CN1473272A - 诊断传染性海绵状脑病的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在动物中诊断传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy)(TSE)或朊病毒疾病的方法，该方法包含测定所述动物的样品以确定样品中的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系造血细胞的数目或其表达产物的量。

Description

诊断传染性海绵状脑病的方法
本发明涉及诊断传染性海绵状脑病(TSE)或朊病毒疾病的新方法。
对TSE的生物学全面综述可参见发表的综述形式(Prusiner，S.B.，Proc.Nat’l Acad.Sci USA 95 13363-13383(1998))和/或因特网(http：//www.mad-cow.org)。传染性海绵状脑病(TSEs)或朊病毒疾病是一组中枢神经系统(CNS)的不变的致命性病症，它们是通过遗传、传染或散发性机制显现。它们包括绵羊的瘙痒病、牲畜的牛海绵状脑病(BSE)和库鲁症、克-雅病(CJD)、新变体(nv)CJD、Gerstmann-Straussler Sheinker综合症(GSS)和人的致命性家族失眠症。TSE疾病也显现于其他物种中，如驼鹿、鹿、水貂、猫(FSE)和引进的动物园物种如林羚(Nyala)、阿拉伯羊(Arabian Oryx)、印度豹(Cheetah)和大捻角羚(Kudu)。在鹿和驼鹿中也鉴定出了慢性萎缩疾病(CWD)，已提示该疾病也可以传染给人。
TSE疾病特征在于长的无症状潜伏期及随后相对快的临床病程，该病程常包括神经变性、液泡化、神经胶质细胞增生和有蛋白酶抗性的朊病毒蛋白质Sc(PrPSc)的积累，其中的朊病毒蛋白质Sc是宿主编码的糖蛋白PrPC的异常同工型。将正常的对蛋白酶K敏感的PrPC转变为异常的有蛋白酶K抗性的同工型PrPSc是TSE疾病的经常性的特征标志。
当前，作为BSE流行病及随后新变体CJD在人中的出现的结果，在英国对TSE疾病有相当大的兴趣；认为TSE疾病起因于BSE并作为感染BSE的组织进入人食物链的结果而穿过物种屏障而进入人类。大多数英国公民可能已经暴露于BSE感染的介质中了。除了天然的绵羊瘙痒病的问题之外，现认为由于感染BSE的物质已出现于动物饲料中，所以BSE也很可能以亚临床无症状水平存在于绵羊和其他农业物种中。
英国人口中存在的nvCJD的程度和继续发展为疾病的比例当前仍未知。目前没有有效的死前诊断方法估计人或动物中TSE潜在的感染。为了从人食物链中去除感染TSE的农业物种并估计人类中TSE潜在的感染，需要有适当的诊断方法，且理想为针对容易得到的组织如血液。目前，鉴定的唯一的疾病特异性大分子是PrPSc。然而，实际上仅在死后能在CNS中检测到PrPSc，尽管在一些TSE疾病中它可在扁桃体活组织检查中被检测到(Coghlan，A.，New Scientist，第5页，(6月15日，1996))。最近已证明PrPSc可在感染TSE的动物血液中检测到(Schmerr等人Journal of Chromatography 853(1-2)207-214(1999))。然而，这是耗时且在技术上显著苛求的程序，是对PrPSc的一般检测。另外，PrPSc通常在明显地受TSE疾病侵袭的人和动物CNS组织中是不可检测的。因此，没有有效的估计TSE感染的死前诊断方法。理想的诊断方法因而应该不基于PrPSc，且可允许在容易得到的组织如血液中对潜在的TSE感染进行估计。这样的诊断检验将理想地允许在早期对活个体的TSE感染进行估计，而可执行治疗干涉策略。
几个在感染TSE的动物的CNS组织中差异表达的基因已有报道。然而，到目前为止，尚未有其他报道关于感染TSE的动物的脾、骨髓或血液中差异表达的基因。尽管来自TSE感染的动物的血液已显示具有感染性，且已证明PrPSc蛋白质在若干造血细胞中表达，但是在本发明之前尚未认识类红细胞造血细胞和TSE发病机理之间的联系。有关当前TSE诊断成果的全面概要可参见因特网(http：www.mad-cow.org/OO/sci_archive_frame.html)。
当前的TSE研究迄今为止未能在TSE发病机理中包含EDRF或类红细胞造血细胞生物学，或者在脾、血液或骨髓中鉴定TSE感染的非PrPSc分子标记。该领域的多数研究人员看来集中于旨在检测PrPSc的方法上。
现在已经发现EDRF，一个正常表达于造血组织类红细胞中的基因，在感染TSE的动物的造血组织中差异表达。EDRF表达于脾、骨髓和血液中的类红细胞和巨核细胞/血小板谱系的造血细胞中。因此，看来血细胞生成，特别是红细胞生成，在受TSE感染的个体中受到令人惊讶的影响。
根据本发明的第一个方面，提供在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，该方法包含测定从动物中获得的样品以确定样品中的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的相对数目。
传染性海绵状脑病(TSEs)或朊病毒疾病包括绵羊的瘙痒病、牲畜的牛海绵状脑病(BSE)和库鲁症、克-雅病(CJD)、新变体(nv)CJD、Gerstmann-Straussler Sheinker综合症(GSS)和人致命性家族失眠症。TSE疾病特征在于朊病毒蛋白质Sc(PrPSc)，即宿主编码的糖蛋白PrPC的异常同工型的积累。已认识到正常的对蛋白酶K敏感的PrPC转变为异常的具有蛋白酶K抗性的同工型PrPSc是TSE疾病的特征。
为本发明的目的，术语TSE感染与术语TSE疾病状况意义等同。TSE疾病传染的确切手段仍然是科学争论的主题。实验动物可在实验室中用TSE疾病“感染”。虽然临床表现足够明显，但在实践中遇到的疾病是否是正常字面意义上的“感染”仍然未知。
受TSE疾病感染的动物包括哺乳动物如绵羊、牛、人、猫、驼鹿、鹿、水貂，和引进的动物园物种如林羚(Nyala)、阿拉伯羊(Arabian Oryx)、印度豹(Cheetah)和大角羚捻(Kudu)，以及鸟类物种如家禽，例如鸡、火鸡、珍珠鸡。因此与本申请一致的方法可扩展为在绵羊、牛、鹿、驼鹿或人中的TSE诊断方法。
根据本发明要测定的样品一般为生物学样品，例如来源于造血细胞或基于血液的样品。该样品可为全部或分级分离的血液(或部分分级分离的血液)、血浆、造血组织如骨髓或来自脾。该样品可加入进一步的成分而使样品分析最优化。例如，在血液样品中可方便地加入如肝素、EDTA和/或柠檬酸钠等物质以防止形成血块方式的凝固。其他的样品来源包括脑脊液(CSF)、尿、泪、乳、精液、粘液分泌物、组织或器官活组织检查，如脑、肝、胸腺、胰腺。
类红细胞谱系的造血细胞包括多能干细胞、髓样干细胞、CFU-GEMM细胞(粒细胞/红细胞/单核细胞/巨核细胞集落生成单位)、BFU-E细胞(类红细胞-血浆生成单位)、CFU-E细胞(类红细胞原红细胞-集落生成单位)、网织红细胞和红细胞。类红细胞谱系的造血细胞示意性地表示在图11中。
单能造血细胞是指定型为单一细胞谱系的细胞；双能造血细胞是指定型为两个可能的细胞谱系之一的细胞，例如E/Meg或红细胞/巨核细胞，其能够沿红细胞或巨核细胞谱系分化；三能造血细胞是指定型为三个可能的细胞谱系之一的细胞。
如Junquiera或Wheater的定义所述，红细胞从原红细胞的成熟包括经由下列已识别细胞类型的过程，如下所示：
Junquiera定义 Wheater定义
原红细胞 原红细胞
嗜碱性成红细胞 早幼红细胞
多染性成红细胞 中幼红细胞
正染性(Orthochromatophilic)成红细胞 晚幼红细胞
网织红细胞 网织红细胞
巨核细胞(mekaryocyte)和血小板谱系造血细胞包括E/Meg前体细胞、原巨核细胞和分化的巨核细胞或血小板细胞。
因此与本发明一致的方法可为对一或多种上述的造血类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的细胞类型的测定，或对与一或多种造血类红细胞、巨核细胞或血小板谱系细胞类型相关联的表达产物的测定。
与造血类红细胞谱系细胞相关联的表达产物是类红细胞分化相关因子(EDRF)。EDRF表达于双能细胞，该双能细胞能够继续分化为类红细胞或巨核细胞或E/Meg细胞、血浆生成单位(BFU-E)细胞、集落生成单位(CFU-E)细胞、原红细胞(前成红细胞)、早幼红细胞(嗜碱性成红细胞或早幼红细胞)、中成红血细胞(中幼红细胞或多染性成红细胞)、晚幼红细胞(正成红细胞或正染性成红细胞)，包括血红蛋白阳性的晚幼红细胞和网织红细胞，即正在生成红细胞的细胞，包括红细胞。
正常表达EDRF的具体目的细胞可用抗-TER-119抗体来鉴定，即TER-119+细胞。TER-119抗体是针对免疫原C57BL/6小鼠14日胎肝细胞而产生(Ikuta等人Cell 62 863-874(1990))，且为大鼠(Wistar)IgG2b κ的同工型(TER-119抗体由BD Pharmingen，SanDiego获得)。TER-119抗体与生产类红细胞的器官中的类红细胞谱系和多数表达EDRF的细胞反应，尽管不与所有这样类型的细胞反应。TER-119抗原特异表达于从早原红细胞到成熟红细胞阶段的类红细胞，但不表达于具有CFU-E或BFU-E活性的细胞。可以用本发明的方法进行这样测定的细胞包括原红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞、网织红细胞(前红细胞)和红细胞。用于检定这样的细胞的其他抗体为抗-血型糖蛋白A、抗-EDRF、抗-CD-61、抗-CD-71、抗-运铁蛋白、抗-铁蛋白、抗-EDRF和抗-血红蛋白抗体。抗-CD-61抗体可用于在从前体到成熟的细胞中检测巨核细胞/血小板谱系的细胞(商品由Miltenyibiotec提供-www.miltenyibiotec.com)。
在本发明这方面的一个优选实施方案中，诊断方法包含测定表达EDRF的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系造血细胞的数目。这样的细胞可包括但不局限于E/Meg、CFU-GEMM细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞、网织红细胞(前红细胞)。正常表达EDRF的细胞谱系的耗尽可在被试对象中指示TSE感染(或TSE疾病状况)。细胞谱系的耗尽是相比于非感染个体中存在的所测类型的细胞数目，换句话说，为显著地偏离特定细胞的正常数目。正常的范围可通过测定健康的非感染个体的统计相关群体而确定。
另一个表达标记可为血红蛋白，它在遭受TSE感染或TSE疾病状况的被试者中也表现为被耗尽。
样品中细胞数目的测量可利用任何方便的方法来实现。例如，细胞数目可用荧光激活的细胞分类法(FCAS)来测定；以特定细胞染料如Geimsa-wright组织学染料的方式来手工计数。或者，可以用自动血液学分析仪对造血细胞如红细胞或网织红细胞计数(Miltenyibiotec-www.miltenyibiotec.com)。也可能用血流比容计来估计样品中细胞的数目，例如常规用于测量红细胞数目、收集细胞体积等的血流比容计。估计祖先细胞数目的另一个方法是在半固体培养基如甲基纤维素上培养血液/骨髓并对群体计数。
用抗体鉴定目的造血细胞可使用修饰型抗体，如缀合生物素或用荧光标记物标记的抗体。对目的抗体阳性的细胞可以方便地用荧光激活细胞分类法(FCAS)、流式细胞仪或磁珠分离方法进行分离。例如类红细胞谱系的细胞可以用如TER-119抗体的抗体进行鉴定，该抗体可与适当的报告分子部分偶联。
可用样品收集和分析的标准技术，如血液学和/或细胞学技术，来建立对照或正常群体值。可使用标准的统计技术定义有意义的群体平均值，这可能需要考虑如年龄、性别和/或基因型的因素，且可基于非感染个体或非感染个体的群体。
新近对在静脉、指血和动脉血液的血液计数比较(Yang，等人，Clin.Lab.Haem.23 155-159(2001))确立了在给定人群中正常的血细胞群体计数，如下：
白细胞计数 6.89(+/-1.74)×109每升
红细胞计数 4.75(+/-0.48)×1012每升
血小板计数 222(+/-35)×109每升
血红蛋白浓度 14.3(+/-1.4)g/dl
在本发明这方面的一个优选实施方案中，诊断方法包含测定包括表达EDRF的造血类红细胞、巨核细胞或血小板谱系细胞的样品中EDRF的相对浓度。这样的细胞可包括但不局限于E/Meg、CFU-GEMM细胞、BFU-E细胞、CFU-E细胞、原红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞、网织红细胞(前红细胞)、巨核细胞或血小板。鼠、人和牛EDRF的核苷酸序列如图3所示且预测的氨基酸序列如图4所示。EDRF的相对浓度可通过在样品中测量EDRF蛋白质水平而直接测定，或用EDRF cDNA来测量编码EDRF的mRNA水平而间接测定，其中mRNA的水平可指示样品中的细胞EDRF表达水平。样品中EDRF水平的降低可在被试对象中指示TSE感染(或TSE疾病状况)。表达水平的降低是相对于非感染个体中存在的表达水平。正常范围可通过测定健康的非感染个体的统计相关群体而确定。
进一步的诊断测定可涉及抗EDRF抗体的使用，该抗体可为多克隆抗体或单克隆抗体。多克隆抗体可当将本发明的物质注射动物时通过刺激它们在适当的动物宿主(如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、绵羊、鸡、山羊或猴子)中的生产而得到。如果需要，可与本发明的物质一起施用佐剂。于是抗体可通过它们结合EDRF的便利或如进一步在下文中描述的那样而纯化。单克隆抗体可从杂交瘤生产。这可以通过使骨髓瘤细胞和生产所需抗体的脾细胞融合形成无限增殖细胞系而形成。这是众所周知的Kohler&Milstein技术(Nature 256 52-55(1975))。
生产结合具体蛋白的单克隆和多克隆抗体的技术目前在本领域中很发达。在标准免疫学教科书中都有讨论，如在Roitt等人，Immunology第二版(1989)，Churchill Livingstone，London中。
除全抗体之外，本发明包括其能结合EDRF的衍生物。因而本发明包括抗体片段和合成的构建体。抗体片段和合成的构建体的实施例由Dougall等人在Tibtech 12 372-379(1994年9月)中给出。抗体片段包括如Fab、F(ab’)2和Fv片段(参见Roitt等人)。可以修饰Fv片段来生产已知为单链Fv(scFv)分子的合成构建体。这包括共价连接Vh和V1区域并有助于分子稳定性的肽连接体。
其他的合成构建体包括CDR肽。这些是包含抗原结合决定簇的合成肽。也可以用肽模拟物。这些分子通常为构象受限制的有机环，它模拟CDR环结构并包括同抗原相互作用的侧链。合成的构建物也包括嵌合分子。因而，例如人源化(或灵长类源化)的抗体或其衍生物属于本发明的范围。人源化抗体的一个实例是具有人的构架区而具有啮齿类动物的高变区的抗体。合成构建体也包括含有共价连接的部分的分子，这给分子提供除抗原结合之外的其他所需性质。例如该部分可能是标记(如检测性标记，如荧光或放射性标记)或药物活性剂。
对EDRF特异的抗体或其衍生物具有多种其他的用途。它们可用于EDRF本身或表达EDRF的细胞的纯化和/或鉴定。结果它们可用于根据本发明的诊断方法中。
在制备对EDRF的适当抗体之后，可以用几种一般可用的技术之一进行分离或纯化(例如描述于《抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)》，Harlow和Lane，eds.Cold SpringHarbor Laboratory Press(1988))。通常适当的技术包括肽或蛋白质亲和柱、HPLC或RP-HPLC、在蛋白质A或蛋白质G柱上的纯化或这些技术的组合。对EDRF的重组抗体可根据标准方法来制备，并用通常可用的程序包括ELISA、ABC、点印迹测定等来测定对EDRF的特异性。
测定样品中表达的EDRF蛋白质的方法的实例是蛋白质印迹法。来自样品的蛋白质提取物可通过变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分级分离。然后通过电印迹可将混合物转移并固定到固体硝酸纤维素膜或尼龙膜上。将有负载物的膜与抗-EDRF抗体进行温育。结果所得的抗原-抗体复合物可通过任何适当的程序来检测。例如，可以加入对抗抗-EDRF抗体的第二抗体，该抗体上连接了报告分子部分(如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶)。然后由酶作用生成的反应产物可被用来显示目的蛋白质在膜上的位置。对酶反应水平的测量可指示样品中目的蛋白质存在的水平。该检测系统的灵敏度可通过使用生物素-链霉抗生物素系统或通过化学发光检测而改善。
或者，EDRF蛋白质的水平可通过放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)的标准技术来测定。将抗体连接到报告酶上，然后固定在微量滴定板上。然后加入要测量的样品裂解液以允许抗体-抗原复合物形成。洗涤并提供底物后，产物形成的水平与存在于样品中的抗原即目的蛋白质的水平成比例。另一个方法是基于时间分辨荧光测定法的DELFIA系统。Delfia Research System(Wallac)测量镧系金属包括铕、钐和铽当cheated to可发荧光的分子时的荧光。将抗体标记并固定于微量滴定板上。加入要测量的样品裂解液以允许抗体-抗原复合物的形成。洗涤后，确定信号。
编码EDRF准备表达的RNA转录物的存在可以用RNA印迹法进行测定(Thomas，P.S.，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 77 5201-5205(1980))。简要地，将来自样品细胞的变性的RNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙滤膜上以便随后用于杂交测定。在由毛细管作用或在电场作用下将RNA转移到膜上之前，在变性的琼脂糖凝胶中进行电泳。使对EDRF RNA特异的放射性标记的DNA或RNA探针与结合滤膜的RNA进行杂交以使其能够检测。或者，RNA水平可以用“taqmanTM”进行测量，这是实时定量的RT-PCR程序，其特异性得自荧光能量转移(FRET)探针的使用，或通过基于发现的唯一一类结构特异的内切核酸酶(切割酶(cleavases))的“入侵者(invader)”技术。入侵者和信号探针设计为能与目的DNA/RNA上重迭位点杂交以使得入侵者探针可取代信号探针的一部分。这样形成一个切割酶可以识别并切割的结构，因而生成了可检测的产物。
本发明的这个方面可另外被定义为在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，该方法包含测定从动物获得的样品以确定样品中类红细胞、巨核细胞或血小板谱系造血细胞相对于对照或正常群体值的数目。
根据本发明的第二个方面，提供在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，该方法包含测定从动物样品以确定样品中类红细胞、巨核细胞或血小板谱系造血细胞的表达产物的相对量。要测定的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系造血细胞的表达产物可如上文所述。样品分析和表达产物检测的方法可如上文所述。
个体中TSE的存在可以通过这种测定而不参考样品中造血细胞的实际数目来确定，其中表达产物的量与由测定健康的非感染个体的统计相关群体而确定的正常范围进行比较。
根据本发明的第三个方面，提供在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的试剂盒，该试剂盒包含造血的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系细胞的抗体或EDRF的抗体。在本发明该方面的另一实施方案中，试剂盒可包含针对造血的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系细胞和EDRF两者的抗体。这样的二元抗体试剂盒可允许更高灵敏度的诊断方法。
造血的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系细胞特异的抗体如上文所述。EDRF的抗体可如上文所述而制备。
对抗体结合目标的测定可以用一般可用的标准技术如ELISA、ABC、点印迹测定来进行。也可以使用额外的检测标记如荧光或放射性标记。
如在上文所讨论，从中取样品进行测定的组织来源可包括血液或其组分，或其他组织和/或器官。因而本申请的方法可用于血液(或其组分)、组织和/或器官进行转输或移植入受体之前对其进行前筛选。血液或其组分，或其他组织和/或器官的来源对于受体而言可能为异源或异种。如果样品用根据本发明第一个方面的方法显示TSE感染存在的阳性结果，这将能够做出决定以避免在随后向受体的转输或移植中使用来自该被分析个体的捐献血液(或其组分)、组织和/或器官。通过这样的方法，可能避免TSE感染进入一般群体的潜在途径。
或者，在基于血液或组织或器官的产物制备之前，可在血液(或其组分)、组织和/或器官样品中进行筛选。这样的产物可包括从全血或其他组织来源制备的血浆或凝血因子富集物，例如因子IX、因子XI、因子VII、因子XII、因子V、因子XIII、因子VIIIC、因子VIIIvWFAg，或激素如生长激素、促红细胞生成素、T4甲状腺素或胰岛素。
根据本发明的第四个方面，因此提供制备血液产物的方法，该方法包括测定血液样品以确定获得该样品的动物中是否存在传染性海绵状脑病(TSE)，其中测定包含确定样品中类红细胞、巨核细胞或血小板谱系造血细胞的相对数目。
在本发明的优选实施方案中，诊断动物中是否存在传染性海绵状脑病(TSE)的方法可进行如下。
-样品收集，包括可选的样品制备步骤(例如加入血凝块形成抑制剂；防腐剂等)
-确定样品中类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的相对数目，通过(a)样品中的细胞群体的直接测量，或(b)参考这些细胞谱系的表达产物的间接测量(例如，EDRF蛋白质或编码EDRF蛋白的RNA)。
这样的优选方法的实例可包括步骤：
(1)从组织来源收集和/或制备样品；
(2)在计算细胞数目之前可选地标记细胞；
(3)确定样品中类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的相对数目，通过下面任一方式：
(i)人工计数确定；或
(ii)自动计数确定；以及
(4)将结果与来自正常非感染个体的对照参考样品进行比较。
另外的方法可包括步骤：
(1)从组织来源收集和/或制备样品；
(2)类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的细胞样品分离；
(3)测定细胞中表达产物的水平，例如测定EDRF表达水平，以下面任一方式：
(i)确定EDRF蛋白质水平(如通过蛋白质印迹法、放射免疫测定法(RIA)或ELISA)；或
(ii)用cDNA探针确定mRNA的水平(如通过RNA印迹法或RT-PCR)
(4)将结果与来自正常非感染个体的对照参考样品进行比较。
来自正常非感染个体的对照参考样品可包括来自正常非感染个体群体的混合样品的样品集合，该群体足以在统计分析中确立正常范围或正常值。
在根据本发明的方法中，类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的数目可参考这些细胞的表达产物而估计。该表达产物可为蛋白质或多肽，或者它可以为编码蛋白质或多肽的mRNA分子。
在根据本发明的方法中，当测定结果显示类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的细胞数目相对于对照或正常群体值有降低时，可以做出对该被测个体受TSE感染的诊断。
对照或正常群体值可如上文所述而确立，并可基于非感染个体或非感染个体的群体。
本发明的第二个和其后方面的优选性质如同第一个方面已作必要的修正。
现将本发明进一步描述，参考下面的图和实施例，其用于阐明发明目的，而不应该解释为限制。参考下图：
图1表示来自DDRT-PGR凝胶的一组图，其在疾病发病机理的各个阶段比较了年龄和性别匹配的对照和瘙痒病感染的小鼠(脑内途径)的脾中表达的基因亚群。感染后1、10天(dpi)；2、20 dpi；3、30 dpi；4、40 dpi；5、60 dpi；6，80 dpi；7、100 dpi；8、162 dpi(末期)。
图2表示从图1所示的DDRT-PGR凝胶中分离的cDNA的序列特性。
图3表示鼠和人全长EDRF cDNA的核酸序列和牛的部分EDRF序列。全长的(a)鼠和(b)  EST cDNA克隆经由IMAGE协会从人类基因组图谱计划获得(分别为IMAGE IDs 466407和220221)。cDNAEST克隆以正向和反向测序。(c)牛EDRF的部分167 bp序列是用在实验背景中陈述的简并寡核苷酸利用嵌套式PCR合成。
图4表示小鼠和人EDRF的氨基酸序列和部分牛EDRF蛋白质序列。
图5表示将小鼠EDRF和TEL分配到相同的基因组座位和转录物方向的分析。(a)用多种限制性内切核酸酶消化小鼠基因组DNA的Southern印迹，并用放射性标记的全长小鼠EDRF cDNA进行探查；(b)多种小鼠组织RNA用放射性标记的单链体外转录的核糖核酸探针进行探查的RNA印迹分析。
图6表示小鼠和人EDRF mRNA表达的组织分布。多种小鼠(a)和人(b，c)组织的RNA印迹分析用小鼠和人放射性标记的cDNA探针进行。
图7表示在对照和感染瘙痒病的脾、骨髓和全血中EDRF表达的RNA印迹分析。(a)从疾病发病机理的各个阶段的对照和瘙痒病感染的(Me7株)小鼠(C57B1品系)的脾中分离的RNA；(b)来自多种对照和感染瘙痒病的近交小鼠品系(VM和SV)和仓鼠(LVG)的脾。瘙痒病株系为Me7、87V、79A和263K，且显示了这些模型的温育周期；(c)来自对照和感染瘙痒病的小鼠的骨髓和全血(骨髓；VM小鼠/87V瘙痒病品系，全血；C57B1小鼠/Me7瘙痒病品系)。
图8表示天然野生TSE病例的血液和骨髓中EDRF表达的RNA印迹分析。(a)绵羊是年龄、品种和性别匹配的且具有相同的PrP基因型(ARQ杂合子)。同时取对照和瘙痒病绵羊的血液样品；(b)以BSE的最初明显迹象精选病理上确实的BSE-感染牲畜和健康的对照的胸骨骨髓中EDRF的表达。
图9表示表达EDRF的小鼠造血细胞谱系的确定。
图10表示表达EDRF的造血细胞的进一步表征。缩写如下：E，血红蛋白阳性的晚幼红细胞和网织红细胞；Meg，巨核细胞；Mac，巨噬细胞；Neut，嗜中性粒细胞；Mast，肥大细胞；BFU-E，含红细胞的前体生产集落；CFU-E，在原红细胞/CFU-E阶段的血红蛋白阴性的细胞。
图11表示定型为类红细胞谱系的造血细胞中的EDRF表达分配。(a)在耗尽了特定细胞谱系的骨髓悬浮液中的EDRF RNA表达。泳道A；未处理的全骨髓。泳道B到G分别代表耗尽了CD3e+、CD11b+、CD45R/B220+、Ly-6G+、TER-119+的骨髓悬浮液和非谱系(干)细胞；(b)&(c)为造血细胞序位的示意性表示。缩写：Meg，巨核细胞；E，类红细胞；Mast，肥大细胞；Mac，巨噬细胞；Neut，嗜中性粒细胞；B，B-细胞；T，T-细胞；p，祖先；BFU-E/CFU-E，血浆和集落生成单位，类红细胞祖先。
图12表示血细胞生成的图解。
图13表示类红细胞谱系的造血细胞的图解。
材料与方法：
来自感染TSE的小鼠的所有组织从神经发病机理单位(Neuropathogenesis Unit，NPU)，Edinburgh获得。对照和天然绵羊瘙痒病例的血获自NPU。来自野生BSE病例的组织获自MAFFCentral Veternary Laboratory(CVL)，Weybridge。人RNA购自Clontech，英国。对小鼠造血细胞反应的抗体购自BecktonDickinson，英国。联系德国的Davids Biotechnologie合成小鼠和人的类红细胞分化相关因子(EDRF)肽并生产抗这些肽的抗血清。人和小鼠全长的EDRF cDNA经由IMAGE协会从人类基因组图谱计划(英国)而免费获得。造血细胞cDNA的点印迹由来自Norman Iscove(加拿大)捐献。
实施例1：基因表达分析
将表征良好的瘙痒病Me7株脑内注射C57B1小鼠作为TSE感染的模型。年龄和性别匹配的小鼠用20μl的1∶10w/v的正常脑匀浆进行脑内注射。在注射后10、20、30、40、60、80、100和162天时(dpi)从对照和感染TSE的动物中收集脑和脾。162 dpi代表本模型疾病的末期阶段。将总RNA从“集合的”组织中分离并用作模板以合成用于随后的差异显示逆转录酶-聚合酶链式反应(DDRT-PCR)的cDNA亚群。DDRT-PCR是有力的分子工具，它可以通过创建RNA指纹而使得任何特定细胞类型或组织的基因表达可视化。在两或多个研究样品间差异表达的基因用本技术可很容易地鉴定和回收。DDRT-PCR分析基本如前文所述(Liang等人Science 257 967-971(1992))进行并具有一些更改(Miele等人Biotechniques 25(1)138-144(1998))。利用DDRT-PCR技术，比较TSE疾病发病机理的各个阶段的小鼠脾的基因表达与对照脾基因表达。如前文所述，回收和克隆代表差异表达的cDNA条带(Miele等人In“ExpressionGenetics”，eds McClelland & Pardee，pages 433-444，Natick：Eaton Publishing(1999)(a))；Miele等人Prep.Biochem.Biotech.29(3)245-255(1999)(b))。将克隆的cDNAs进行测序并在对公共核苷酸和蛋白质数据库的计算机辅助的同源性搜索后而进行鉴定。根据标准规程将克隆的cDNAs进行放射性标记以用作RNA和DNA杂交研究的探针(Sambrook等人“分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，NewYork：Cold Spring harbor Laboratory press(1989))。
为了克隆牛EDRF核酸序列的区域来用作牛序列的同源探针，聚合酶链反应(PCR)可用下面的简并寡核苷酸引物和牛基因组DNA作为模板而进行。引物基于小鼠和人的EDRF之间可读框的同源性而设计。
ED1F；5’-CA(AG)CA(AG)GT(AGCT)TT(CT)(AG)A(CT)GA(CT)CC-3’
ED3F；5’-GA(AG)GA(AG)GA(CT)ATGGT(AGCT)A(CT)(AGCT)GT-3’
ED2R；5’-AG(AG)AAIIIIC(GT)(AG)TA(CT)TT(AGCT)GC(AGCT)A-3’
第一轮PCR用标准试剂浓度和ED1F和ED2R引物进行，在94℃1分钟，50℃1分钟和72℃1分钟循环40次。将1μl PCR产物在与第一轮PCR相同的条件下用于嵌套式PCR，使用ED3F和ED2R引物。将预期大小的168 bp的DNA PCR产物凝胶纯化并克隆入T/A克隆载体pGEM-Teasy(Promega)。从几个克隆中分离的质粒DNA进行正向和反向进行了测序，并编写牛EDRF可读框的一致部分。
这个分析的来源材料是从对照和在疾病发病机理的各个限定阶段的感染瘙痒病(Me7株)的小鼠(脑内接种途径)中集合的脾组织。鉴定了一个在疾病发病机理的后面阶段TSE感染小鼠的脾中表现为下调的转录物(图1)。将代表该转录物的cDNA从DDRT-PCR凝胶中回收、纯化、PCR再扩增并克隆入pBluescript II SK II+克隆载体中(Stratagene)。
图1的结果表示来自DDRT-PCR凝胶的一组图，它比较了疾病发病机理的各个阶段年龄和性别匹配的对照和瘙痒病感染的小鼠(脑内途径)的脾中表达的基因的亚群。感染后1、10天数(dpi)；2、20dpi；3、30 dpi；4、40 dpi；5、60 dpi；6，80dpi；7、100 dpi；8、162 dpi(末期)。如前文所述将代表这个在瘙痒病感染的脾中下调的转录物回收并克隆入pBluescript KS II+(Stratagene)中(Miele等人BioTechniques 25(1)138-144(1998)；Miele等人In“Expression Genetics”，eds McClelland&Pardee，433-444页，Natick：Eaton Publishing(1999)(a))；Miele等人Prep.Biochem.Biotech.29(3)245-255(1999)(b))。
标准的DNA测序以及随后对公共核苷酸和蛋白质数据库进行的计算机辅助的同源性搜索揭示这个cDNA代表小鼠类红细胞分化相关因子mRNA(mEDRF，Genbank访问号AF055085，AF060220)的505个核苷酸的片段。该基因仅在公共核苷酸数据库有描述。然而，除了与mEDRF有100％的同源性匹配之外，该DDRT-PCR的cDNA片段在核酸水平也与更大的小鼠TEL癌基因(Genbank访问号NM007961.1)的一个小区域具有100％的匹配。实际上，全长的505核苷酸的mEDRF cDNA序列与小鼠TEL cDNA在反义的方向上100％匹配(参见图2)。
图2表示从图1所示的DDRT-PCR凝胶中分离的cDNA的序列特性。cDNA在核苷酸水平与小鼠(Mus Musculus)类红细胞分化相关因子mRNA(mEDRF)505个核苷酸的位置263到末端具有100％的匹配。然而，它也在反义方向上与小鼠ets变异基因6(TEL癌基因)的位置796到582具有100％的匹配。DDRT-PCR引物的位置加下划线表示。(b)对EDRF和TEL转录物两者的详细计算机辅助分析显示两个转录物都由相同的基因组座位编码，但互为反义方向。阴影线块代表(a)中显示的序列的示意性位置。Genbank访问号如下；小鼠EDRF(AF055085，AF060220)，小鼠TEL(NM007961.1)。代表全长人和小鼠的EDRF cDNA的克隆是从人类基因组图谱计划获得，Hinxton，Cambridge(IMAGE克隆分别鉴定了230221和466407)。
实施例2：牛EDRF序列的克隆
上面提到的DDRT-PCR EDRF的cDNA片段不代表整个EDRF cDNA序列。全长的小鼠和人EDRF cDNA克隆(分别为IMAGE IDs 230221和466407)免费从人类基因组图谱计划获得，Cambridge。将这些全长cDNAs双向测序，序列信息在图3中显示。为了获得牛EDRF RNA的同源探针以便将来用作研究表达的探针，在牛基因组DNA上进行了简并PCR(参见材料与方法)。将预期大小的PCR产物纯化并克隆入pGEMT-easy载体(Promega)中。这些克隆的核苷酸序列在图3中显示。序列分析证实该部分的DNA序列代表小鼠和人EDRF的牛同系物的可读框区域。
图3表示小鼠和人全长EDRF cDNAs和牛部分EDRF序列的核酸序列。全长的(a)小鼠和(b)人的EST cDNA克隆经由IMAGE协会从人类基因组图谱计划获得(分别为IMAGE IDs 466407和220221)。cDNA EST克隆以正向和方向进行测序。(c)牛EDRF的部分167 bp的序列在如实验背景中所陈述用简并寡核苷酸进行嵌套式PCR后合成。变异的核苷酸(保守的氨基酸替代)加下划线表示。在核苷酸水平上，小鼠和人EDRF cDNA序列在403个核苷酸上具有72.2％的一致性。牛的EDRF部分DNA序列与小鼠EDRF cDNA的位置153到318及人EDRF cDNA的位置171到337匹配。在核苷酸水平上，牛EDRF在167个核苷酸上与人的EDRF序列具有78.4的一致性，与小鼠的EDRF序列具有75.6％的一致性。
实施例3：生产EDRF蛋白质的抗血清
利用图3中所示的人、小鼠和部分牛EDRF cDNA序列推断这些序列编码的氨基酸序列(参见图4)。Davids Biotechnologie(德国)从小鼠和人的概念EDRF蛋白质合成了肽并从对鸡的免疫中生产了抗血清。
图4表示小鼠和人EDRF和部分牛EDRF蛋白质序列的氨基酸序列。这些序列是基于全长的小鼠和人EDRF cDNAs和部分牛可读框DNA序列的概念翻译(核苷酸序列在图3中显示)。a和b中加下划线的肽代表那些选择来与Davids Biotechnologies(德国)订立合同以合成并对鸡免疫来生产对人和小鼠EDRF蛋白质的抗体。在氨基酸水平，人和小鼠EDRF蛋白质具有63.7％的一致性，而牛部分EDRF蛋白质(55个氨基酸)与人的EDRF蛋白质具有72.7％的一致性且与小鼠的EDRF蛋白质具有67.3％的一致性。注意在图3中显示的变异的牛EDRF核苷酸导致保守的氨基酸替代，只有密码子6除外，它可能为异亮氨酸或苏氨酸。
实施例4：TEL和EDRF之间的关系
在计算机辅助的序列对比的基础上，EDRF显示为由TEL的反义DNA链编码。确定鉴定为在TSE感染的脾中(图1)差异表达的转录物是否代表EDRF或TEL是重要的。用全长mEDRF探针进行预Southern印迹分析显示EDRF和TEL可能由相同的基因组座位编码(图5)。然而，用单链核糖核酸探针(riboprobes)的RNA印迹分析揭示该大约500个核苷酸的EDRF转录物是在TSE感染的小鼠脾(Me7脾)中表现不足的RNA且TEL在这些条件下不可检测(EDRF正义核糖核酸探针-与TEL RNA反义)。这些实验正式证实了由DDRT-PCR鉴定为差异表达的转录物是mEDRF。
图5表示小鼠EDRF和TEL分配到相同的基因组座位上以及转录物方向的分析。(a)用多种限制性内切酶消化及用放射性标记的全长小鼠EDRF cDNA作为探针的小鼠基因组DNA的Southern印迹。该约505 bp的EDRF cDNA核酸序列与TEL具100％的一致性。对每个限制性内切酶消化的单链检测显示EDRF和TEL可能在相同的基因组座位上编码。小鼠EDRF cDNA包含EcoR I位点，于是如果EDRF和TEL在相同的基因组座位上编码就应该导致在用mEDRF全长cDNA作探针时检测到两个条带。(b)为了进一步从核酸序列分析的指示中研究关于在相同的基因组座位上编码的EDRF和TEL互为反义，将多种小鼠组织RNA的RNA印迹用体外转录的放射性标记的核糖核酸探针进行检测。EDRF RNA仅被EDRF反义核糖核酸探针(TEL正义核糖核酸探针)检测。这显示EDRF实际上是与TEL反义的转录物而不是TEL转录物的可变剪接物。TEL RNA在这些条件下用TEL反义核糖核酸探针不能检测到。因此EDRF和TEL在大小、方向和丰度上有显著差别。Taqman RT-PCR分析揭示与EDRF不同，TEL RNA在瘙痒病感染的小鼠脾中不差异表达。
实施例5：EDRF RNA表达的组织分布
对多种小鼠组织的RNA印迹分析证明EDRF仅在小鼠脾、骨髓和全血中表达，其中骨髓代表了具有最高EDRF转录物水平的组织(图6a)。注意EDRF表达在胸腺中检测不到，这显示EDRF表达与淋巴细胞没有关联。在成年小鼠中，除胸腺例外，这些组织是代表造血活性和红细胞发生的组织。在人组织中(RNA购自Clontech)，EDRF在骨髓但不在脾中表达(图6b)。在人类中，骨髓是具有造血活性的主要组织。EDRF也表达于人的全血中(图6c)。对人血的浅棕黄层(含有淋巴细胞)和非淋巴细胞组分的分析显示EDRF在血液中的表达是与红细胞而非淋巴细胞有关联。
图6表示小鼠和人EDRF mRNA表达的组织分布。对各种(a)小鼠和(b、c)人组织的RNA印迹分析用小鼠和人的放射性标记的cDNA探针进行。(a)小鼠EDRF仅表达于脾、骨髓和全血。(b、c)人EDRF仅表达于骨髓和全血。这些组织是造血组织(小鼠的脾、骨髓和血液和人的骨髓和血液)。EDRF表达与表达血红蛋白(仅表达于类红细胞中)的组织相关。18S rRNA的检测显示在所有泳道中加载了相等的RNA。(c)对人血的浅棕黄层和类红细胞组分的RNA印迹分析显示EDRF表达与富含类红细胞的组分有关联，如由后面的血红蛋白检测所示。
实施例6：啮齿动物实验TSE疾病组织中的EDRF表达
研究在TSE疾病发病机理(Me7瘙痒病品系)各个阶段的小鼠的脾中EDRF的表达。如在图7a所示，与模拟的感染对照相比，EDRF在TSE疾病末期阶段的小鼠脾中惊人地下调。该下调在脾的疾病发病机理过程的约三分之一中明显。血红蛋白β-链也在疾病末期阶段的小鼠脾中下调。进一步的研究证明EDRF下调在其他实验TSE疾病的疾病发病机理的末期阶段的鼠脾中也明显，如同血红蛋白β-链(图7b)。另外，这种作用在感染TSE的仓鼠模型中明显(LVG仓鼠，263K瘙痒病品系)。因此，EDRF和血红蛋白β-链在脾中的差异表达是这些不同的TSE模型的共同特征。因为EDRF也在小鼠骨髓和全血中表达，所以研究EDRF是否在感染TSE的小鼠的这些组织中差异表达。如图7c中所示，EDRF在分析的疾病发病机理的末期阶段的小鼠的骨髓和血液中也下调。然而，与从小鼠脾中获得的结果相反，血红蛋白β-链在瘙痒病感染的小鼠的骨髓或血液中不差异表达。
图7表示在对照和瘙痒病感染的脾、骨髓和全血中EDRF表达的RNA印迹分析。(a)从对照和疾病发病机理各个阶段的瘙痒病感染(Me7株)的小鼠(C57B1品系)脾中分离的RNA。与对照相比，EDRF在疾病发病机理末期阶段(162 dpi)的瘙痒病感染的小鼠脾中深度下调。该下调在较早阶段可检测。血红蛋白β-链RNA在瘙痒病感染的小鼠脾中也下调。(b)证实EDRF下调在其他的TSE疾病鼠模型中明显。脾来自各种对照和瘙痒病感染的近交小鼠品系(VM和SV)和仓鼠(LVG)。瘙痒病株为Me7、87V、79A和263K，且显示了这些模型的温育周期。EDRF和血红蛋白β-链两者在来自受多种瘙痒病株感染的多种啮齿动物基因型的脾中深度地都下调。这也证明EDRF下调的发现不是局限于小鼠的现象。(c)EDRF也在骨髓和全血中表达(参见图5)，因此研究了对照和感染瘙痒病的小鼠的骨髓和全血(骨髓；VM小鼠/87V瘙痒病株，全血；C57B1小鼠/Me7瘙痒病株)以确定是否EDRF在瘙痒病感染的小鼠的组织中也差异表达。EDRF在疾病发病机理末期阶段的瘙痒病感染的小鼠骨髓和全血中下调。与脾相反，血红蛋白β-链RNA在疾病末期阶段的瘙痒病感染的小鼠的骨髓和血液中以相似的水平表达。18S rRNA探查证实相似量的RNA加入到所有泳道上。在疾病发病机理的末期阶段，EDRF在脾(＞30倍)、骨髓(8倍)和全血(4倍)中下调。所有样品都获自经由脑内注射感染的小鼠。
这些结果首次证明了在感染和未感染的动物造血组织之间的分子差异。
实施例7：TSE疾病的天然野生病例组织中的EDRF表达
进一步检查观察到TSE感染在造血组织中对EDRF表达的作用是否为实验鼠模型所特有，或与其他天然TSE疾病所共有。全血获自表现天然瘙痒病早期临床病征的绵羊(在死于疾病前1.5个月)。对照材料是从年龄、品种和性别匹配的相同PrP基因型的绵羊中取的(众所周知PrP基因型是影响疾病易感性的因素)。用放射性标记的全长人EDRF cDNA对从绵羊全血中分离的RNA进行的RNA印迹分析检测到大约3.5Kb转录物，该转录物在天然野生病例的血液中表现不足(图8a)。用部分牛EDRF cDNA对该RNA印迹的再检测杂交相同的转录物。因此，尽管检测到的绵羊转录物显著大于小鼠或人EDRF，该转录物实际上代表绵羊EDRF RNA。从健康牲畜和怀疑遭受BSE侵染的牲畜(随后病理证实它们患有BSE)中也获得了脾和胸骨骨髓。对照和BSE牲畜品种匹配、为非怀孕且约相似年龄的雌性(＞3.5岁)。利用部分牛EDRF cDNA的RNA印迹分析已证明牛EDRF转录物与小鼠和人的EDRF的大小大约相同(约500个核苷酸)。已经发现，牲畜类似于人，在脾中不表达EDRF。然而，对胸骨骨髓的分析揭示牛EDRF在表现BSE病征的动物中惊人地下调(图8a)，如同实验感染TSE物质的小鼠骨髓。
图8表示在TSE疾病天然野生病例的血液和骨髓中EDRF表达的RNA印迹分析。(a)绵羊的年龄、品种和性别匹配且具有相同的PrP基因型(ARQ杂合体)。对照和瘙痒病绵羊同时取血样。瘙痒病绵羊血液是从表现瘙痒病早期临床病征的绵羊在其死于疾病之前大约一个半月时获得。对人、牲畜和绵羊基因组DNA的Southern印迹分析显示人EDRF cDNA是牲畜和绵羊序列的适当探针(未显示)。因此用放射性标记的人和牛EDRF cDNA检测RNA印迹。人血液RNA充当实验的正对照。磷光成像(Phosphorimager)分析揭示推定的绵羊EDRFRNA在天然瘙痒病临床病征早期阶段(在该阶段动物相对地健康)的绵羊血液中下调约50％。利用牛部分EDRF cDNA作为探针与该相同转录物进行杂交，进一步显示该3.5Kb的转录物是绵羊EDRF真正的同系物。(b)在以BSE的第一明显病征精选病理学证实为BSE侵袭的牲畜和健康对照的胸骨骨髓中EDRF表达。牲畜品种匹配、为非怀孕且约相似年龄的雌性(＞3.5岁)。RNA印迹用放射性标记的部分牛EDRF cDNA进行检测。牛EDRF RNA与小鼠和人的EDRF RNA的大小大约相同且在遭受天然BSE侵袭的牲畜骨髓中惊人地下调。这些实验证明作为朊病毒疾病指示剂的EDRF可用于天然野生的朊病毒疾病病例，而且EDRF的差异表达不是实验诱导的啮齿动物朊病毒疾病所特有的现象。
这些实验清楚地显示EDRF差异表达以及表达EDRF的造血细胞类型功能异常一些可能的方面是实验和天然野生TSE疾病病例共有的特征。
实施例8：表达EDRF的造血细胞类型的确定
很清楚EDRF是TSE感染新的有用的死前标记和指示剂。观察到的EDRF差异表达可能代表该基因表达的作用，或者它显示与EDRF表达相关联的造血细胞类型的进行性丧失/耗尽。作为解决这个问题的第一个步骤，进一步确定表达EDRF的造血细胞类型。获得一组对不同的小鼠造血细胞谱系反应的抗体(Pharmingen/BecktonDickinson)。将这些抗体用于耗尽全骨髓细胞悬浮液中的各种造血细胞谱系。然后从剩余的细胞中分离RNA并通过RNA印迹分析估计EDRF的表达。在任何特别组分中EDRF表达的丧失将显示已经去除的细胞是那些表达EDRF的细胞。如可图9所见，EDRF表达在已经耗尽了TER-119阳性细胞的骨髓中惊人地减少了，如同血红蛋白β-链的表达。除早期BFU-E和CFU-E祖先例外，TER-119抗体与造血细胞在类红细胞发育的所有阶段都进行反应。
图9表示表达EDRF的小鼠造血细胞谱系的确定。EDRF仅在小鼠脾、骨髓和全血中表达(参见图5)。在小鼠或人的胸腺中可检测的信号的缺乏显示EDRF表达与T-或B-细胞无关联，在人血液的浅棕黄层组分中可检测信号的缺乏也如此(参见图5)。为了确定哪个造血细胞谱系表达EDRF，将小鼠骨髓细胞悬浮液富集以得到非定型的干细胞或者用一组抗体(购自Pharmingen)和CELLection生物素结合动珠(biotin binding dynabeads)(购自Dynal)将特定细胞群体耗尽。随后分离RNA并用放射性标记的小鼠EDRF cDNA探针进行RNA印迹分析。EDRF信号仅在耗尽了类红细胞的细胞悬浮液的RNA中大大减少。如所预期的，血红蛋白β-链RNA在这个组分中也减少了。TER-119抗体不与具有BFU或CFU活性(BFUe/CFUe)的已定型的类红细胞反应。来自富集的非定型造血干细胞组分的RNA中可检测的EDRF表达可能代表了BFUe和CFUe类红细胞中的EDRF表达，但目前不能排除EDRF在非定型干细胞中表达的可能。类似地，EDRF表达可以在TER-119阳性选择的造血细胞中检测到。然而，该表达也可以较低水平在其他谱系中检测到(CD3+、CD11b+、CD45R+、B220+、Ly-6G+细胞)。因此EDRF表达主要与类红细胞谱系的造血细胞有关联，但也在其他，非-B/非-T细胞的造血细胞中表达。然而，在这个组分中血红蛋白的表达显示类红细胞是与其他谱系共纯化的。EDRF可能仅在类红细胞谱系中表达。对EDRF表达的细胞谱系进一步的表征在图10中给出。仍然需要确定在瘙痒病感染的脾、骨髓和血液中发现的EDRF表达的下调是否代表特定的基因作用，或者由于脾中血红蛋白的下调，该下调是否更可能由类红细胞的耗尽所导致。
这些结果显示EDRF表达主要与类红细胞相关联，且在同样的耗尽了TER-119细胞的组分中血红蛋白β-链表达的减少证实了这一点。
为了确证，进行了阳性选择实验，EDRF表达(和血红蛋白)清楚地与TER-119富集的组分有关联。BFU-E和CFU-E细胞残存在也含有多能，非定型的造血干细胞的细胞组分中。在富集的TER-119阴性和BFU-E/CFU-E阴性细胞中明显的EDRF表达清楚地是归因于污染，因为在这些制剂中血红蛋白也可检测。EDRF清楚地也存在于从BFU-E/CFU-E和干细胞混合群体中分离的RNA中。然而，尚不清楚这些祖细胞类型中哪些表达EDRF。为了阐明这一点，获得了含有扩增的cDNA的斑点印迹，其中的cDNA是从确定发育阶段的造血细胞中分离的RNA合成而来(由Norman Iscove捐献，加拿大)。
图10表示表达EDRF的造血细胞的进一步表征。缩写如下：E，血红蛋白阳性的晚幼红细胞和网织红细胞；Meg，巨核细胞；Mac，巨噬细胞；Neut，嗜中性粒细胞；Mast，肥大细胞；BFU-E，含有红细胞的前体生产集落；CFU-E，在原红细胞/CFU-E阶段的血红蛋白阴性的细胞。例如，E/Meg/Mac指能发育到类红细胞、巨核细胞或巨噬细胞谱系的多能祖细胞。类似的，Mac祖先指定型为向巨噬细胞谱系发育的单能细胞。在(i)能发育为类红细胞或巨核细胞谱系的双能细胞，(ii)BFU-E细胞，(iii)CFU-E细胞和(iv)血红蛋白阳性的晚幼红细胞和网织红细胞中检测到EDRF表达。在血红蛋白阴性的CFU-E类红细胞中观察到最高的EDRF表达。该系统中的T-细胞获自用伴刀豆凝集素A处理过的脾细胞培养物。这些富集的T-细胞含有污染的血红蛋白阳性的类红细胞。T-细胞组分中明显的EDRF表达(坐标网参数C3)可能代表污染的表达EDRF的类红细胞的存在。在人“浅棕黄层”EDRF表达的缺乏(图6)证实了这一点。因此EDRF表达于所有定型发育为类红细胞谱系并在类红细胞发育的所有阶段(包括TER-119+、BFU-E和CFU-E细胞)的造血细胞中以及能够沿巨核细胞/血小板谱系分化的细胞中。
如图10所示，EDRF表达仅与那些定型为类红细胞谱系的细胞有关联，包括BFU-E和CFU-E细胞。造血干细胞不表达EDRF。EDRF表达在CFU-E类红细胞中最高。在本系统中，EDRF以低水平可检测的最早阶段是能够发展到类红细胞或巨核细胞谱系的双能细胞。EDRF清楚地与类红细胞谱系的造血细胞有关联。
图11表示EDRF表达向定型于类红细胞谱系的造血细胞的分配。(a)在耗尽了特定细胞谱系的骨髓悬浮液中EDRF RNA表达。泳道A；未处理的全骨髓。泳道B到G分别代表耗尽了CD3e+、CD11b+、CD45R/B220+、Ly-6G+、TER-119+和非谱系(干)细胞的骨髓悬浮液。用一组购自BD Pharmingen的单独的缀合生物素的抗体和链霉抗生物素包被的磁珠(Dynal)根据生产商的使用说明耗尽特定的造血细胞谱系。抗体对下列造血细胞谱系反应：CD3e(胸腺细胞、T-淋巴细胞)；CD11b(粒细胞、单核细胞/巨噬细胞、树突细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)和B-1细胞)；CD45R/B220(来自前-B到成熟和活化的B-细胞的B-谱系细胞)；Ly-6G(单核细胞、嗜中性粒细胞、分化和成熟的粒细胞)；TER-119(从早期成红血细胞到成熟红细胞阶段的所有限定型为类红细胞谱系的细胞)。(b)和(c)示意性地代表造血细胞的层级。缩写：Meg，巨核细胞；E，类红细胞；Mast，肥大细胞；Mac，巨噬细胞；Neut，嗜中性粒细胞；B，B-细胞；T，T-细胞；p，祖先；BFU-E/CFU-E，类红细胞祖先，血浆和集落生成单位。(b)EDRF表达限制于类红细胞发育所有阶段的细胞。(c)在造血细胞中PrP RNA的表达。EDRF和PrP转录物的共表达发生于双能的E/Meg细胞(以星号显示)。表达水平由阴影程度显示，更深的阴影显示更高的表达水平。从带多聚腺苷酸的mRNA合成的cDNA的点印迹由N.Iscove(Universaity of Toronto，加拿大)捐献，其中的mRNA是从代表造血细胞层级的16个阶段的单个细胞中纯化。
结果概述
本结果鉴定了一个基因，它编码未知功能的蛋白质，其在患TSE疾病的动物的造血细胞中差异表达。该基因的这种表达特征高度特异性，若非排除性，其也主要表达于类红细胞谱系的造血细胞中。这因此证明新的，非基于PrPSc的TSE感染的分子标记/特点，其在造血组织中可很容易地检测。以前未报告过这种情况。

Claims (14)

1.在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，包含测定从动物中获得的样品以确定样品中的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的相对数目。
2.如权利要求1的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中的传染性海绵状脑病(TSE)是瘙痒病、牛海绵状脑病(BSE)、慢性萎缩疾病(CWD)、克-雅病(CJD)或新变体(nv)CJD。
3.如权利要求1或2的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中样品是全部的或分级分离的血液、造血组织如骨髓，或来自脾。
4.如权利要求1到3中任何一项的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中测定的类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞包括多能干细胞、髓样干细胞、CFU-GEMM细胞(集落生成单位粒细胞/红细胞/单核细胞/巨核细胞)、BFU-E细胞(血浆生成单位类红细胞)、CFU-E细胞(集落生成单位类红细胞)、原红细胞、网织红细胞、红细胞、巨核细胞或血小板。
5.如任何前述权利要求之一的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的数目以参考该细胞的表达产物来估计。
6.如权利要求5的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中测定的表达产物为类红细胞分化相关因子(EDRF)。
7.如权利要求1到4中任何一项的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中要测定的造血细胞表征为与抗-TER-119、抗-血型糖蛋白A、抗-CD-71、抗-EDRF或抗血红蛋白抗体反应。
8.如权利要求7的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中要测定的细胞包括原红细胞、嗜碱性成红细胞、多染性成红细胞、正染性成红细胞、网织红细胞(前红细胞)。
9.如权利要求1到4中任何一项的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中要测定的造血细胞表征为与抗-CD-61抗体反应。
10.如权利要求9的在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，其中要测定的细胞为E/Meg细胞、原巨核细胞、巨核细胞或血小板细胞。
11.在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的方法，该方法包含测定从动物中获得的样品以确定类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的表达产物的相对量。
12.在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的试剂盒，其中该试剂盒包含对类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的抗体。
13.在动物中诊断传染性海绵状脑病(TSE)是否存在的试剂盒，其中该试剂盒包含对类红细胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的表达产物的抗体。
14.如权利要求13的试剂盒，其中抗体结合的类红胞、巨核细胞或血小板谱系的造血细胞的表达产物为EDRF。
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