氯化钠，使其浓度为0.25g/ml，取8ml到萃取瓶中(预先放入磁力搅拌子)，盖上瓶塞，插入SPME装置，推出纤维，于40℃搅拌状态下萃取30min。SPME纤维选择的是商用聚丙烯酸酯(PA)涂层纤维，涂层厚度为85μm(购自美国Supelco公司)。
萃取后的SPME纤维立即插入预先封有5μl衍生剂(N，O-双三甲基硅烷基三氟乙酰胺，BSTFA)的小瓶(体积为2ml)中，将纤维暴露于衍生剂气相顶空中，于60℃衍生反应10min。
将吸附了待测物的纤维插入GC/MS的进样器中，解析3min。GC/MS条件如下：色谱柱：DB-5MS，25m×0.25mm ID，0.25μm膜厚；载气：氦气，恒定线速度40cm/s；进样口温度：270℃，无分流进样；柱温程序：初始温度120℃，保持1min，然后以10℃/min的速度升温，温度升至280℃时保持1min；色谱-质谱接口温度：270℃；离子源温度：200℃；电子能量：70eV；溶剂延迟：5min；质谱采用电子轰击(EI)电离方式；采用选择离子检测方式(SIM)，以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量离子。见附图2、3、4。
绘制标准曲线时，取一定量经检测无克仑特罗的猪尿样品，添加盐酸克仑特罗标准，用乙酸调节pH值到5.2，按1ml尿样加10μl酶溶液的比例分别加入适量β-葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶(30U/ml)，震荡，于37℃水浴中孵育1小时，用pH值为9浓度为0.1M的硼酸缓冲溶液按1∶3稀释，稀释后克仑特罗浓度分别为2μg/l、5μg/l、20μg/l、50μg/l、100μg/l、200μg/l，加入适量氯化钠，使其浓度为0.25g/ml。取8ml到萃取瓶中，按上述SPME方法进行萃取、衍生、解析进样，按上述GC/MS条件进行检测，以峰面积对盐酸克仑特罗浓度绘制工作曲线，如附图1所示。
实际样品定量时，用SIM所得峰面积对照标准曲线可计算出样品中盐酸克仑特罗的浓度。表1为上述3份样品的测定结果，每份样品平行测定三次取平均值。因尿样经过稀释，其原始浓度为所测浓度的4倍。
表1 SPME-HSD-GC/MS检测实际尿样的结果
样品1 样品2 样品3
1 2 3 1 2 3 1 2 3
峰面积 101347 111138 116666 20163 22578 25113 86052 79183 96470
C1 88.87 97 101.56 21.62 23.62 25.72 76.2 70.51 84.83
C 95.80 23.65 77.18
C2 383.21 94.61 308.72
C1：稀释后尿样中克仑特罗的浓度(μg/l)
C：稀释后尿样中克仑特罗的浓度均值(μg/l)
C2：原始尿样中克仑特罗的浓度(μg/l)
用传统SPE-GC/MS方法测定此三份样品，与SPME-HSD-GC/MS方法进行比较，结果见表2。经t检验，两种检测方法结果的差异无统计学意义。
表2 两种方法检测实际尿样中克仑特罗浓度的结果比较(单位：μg/l)
样品号 SPE-GC/MS SPME-HSD-GC/MS
1 390.67 383.21
2 85.68 94.61
3 330.52 308.72
该方法在2μg/l～200μg/l范围内线性良好(r＝0.9982)，检出限为0.25μg/l，方法的精密度良好RSD＜10％，加标回收率在95％～107％之间。
本发明方法(SPME-HSD-GC/MS法)检测一批样品的时间只需2小时，较传统的SPE-GC/MS法(5小时)大大节约时间；SPME-HSD-GC/MS法所需衍生剂的量很少(5μl)，而传统的SPE-GC/MS法需100μl；采用质谱作检测器，保留了准确性好的优点，且检出限可达0.25μg/l，灵敏度高。
Claims (9)
1.一种快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法，其特征在于依次包括以下步骤：
a.将待检测的生物样品经葡萄糖醛甙酶/硫酸酯酶酶解，使其中所含结合状态的β2-受体兴奋剂变为游离态；
b.以固相微萃取方法对样品中的β2-受体兴奋剂进行萃取；
c.将萃取后的固相微萃取纤维立即进行衍生化反应；
d.将吸附了待测物后经衍生化反应的固相微萃取纤维插入气相色谱/质谱(GC/MS)进样器中解析，离子化，采用选择离子检测方式(selected ion monitoring，SIM)，以峰面积定量，用SIM所得峰面积对照标准曲线计算出待测样品中β2-受体兴奋剂的浓度。
2.根据权利要求1所述的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法，其特征在于，当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，所说的固相微萃取方法是使用带有聚丙烯酸酯(PA)涂层纤维萃取头的固相微萃取装置，以直接法，即将纤维萃取头直接插入样品中进行萃取。
3.根据权利要求1、2所述的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法，其特征在于，当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，所说的衍生化反应是以N，O-双三甲基硅烷基三氟乙酰胺(BSTFA)为衍生剂，采用顶空气相衍生化(Headspace Derivazation，HSD)方式进行衍生化反应。
4.根据权利要求1、2所述的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法，其特征在于，当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，所说的离子化是电子轰击(Electron ImpactIon Source，EI)电离方式。
5.根据权利要求3所述的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法，其特征在于，当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，所说的离子化采用的是电子轰击(ElectronImpact Ion Source，EI)电离方式。
6.根据权利要求1、2或5所述的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法，其特征在于，当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，所说的选择离子检测方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量离子。
7.根据权利要求3所述的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法，其特征在于，当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，所说的选择离子检测方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量离子。
8.根据权利要求4所述的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法，其特征在于，当所检测的β2-受体兴奋剂为克仑特罗时，所说的选择离子检测方式(SIM)是以m/z 86、m/z 262和m/z 277作定量离子。
9.权利要求1至8中任一项所述的快速检测生物样品中β2-受体兴奋剂的方法在克仑特罗检测中的应用。
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