CN1473938A - 酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，是用酶水解淫羊藿甙糖基，制备低糖淫羊藿甙或甙元。包括如下步骤：取能水解淫羊藿甙糖基的酶；将酶、淫羊藿甙及缓冲液混合反应1－36小时，反应条件为温度4－75℃、pH值3－9；提取低糖淫羊藿甙或甙元。克服了现有技术所存在的对甙破坏性大，污染大，目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解淫羊藿甙糖基，更加提高了低糖淫羊藿甙或甙元的转化率。
Description
技术领域：
本发明涉及一种制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，尤其是一种用酶水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法。
背景技术：
淫羊藿是常用的中药，是Berberridaceae科淫羊藿属(Epimedium genus)植物。中华人民共和国药典(2000年版)收载了如下五种淫羊藿药材，药材为干燥的地上部分。即淫羊藿(Epimedium brevicornum Maxim)、箭叶淫羊藿(Epimedium sagittatum)、柔毛淫羊藿(Epimedium pubescens)、巫山淫羊藿(Epimedium wushanenes)、朝鲜淫羊藿(Epimedium koreanum Nakai)等。淫羊藿主要含有异戊烯基取代的黄酮甙(淫羊藿甙)和乙酰基取代的化合物，但是其乙酰基在加工淫羊藿、提取淫羊藿甙的过程中很容易脱掉，因此在淫羊藿中主要含的甙为黄酮甙，即淫羊藿甙。其主要药效为补肾壮骨、增强内分泌，具有激素作用，可促进骨髓细胞DNA合成，促进骨细胞的生长。淫羊藿甙的化学分子结构为：
根据分子结构式中不同的R2、R1、R3，淫羊藿甙(苷)分为多种，可按序号排列如下：
R2 R1 R3
淫羊藿甙(苷)1： rha-rha- glc- Me
淫羊藿甙(苷)2： glc-rha- glc- Me
淫羊藿甙(苷)3： xyl-rha- glc- Me
淫羊藿甙(苷)4： rha-rha- glc- H
淫羊藿甙(苷)5： glc-rha- glc- H
淫羊藿甙(苷)6： xyl-rha- glc- H
淫羊藿甙(苷)7： rha-rha- H Me
淫羊藿甙(苷)8： glc-rha- H Me
淫羊藿甙(苷)9： xyl-rha- H Me
淫羊藿甙(苷)10： rha-rha- H H
淫羊藿甙(苷)11： glc-rha- H H
淫羊藿甙(苷)12： xyl-rha- H H
淫羊藿甙(苷)13： rha-- glc- Me
淫羊藿甙(苷)14： rha- glc- H
淫羊藿甙(苷)15： rha- H Me
淫羊藿甙(苷)16： H glc- Me
淫羊藿甙(苷)17： rha- H H
淫羊藿甙(苷)18： H glc- H
4’-甲氧基淫羊藿甙元： H H Me
淫羊藿甙元： H H H
上述不同的淫羊藿甙均有3个糖基，即多糖基淫羊藿甙。多糖基淫羊藿甙活性较低，而低糖基淫羊藿甙或淫羊藿甙元活性却较高，为了得到淫羊藿甙元或者低糖基淫羊藿甙，曾报道过酸碱水解法(孙朋悦等，中国药物化学杂志，1998，30(4)，281-284)，但所述方法对甙破坏性大，污染严重，目的性差。
发明内容：
本发明是为了解决现有技术所存在的技术问题，提供一种酶法水解淫羊藿甙糖基，制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，无污染、目的性强、转化率高。
本发明的技术解决方案是：一种酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：用酶水解淫羊藿甙糖基，制备低糖淫羊藿甙或甙元。
包括如下步骤：
a.取能水解淫羊藿甙糖基的酶；
b.将酶、淫羊藿甙及缓冲液混合反应1-36小时，反应条件为温度4-75℃、PH值3-9；
c.提取低糖淫羊藿甙或甙元。
所述的a步骤可由微生物发酵制备。
所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。
所述的微生物可为细菌、霉菌、酵母菌，最好用曲霉属霉菌。
所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵，产酶诱导物可为黄酮甙或异黄酮甙，可以用含有黄酮甙或异黄酮甙的中草药或者其提取物。
所述的b步骤的淫羊藿甙浓度为总反应物体积的0.1-10％。
所述的缓冲液为醋酸或磷酸。
所述的c步骤为用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。
本发明同现有技术相比，最大的特点是用酶水解淫羊藿甙糖基来制备低糖淫羊藿甙或甙元。克服了现有技术所存在的对甙破坏性大、污染严重、目的性差等缺点，具有无污染、目的性强、转化率高的优点。尤其是在微生物发酵中加入了产酶诱导物，可大大提高其产酶量，有助于充分水解淫羊藿甙糖基，更加提高了低糖淫羊藿甙或甙元的转化率。
具体实施方式：
实施例1：
a.以高温好氧菌Clostridium thermocopriea(文献1)在含3％玉米粉、1％产酶诱导物——淫羊藿浸出物(干物)培养基中，在温度为60℃的条件下，振荡培养30-60小时，离心除菌；往上清液(含酶混合液)中加入65％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，用0.02M、pH5醋酸缓冲液透析，离心除渣，冻干，得到甙酶。
b.将0.2克上述甙酶、3克淫羊藿甙1、2、3的混合物或者单体、150毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)混合均匀，使淫羊藿甙1、2、3的混合物占总反应体积的0.1-10％，在温度75℃的条件下搅拌反应1小时。
c.反应後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，过滤除去酶蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到2.1克粗品。
用高效液相色谱法(文献2)检测结果85％以上的甙转化成单糖淫羊藿甙16、甙元。经硅胶柱分离(文献3)，在热甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到纯0.1克淫羊藿次生甙13、0.05克单糖淫羊藿甙15和16以及0.02克4’-甲氧基淫羊藿甙元。
实施例2：
a.以高温好氧菌Clostridium thermocopriea(文献1)在含4％玉米粉、0.2％产酶诱导物——淫羊藿浸出物(干物)培养基中，在温度为60℃的条件下，振荡培养30-60小时，离心除菌，往上清液(含酶混合液)中加入乙醇沉淀酶蛋白，冻干，得到甙酶。
b.将0.3克上述甙酶、2克淫羊藿甙1、2、3的混合物、120毫升醋酸缓冲液(0.2M，pH5.0)混合均匀，使淫羊藿甙1、2、3的混合物占总反应体积的0.1-10％，在温度为5℃的条件下搅拌反应36小时。
c.反应後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，过滤除去酶蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到1.7克粗品。
用高效液相色谱法(文献2)检测结果90％以上的甙转化成单糖淫羊藿甙14、17和18。经硅胶柱分离(文献3)，在热甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到纯0.3克淫羊藿甙14，0.1克淫羊藿甙17和0.1克淫羊藿甙18。
实施例3：
a.以高温好氧菌Clostridium thermocopriea(文献1)在含3％玉米粉、1％产酶诱导物——人参浸出物(干物)培养基中，在温度为60℃的条件下，振荡培养30-60小时，离心除菌，往上清液(含酶混合液)中加入乙醇沉淀酶蛋白，收集蛋白，冻干，得到甙酶。
b.将0.4克上述甙酶、2克淫羊藿甙4、5、6的混合物、120毫升磷酸缓冲液(0.2M，pH5.0)混合均匀，使淫羊藿甙4、5、6的混合物占总反应体积的0.1-10％，在温度60℃条件下，搅拌反应18小时。
c.反应後加入300毫升乙醇沉淀酶蛋白，过滤除去蛋白沉淀，滤液减压蒸干，得到低糖基淫羊藿甙1.5克粗品。
经硅胶柱分离(文献3)，在热甲醇中溶解、冷甲醇沉淀，得到纯0.3克淫羊藿甙14、0.1克淫羊藿甙17和0.06克淫羊藿甙元。
实施例4：
a.以黑曲霉菌(Aspegillus niger)在含4％麦芽浸出物、0.5％产酶诱导物——淫羊藿浸出物(干物)的培养基中，在28-30℃搅拌通风培养50-100小时，离心除菌，得含酶混合液，用60-75％饱和度的硫酸铵沉淀酶蛋白，收集蛋白，溶于1/10发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)中，透析除去硫酸铵，离心除渣，即为酶液。
b.将3克淫羊藿甙4、5、6的混合物或者其单体(占总反应体积的0.1-10％)、100毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)和20毫升上述酶液混合，使在20-55℃反应1-4小时。
c.加入1/3总反应体积的正丁醇萃取皂甙三次，减压蒸干，得到低糖基次生皂甙粗品2克。
用硅胶柱分离方法(文献3)得到0.1克的纯淫羊藿甙17、18和0.15克淫羊藿甙元。
实施例5：
a.同实施例4；
b.将1克淫羊藿甙7、8、9的混合物或者其单体(占总反应体积的0.1-10％)、50毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)和20毫升酶液混合，在20-55℃反应1-4小时。
c.加入1/3总反应体积的正丁醇萃取皂甙三次，减压蒸干，得到低糖基次生皂甙粗品2克。
用高效液相色谱法(文献2)检测结果85％以上的甙转化成单糖淫羊藿甙17、甙元。用硅胶柱分离方法(文献3)得到0.1克的纯淫羊藿甙17和0.05克淫羊藿甙元。
实施例6：
a.米曲霉菌(Aspegillus oryzae)在含5％麦麸浸出物、0.2％产酶诱导物——淫羊藿甙或者芦丁、或者1％其黄酮类来源植物的浸出物的培养基中，在温度为28-30℃的条件下搅拌，通风培养50-100小时，离心除菌得含酶混合液，加入乙醇沉淀酶蛋白，收集蛋白，加入1/5发酵液体积的醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)，即为酶液。
b.将上述酶液按实施例4的b、c步骤处理淫羊藿甙1、2、3，得到单糖淫羊藿甙13、15、16和4’-甲氧基甙元；处理各种淫羊藿甙4、5、6，得到单糖淫羊藿甙14、17、18和甙元。
实施例7：
a.同实施例6；
b.将10克淫羊藿提取物(甙含量60％以上)、酶液50毫升、400毫升醋酸缓冲液(0.02M，pH5.0)混合在20-55℃反应1-4小时。
c.加入1/3总反应体积的正丁醇萃取皂甙三次，减压蒸干，得到低糖基次生甙粗品5克。
用高效液相色谱法(文献2)检测结果，主要含有单糖淫羊藿甙15、16、17、18，少量的淫羊藿甙13、14和4’-甲氧基淫羊藿甙元和甙元。
实施例8：
a.假丝酵母在含淫羊藿粉10％的麦麸培养基(干物1000克)上接种，分装在茄子瓶中30℃固体培养3～6天，收集培养物，在培养基干物中加入6000毫升的生理盐水，浸泡一小时，离心取上清(含酶混合液)，加入饱和度60～75％的硫酸铵，使酶蛋白沉淀，收集沉淀，用800毫升的pH5、0.02M醋酸钠缓冲液溶解，透析除去硫酸铵，离心除渣，即得1000毫升左右的酶液。
b.将上述酶液按实施例4的方法处理淫羊藿甙1、2、3、4、5、6和混合物得到单、双糖淫羊藿甙或甙元。
实施例中所述文献为：
1.Fengxie Jin et al(金凤燮等)：J.Int.Syst.Bact，1988，38，279-281.
2.马卓等，中国医药学杂志，2002，22(11)，697。
3.孙朋悦等，中国药物化学杂志，1998，30(4)，281-284。
Claims (10)
1.一种酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：用酶水解淫羊藿甙糖基，制备低糖淫羊藿甙或甙元。
2.根据权利要求1所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于包括如下步骤：
a.取能水解淫羊藿甙糖基的酶；
b.将酶、淫羊藿甙及缓冲液混合反应1-36小时，反应条件为温度4-75℃、PH值3-9；
c.提取低糖淫羊藿甙或甙元。
3.根据权利要求2所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：所述的a步骤可由微生物发酵制备。
4.根据权利要求3所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：所述的微生物发酵制备是用液态发酵或固态发酵法得到含酶混合液，在含酶混合液内加入硫酸铵或者乙醇提取酶。
5.根据权利要求3或4所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：所述的微生物为细菌、霉菌、酵母菌。
6.根据权利要求3或4所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：所述的微生物为曲霉属(Aspergillus genus)霉菌。
7.根据权利要求3所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：所述的微生物发酵为有产酶诱导物参与发酵。
8.根据权利要求2所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：所述的b步骤的淫羊藿甙浓度为总反应物体积的0.1-10％。
9.根据权利要求2所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：所述的缓冲液为醋酸或磷酸。
10.根据权利要求2所述的酶法水解淫羊藿甙糖基制备低糖淫羊藿甙或甙元的方法，其特征在于：所述的c步骤为用乙醇沉淀提取或用正丁醇萃取。
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