CN1471539A - 含有二硫键环肽的疫苗免疫原及其在治疗变态反应中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新的化学方法，其可以通过硫醚键将二硫键环肽共价偶联到免疫原载体分子上从而形成疫苗免疫原。特别地，该方法涉及硫醇盐化载体与含二硫键的环肽反应，该环肽通常通过能够与载体形成硫醚键的活性基团连接体连接到载体上。本发明还涉及该方法中的活性肽中间体、制备的药物、含有该药物的药物组合物以及该药物组合物在医学中的应用。本发明方法特别适用于制备包括二硫键环肽的疫苗用高纯免疫原。本发明也提供了基于人IgE序列衍生的多肽的新免疫原，其适用于变态反应的免疫治疗。因此，本发明也涉及将IgE二硫键环肽偶联到载体上的方法、该方法制备的免疫原、含有载体和该免疫原的疫苗和药物组合物，及其在治疗变态反应中的应用。

Description

含有二硫键环肽的疫苗免疫原及其在治疗变态反应中的应用
本发明涉及一种新的化学方法，其可以通过硫醚键将二硫键环肽共价偶联到免疫原载体分子上，从而形成疫苗免疫原。特别地，该新的化学方法涉及硫醇盐化载体与含二硫键的环肽反应，而该环肽(这里指二硫键环肽)通常是通过能够与载体形成硫醚键的活性基团连接体连接到载体上。本发明还涉及该方法中的活性肽中间体、用该方法制备的药物、含有该药物的药物组合物以及该药物组合物在医学中的应用。本发明的方法特别适用于制备包括二硫键环肽的疫苗用高纯免疫原。本发明也提供了基于人IgE序列衍生的多肽的新的免疫原，其适用于变态反应的免疫治疗。因此，本发明也涉及将IgE二硫键环肽偶联到载体上的方法、该方法制备的免疫原、含有载体和该免疫原的疫苗和药物组合物，及其在治疗变态反应中的应用。
包含短肽的免疫原在疫苗预防或治疗领域越来越普遍。在许多疾病状态，设计包含短肽而非大型蛋白质的疫苗经常是可能的，而且是值得期待的。能作为免疫原的肽可以是全长天然蛋白质例如人的肽类激素，或者可以是来自特定病原体的较大抗原的片断，或者来自大的自身蛋白的片段。例如，IgE的短肽可用于预防变态反应，然而用IgE本身作为免疫原可能导致过敏性休克。
以前认为，与利用肽进行疫苗接种相关的问题在于肽本身是弱免疫原这个事实。通常，所选择的肽的序列要包括B细胞抗原决定簇以便提供靶来产生抗肽的抗体反应，但是肽有限的大小使其几乎不能包括足够的T细胞抗原决定簇来提供必要的细胞辅助，以便在初次及再次使用疫苗后诱导强的免疫反应。
解决这个免疫原性问题的策略包括将肽连接到大的高免疫原性蛋白载体上。蛋白载体含有大量能够装载到MHC分子中的肽类T细胞抗原决定簇，从而提供“旁观者”(bystander)T细胞辅助，和/或可选择地在疫苗配方中使用强佐剂。目前通常用于生产肽类抗原的这些高免疫原性载体的例子包括白喉毒素和破伤风毒素(分别称为DT和TT)、钥孔虫戚血兰素(KLH)和从结核菌素(PPD)衍生的纯蛋白。
用于特定疫苗免疫原的肽经常这样选择，以使它们能够与全长天然蛋白中的肽位点产生抗体反应。因此，为产生能够结合这些选择位点的抗体，免疫原中的肽必须基本上呈现与其在全长天然蛋白侧翼区存在时相同的形态。然而，仅仅通过常规化学方法将线性的肽序列偶联到载体蛋白质上很少能达到这个目的。这是因为这样的免疫原呈现为有太多构象自由的线性肽，所以该肽可能采用一种松散的结构，其既不被免疫系统很好地识别，也可能与该肽在全长天然蛋白侧翼区中采用的构象完全不同。
为克服构象自由的问题，以限制性方式设计肽是公知的，即通过两个远距离氨基酸残基的化学相互作用，使肽保持一种弯曲的结构，其类似于该肽在全长天然蛋白内部所保持的弯曲结构(US 5939383；Hruby等，1990，Biochem J.，268，249-262)。为此，通常在肽序列中加入两个半胱氨酸残基，对该肽的稀溶液经温和氧化后在两个半胱氨酸残基之间形成预期的分子内二硫键。
如此形成的环肽通常可通过几种化学方法之一偶联到蛋白质载体上形成免疫原。已知的化学方法的例子包括用氨基活化试剂如戊二醛或甲醛在肽和载体之间形成氨基偶联；或者用碳化二亚胺缩合羧基与氨基，或者可选择地通过氧化反应将N-末端α-羟基转变为醛基然后将此基团连接到氨基或氧代氨基部分。然而，这些化学方法都有缺点，包括需要苛刻的氧化反应条件，工业水平上的不可控制性，多聚体的形成，或者不适合包含特殊内部氨基酸的肽(尤其是：赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、色氨酸、酪氨酸或丝氨酸)，这些氨基酸也能以不合适的方式干扰化学反应。
因此，通常用硫醚键将肽偶联到蛋白质载体上。获得这种偶联物的最常用的方法是在肽上添加末端巯基部分，大多数时候通常添加半胱氨酸，然后将该活化的巯基与马来酰亚胺衍生的蛋白质载体反应(Friede等，1994，Vaccine，12，791-797)，其示意概略见图1。
然而，在肽含有内部二硫键时，这种通常是优选的肽化学方法可能存在问题，因为内部二硫键可能重排，或者两个相邻肽之间的二硫键发生外部重排。在某些情况下，第三个半胱氨酸的存在会引起不希望的对二硫键的干扰，可能发生硫-二硫键交换，所以最后形成的中间体环肽产物是三种可能的二硫键环肽的混合物(重排中间体见图2)，或者可能包含额外的肽二聚体或多聚体。
当把这些肽中间体偶联到马来酰二亚胺活化的载体蛋白质上时，每种重排的中间体都同等地与活性载体蛋白质反应，并等量地都偶联到载体上。结果，预期产物的纯度降低了，并且使用这种免疫原混合物可能引起的免疫反应不能或只是与该肽模拟的完整天然蛋白上的抗原决定簇发生微弱的交叉反应。为解决这些问题，有些作者使用硫醚键代替二硫键稳定环肽。例如，在Ivanov等，1995，Biocon jugateChemistry，6，269-277中，用三官能化的溴乙酰衍生氨基酸代替半胱氨酸，以允许通过不可逆的硫醚键进行环化。然而，在这种硫醚环肽中，所得的肽在功能上不同于最初的二硫键环肽，而且可能具有不同的、与二硫键环肽不相似的结构。因此，形成的抗硫醚环肽抗体在识别原始肽时可能不如抗二硫键环肽抗体有效。
本发明通过提供一种化学方法，克服了在二硫键环肽和载体之间形成硫醚键的问题，该方法不在环肽上使用包含巯基的末端基团，而是在肽上使用另一活性基团，其可与硫醇盐化载体蛋白质反应形成硫醚键。
因此，在本发明中提供了一种包括将二硫键环肽偶联到免疫原性载体上而制备疫苗免疫原的方法，包括(a)在二硫键环肽上添加一部分，其含有能与带巯基的载体形成硫醚键的活性基团，和(b)将如此形成的活性环肽与带巯基的免疫原性载体反应。
本发明的方法克服了内部和外部二硫键重排的问题，而且还提供了其中的二硫键环肽处于期望构象的偶联产物。在本发明更优选的方法中，合成了包含两个可形成二硫键的半胱氨酸残基的肽，随后加入活性基团。然后将获得的活性肽与带巯基的载体反应。
本发明适用的活性基团包括任何能与硫醇盐化载体形成硫醚键的基团。如本领域技术人员所显而易见的，优选的活性基团可选自活性二亚胺，尤其是马来酰亚胺、卤代烷基如碘代烷基或溴代烷基。更优选的溴代烷基是溴乙酰基。使用马来酰亚胺将线性肽连接到硫醇盐多聚体上描述于Van Dijk-Wolthius等，1999，BioconjugateChemistry，10，687-692。使用溴乙酰基将肽连接到载体上描述于Ivanov等，1995，Bioconjugate Chemistry，6，269-277和US5444150。蛋白质偶联到硫醇盐固相载体可用于诊断分析，描述于EP 0396 116 A。
本发明特别优选的一个方面是该方法使用马来酰亚胺为活性基团。因此，一种将二硫键环肽偶联到载体上的优选方法包括，(a)在二硫键环肽上添加包含马来酰亚胺基团的部分，和(b)将如此形成的活性环肽与带巯基的载体反应。本方法的产品(一种适用于疫苗的偶联物)为本发明的一个方面，其具有结构式(I)的结构：
Figure A0181777700071
其中，载体是一种载体分子，X是连接体或键，Y是连接体或键，以及P是二硫键环肽。当X是键时，应当明白载体直接被连接到硫原子S。类似地，当Y是键时，应当明白二硫键环肽直接被连接到氮原子N。“连接体”指合适的连接基团。当X是连接基团时，一个例子是基团-NHCO(CH2)2-。当Y是连接基团时，一个例子是-(CH2)3CONH-。本领域技术人员也清楚，结构式(I)包含硫原子(S)连到酰亚胺环两个相邻的非羰基碳原子之一上的偶联物，所以偶联物可以含有如下的结构：或
本发明方法的中间体成为发明的一个方面，其是一种带活性基团的二硫键环肽，能与硫醇盐载体形成硫醚键。优选的所述中间体包括连接活性酰亚胺基团，尤其是马来酰亚胺基团的二硫键环肽。由于任何发生在二硫键和硫醚活性基团内部或外部的重排都是不可逆的，结果这些重排的中间体都不能与硫醇盐载体蛋白质反应，基于这样的事实，最后的偶联产物是高纯的。只有那些在期望位置具有二硫键(即在肽所含的半胱氨酸之间)的活性肽中间体以自由活性基团参与同硫醇盐载体的偶联反应，因此形成包含期望构象的环肽的极高纯度偶联物。
优选的马来酰亚胺衍生试剂是γ-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS，分子式：C12H12N2O6.Fujiwara，K，等，J.Immunol.Meth.，45，195-203(1981)，Tanimori，H.等，J.Pharmacobiodyn.，4，812-819(1981)；H.Tanimori等，J.Immunol.Methods 62，123(1983)；M.D.Partis等，J.Prot.Chem.2，263(1983)；L.Moroder等，Biopolymers 22，481(1983)；S.Hashida，等，J.Appl.Biochem.6，56(1984)；S.Inoue等，Anal.Lett.17，229(1984)；E.Wunsch等，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 366，53(1985))，其可从Sigma或Pierce公司购买。应该承认有许多马来酰亚胺衍生试剂并可以使用，在环肽上加入马来酰亚胺基团可以在肽合成过程中用与有机合成相容的试剂进行，或者在肽合成后使用通常用于以马来酰亚胺基团来衍生肽和蛋白质的试剂进行。
本发明的方法、中间体和产品优选用于制备疫苗用的免疫原。用于偶联反应的肽可选自抗预期产生的免疫反应的任何抗原。肽可来源于病原体如病毒，细菌，寄生虫如蠕虫等。同样，肽可选自自身蛋白，例如在治疗癌或变态反应的疫苗中。
在变态反应中，其症状通常与过敏性介体如组胺从免疫细胞释放到周围组织和血管结构中引起的过敏有关。组胺正常情况下贮存在肥大细胞和嗜碱细胞中，直到与过敏原特异的IgE相互作用才触发其释放。IgE在变态反应如哮喘、食物过敏、过敏性皮炎、I型超敏反应和鼻炎中的媒介作用是公知的。当遭遇抗原如花粉或灰尘微粒过敏原时，B细胞开始合成过敏原特异的IgE。然后过敏原特异的IgE结合到嗜碱细胞和肥大细胞上的FcεRI受体(高亲和的IgE受体)。随后同过敏原的任何遭遇都会通过交联邻近的IgE/FcεRI复合物触发组胺从肥大细胞或嗜碱细胞中释放(Sutton和Gould，Nature，1993，366：421-428；EP 0477231B1)。
与所有的免疫球蛋白相似，IgE包括两条重链和两条轻链。ε重链包含五个结构域：一个可变结构域(VH)和四个恒定结构域(Cε1到Cε4)。IgE分子量约190,000Da，重链大约550个氨基酸长度。IgE的结构由Padlan和Davis(Mol.Immunol.，23，1063-75，1986)以及Helm等论述(2个IgE模型结构于2/10/90存放于PDB(ProteinData Bank，Research Collabarotory for StructuralBioinformatics；http：\\pdb-browers.ebi.ac.uk))。每个IgE结构域由七条标记为a到f的反平行的伸展(β-)多肽片断形成的扁平管构成，这七条多肽片断标记为a到f，组成两条β-折叠。四条β-链(a，b，d和e)形成一个折叠片，反向堆叠于另三条链(c，f和g)形成的第二个折叠片(见图8)。每个β-折叠的形状由每个折叠片中邻近的反平行链上的侧链氨基酸残基侧向堆积来维系(进一步被这些链间的主链氢键所稳定)。由残基形成的非伸展(非β-)构象的环在一个折叠片中或在反向的折叠片之间连接反平行β-链。从a链到b链的连接标记为A-B环，以此类推。A-B和d-e环属于拓扑四链折叠，f-g环属于三链折叠。反向折叠对之间的界面提供了球形结构域的疏水内部环境。这种不接触水相的主体疏水核心是由反向β-折叠相对的侧链残基紧密堆积引起的。
过去已经探索过一些方案来干扰IgE介导的组胺释放机制的被动或主动的免疫治疗方法。这些方法包括被动施用抗体或者被动施用衍生于IgE的肽以与受体进行竞争性结合，从而干扰IgE或过敏原/IgE复合物结合FcεRI或FcεRII受体(低亲和的IgE受体)。此外，一些作者描述了在主动免疫中使用衍生于IgE的特殊肽来刺激抑制组胺释放的免疫反应。
因此，要具有效果，肽疫苗需要能够非常高效地模拟IgE的特殊位点。因此，本发明优选的免疫原是基于IgE衍生的肽，并能触发抑制组胺从嗜碱细胞释放的免疫反应。
已经进行了许多工作来鉴别对抗IgE介导的变态反应有一定有益效果的特异性抗IgE抗体(WO 90/15878，WO 89/04834，WO 93/05810)。也已努力鉴别了被这些抗体识别的抗原决定簇，建立这样的抗原决定簇的肽模拟物(mimotope)并用其作为免疫原制备抗IgE抗体。
WO 97/31948描述了这种类型工作的一个例子，并进一步描述了来自cε3和cε4结构域的IgE肽，该结构域连接到载体分子上用于主动接种目的。这些免疫原可用于接种研究，而且据说能产生随后抑制体内组胺释放的抗体。在这项工作中，描述了一种单克隆抗体(BSW17)，据说能结合包含在cε3结构域内的IgE肽，而这些肽用于主动接种目的。
EP 0 477 231 B1描述了衍生自IgE的cε4结构域的免疫原(497-506位残基，也通称为Stanworth十肽)，其可以偶联到用于主动接种免疫预防的钥孔虫戚血兰素(KLH)上。WO 96/14333是EP 0 477231 B1所描述工作的延续。
其他探讨基于对衍生自cε3或cε4的肽的鉴别，它们本身能与IgE竞争结合到嗜碱细胞或肥大细胞的高亲和或低亲和受体上(WO93/04173，WO 98/24808，EP 0 303 625 B1，EP 0 341 290)。
因此，在本发明一个优选的方面，方法、肽中间体、免疫原和疫苗包含选自人IgE的肽。更优选地，本发明所用的二硫键环肽选自表1列举的肽组合。表1中的肽反映了IgE分子期望产生免疫反应的特殊区域。因此，这些肽构成设计二硫键环肽的起始点，相应地，环肽或者不含半胱氨酸残基，或者含单一的半胱氨酸残基，或者含无法形成二硫键的两个半胱氨酸。本发明的方法或免疫原中适用的肽可以通过向以下的肽中添加至少一个半胱氨酸残基来设计。
表1，适于环化并适用于本发明的方法中的IgE肽
 肽序列 SEQ ID NO.
 EDGQVMDVDSTTQEGELSQKHWLSDRTGHTFEDSTKKGGGHFPPTPGTINIFTPPTCLEDGQVMDVDLLLLDVDMVQGDELCWLEDGQVMDVDLCQVMDVDLLEDGQVMDVDCSTTQEGELATTQEGECSQKHWLSDRTTYQGHTFEDSTKKCADSNPRGVGGHFPPCCVADPETQMTPSSEMFCCVADPETQMTPSSEMFCCVTDVQTTNMDVPAGQTCCVTDIPPPDYEQSLGCCESDIPLNELHALADPCCKSDIPSPVTQFNTMKCCQSDVPHQPGINDLHVCCMSDTPDISRLPVPDSCCMSDSPADPNRGLPIWCCLSDDAPTLPVRRCCITDVPQGVMYKGSPDECKVDGQLSDSPLLRNN 1234567891011121314151617181920212223242526272829
CCMTDDPMDPNSTWAIRCCMTDDPMYTNSTWAIRCCVDDTPNSGLAMRVSKCCEVDDFPTHHPGWTLRSCNLNHQSCDIPPVKQICCMADQELDLGHNAANACCVMDLELASGFCCVMDIEVRGSACCQRDVELVFGSCCRADFEVGNGGCCVSDEPAGVRDGAGWQEKDKELRGAMTAGQLSDLPVAGGQVVDRELKKAGEQAMDMELRRGRNQIMDLEIQIDRQITDTLLREQQISDVPRVCQAMDAEILNQVGQMMDTELLNRSMEGQVRDIQVYQQRDLELAESMGQKVDRELVSMGQEVDRELVAENDQMVDWEIGGWQESDIPGRGGWQEKDKELRHCCRIDREVSGADCDWINPPDPPHFWKDTDALDERAWRARARASGKPVNHSTRKEEKQRNGTLGTRDWIEGEPHLPRALMRSTTKTSGPRAPEWPGSRDKRTEQKDELSRPSPFDLFHKSPTITCWLHNEVQLPDARHSTTQPRKTCRASGKPVNHSTRKEEKQRNGLLGKPVNHSTGGCGKPVNHSTRKEEKQRNGCCGKPVNHSTRKEEKQRNGLLRASGKPVNHSTGGCCGTRDWIEGLLCGTRDWIEGETLGTRDWIEGETGCCHPHLPRALMLLCGTHPHLPRALMTHPHLPRALMRSC 303132333435363738394041424344454647484950515253545556575859606162636465666768697071727374757677
 GPHLPRALMRSSSCAPEWPGSRDKRTCAPEWPGSRDKRTLAGGCCGGATPEWPGSRDKRTLCTRKDRSGPWEPACGAEWEQKDELAEWEQKDEFICGEQKDEFICCAEGEQKDELLFIRKS.PSKGTVNLHNEVQLPDARHSTTQPRKTKGSSVNPGKCPEWPGCRDKRTGTPEWPGCRDKRCGDPEWPGSRDKKGSCDWPGSRDKRKGSCDATPEWPGSRDKRTLKGSC  787980818283848586878889909192939495
相应于表1所列举的肽的例子，对它们进行修饰以适用于本发明的经修饰的特异性二硫键环肽列于表2。
          表2，修饰后的环肽
 肽序列 SEQ ID NO.
 CLEDGQVMDVDLCCFINKQMADLELCPRECFMNKQLADLELCPRECLEDGQVMDVDLCPREAAEGDKCLEDGQVMDVDLCGGSSGGPCLEDGQVMDVDCPREAAEGDKKCREVWLGESETIMDCEACREVWLGESETIMDCDSCREVWLGESETVMDCGNCQDLMLREDAGCWSKMDCEEPMCSPVLLQQLKLCFINKQMADLELCCFMNKQLADLELCKCREVWLGESETIMDCHCQQVFFPQDYLWCQRGSCREVWLGGSEMIMDCEECNQNLSGSLRHVDLNCDCEEPMCSPVLLQKLKPSCREVWLGGSEMIMDCERCDQQLPRDSYTFCMMSSCPAFPREGDLCAPPTV 96979899100101102103104105106107108109110111112113114115116
 FCPEPICSPPLSRMTLSVCDECVSRELALWCLEPECAPGLLVCDECVSRELALDCLSKGQMADLCSCQGREVRRECWWCREVWLGESETIMDCEACREVWLGESETIMDCDGCAEPKCWQALHQKLKPECRGPNMQMQDHCPTTDQCNAVLEGLQMVDHCWNHCKNEFKKGQWTYSCSDQCRQFVMNQSEKEFGQCNCFMNKQLADLELCPRESCAYTAQRQCSDVPNPGGCFMNKQMADLELCPRTAAACFMNKQMADLELCPRVAAGCFINKQLADLELCPRVAAGCFMNKQLADWELCPRAAAECFMNKQLADSELCPRVAAGCFMNKQLADPELCPREAEGCFMNKQLVDLELCPRGAAGCFMNKQLADLELCPREAAGCFMNKQQADLELCPRGAAGCFINKQMADLELCPREAACLEDGQVMDVDCPREAAEGDCLEDGQVMDVDLCPREAAEGDQCNAVLEGLQMVDHCWNECLKIEQQCADIVEIPRSCAYAQRQCSDVPNPGECRGPNMQMQDHCPTTDECLVYGQMADCAAGGWPQCRQFVMNQSEKEFGQCHCKNEFKKGQWTYSCSDCAPGMGCWESVKSCREVWLGGSEMIMDCESCPAFPREGDLCAPPTVFCPEPICSPPLSRMTLSECNQNLSGSLRHVDLNCRCDQQLPRDSYTFCMMSHCQQVFFPQDYLWCQRGDCEEPMCSPVLLQKLKPNCQDQMLREDAGCWSKIHCEEPEYSPATRVFCGRACFSRNGQVTDVPHSCYKCPTYPKPNDRCLWPVPYCPKYPLEGDCLLDNDYRCEEWLCIPPAPAFAPP 117118119120121122123124125126127128129130131132133134135136137138139140141142143144145146147148149150151152153154155156157158159160161162163164
 TCGQSELRCASLETHHVNCNDNPMLDCMPAWSSSCQGREVRRECWVCDECVSRELALWCLEPECAPGLLDCLSKGQMADLCVCDECVSRELALGCPTWPRVGDHCRCQSARWPECWSCAPSGDCGYKGGCPMWPQPDDECECPRWPLMGDGCGCQVGELVWCREQCVRDGTRKVCMTCLVDRQESDVCDCVVDGDRLVCLRCEQGALRCVGEVCPPGWKNLGCNMCQGWEIVSECWADGAGCFMNKQMADLELCPREAAEAADGAGCFMNKQMADLELCPRTAAEAADGAACFMNKQMADLELCPRVAAEAADGAGCFINKQLADLELCPRVAAEAADGAGCFINKQLADLELCPREAAEAADGAGCFMNKQLADLEMCPRDDAEAADGAGCFMNKQLADPELCPREAEEAADGAGCFMNKQLVDLELCPRGAAEAADGAGCFMNNQLADWELCPRAAAEAADGAGCFMNKQMADWEMCPRAAAEAADGAGCFMNKQQADLELCPRGAAEAADGAECFMNKQLADSELCPRVAAEAADGAGCFMNKQLADLELCPREAAEAADGAGCFINMQMADQELCPRAAAEAADGAGCFINKQMSDFELCPREAGEAADGAGCFINKQMADLELCTREAAEAADGAGCFINKQMADLELCPRQAAEAADGAGCFINNQMADLELCPRGGAEAADGAGCFINKQMADWELCPREGAEAADGAGCFINKQMADLELCPSQAAEAADGAGCFINKQMADLELCPREGAEAADGAGCFINKQMADSELCPREPAEAADGAGCFIKKQMADLELCPREAWEAADGAECFINKQMADRELCAREVAEAADGAGCFIDKQMADLELCPRAAAEAADGAGCFINKQMADLELCRREAGEAADGAGCFKNKQMVDSELCARQAAEAADGAGCFQNKQMADLELCPREAAEAADGAECFINKQRADLELCPGEAAEA  165166167168169170171172173174175176177178179180181182183184185186187188189190191192193194195196197198199200201202203204205206207208209210211212
 ADGAGCFINKQMADSELCPAAAAEAADGAGCFINRQMADPELCPREAAEAADGAGCFIEKQMADMELCQARAAEAADGAGCFINKQMADWELCPREAAEAADGAGCFINNQMADLELCPREAAEAADGAGCFIEKQMADMELCQRETAEAADGAGCFINKQMADMELCPREAAEAADGAGCFINKQMADLELCPREAAEAADGAGCFRNKQMADLELCPREAAEAADGAGCFINKQMADLELCPARAAEAADGAGCFINRQLADMELCSRGAAEAADGAECFINRQMADLELCGREAAEAADGAGCFISPQLADWKRCMREAAEAADGAGCSIHTQMADWERCLREGAEAADGAGCSIHRQMADWERCLREGAEACSSCDGGGHKPPTIQCCLQSSCDGGGHFPPTIQLLCAPCWPGSRDCRTLAGACPEWPGSRDRCTLAGCATPEWPGSRDKRTLCGCATPEWPGSRDKRTCGTPCWPGSRDKRCGCSRPSPFDLFIRKSPTITCCSRPSPFDLFIRKSPTICCSRPSPFDLFIRKSPTCCSRPSPFDLFIRKSPCCRPSPFDLFIRKSPCCRPSPFDLFIRKSPTCCRPSPFDLFIRKSPTICCRPSPFDLFIRKSPTITCCPSPFDLFIRKSPTTTCCPSPFDLFIRKSPTICCPSPFDLFIRKSPTCCPSPFDLFIRKSPCCYAFATPEWPGSRDKRTLACCYAFATPEWPGSRDKRTLCCYAFATPEWPGSRDKRTCCYAFATPEWPGSRDKRCCAFATPEWPGSRDKRCCAFATPEWPGSRDKRTCCAFATPEWPGSRDKRTLCCAFATPEWPGSRDKRTLACCFATPEWPGSRDKRTLACCFATPEWPGSRDKRTLCCFATPEWPGSRDKRTCCFATPEWPGSRDKRCCTWSRASGKPVNHSTRCCTWSRASGKPVNHSTC 213214215216217218219220221222223224225226227228229230231232233234235236237238239240241242243244245246247248249250251252253254255256257258259260
 CTWSRASGKPVNHSCCTWSRASGKPVNHCCWSRASGKPVNHCCWSRASGKPVNHSCCWSRASGKPVNHSTCCWSRASGKPVNHSTRCCSRASGKPVNHSTRCCSRASGKPVNHSTCCSRASGKPVNHSCCSRASGKPVNHCCQWLHNEVQLPDARHSCCQWLHNEVQLPDARHCCQWLHNEVQLPDARCCQWLHNEVQLPDACCWLHNEVQLPDACCWLHNEVQLPDARCCWLHNEVQLPDARHCCWLHNEVQLPDARHSCCLHNEVQLPDARHSCCLHNEVQLPDARHCCLHNEVQLPDARCCLHNEVQLPDACCPSPFDLFIRKSPCGSKCPSPFDLFIRKSPTCGSKFAGCSRASGKPVNHCGAAEGFAGCSRASGKPVNHSCGAAEGFAGCSRASGKPVNHSTCGAAEGFAGCSRASGKPVNHSTRCGAAEGCSRASGKPVNHCGSKCSRASGKPVHHSCGSKCSRASGKPVNHSTCGSKFAGCFATPEWPGSRDKRCGAAEGFAGCFATPEWPGSRDKRTCGAAEGFAGCFATPEWPGSRDKRTLCGAAEGFAGCFATPEWPGSRDKRTLACGAAEGCPEWPGSRDKRCGSKCWPGSRDKRCGSKCPEWPGSRDKRCGAAEGFAGCLHNEVQLPDACGAAEGFAGCLHNEVQLPDARCGAAEGFAGCLHNEVQLPDARHCGAAEGFAGCLHNEVQLPDARHSCGAAEGFAGCLHNEVQLPDASGAAEGCPEWPGSRDRCGSKCWPGSRDRRCGSKCDSNPRGVSAADSNPRGVSCCLVVDLAPSKGTVNCCKQRNGTLC  261262263264265266267268269270271272273274275276277278279280281282283284285286287288289290291292293294295296297298299300301302303304305306307308
 CEEKQRNGTLTVCCHPHLPRCCTHPHLPRACCVTHPHLPRALCCRVTHPHLPRALMCCXRVTHPHLPRALMRCCQXRVTHPHLPRALMRSCCYQXRVTHPHLPRALMRSTCCPEWPGSRDKRCCRQRNGTLCCEERQRNGTLTVCCMRVTHPHLPRALMRCCQMRVTHPHLPRALMRSCCYQMRVTHPHLPRALMRSTCACPEWPGSRDRCTLAGGGCLEDGQVMDVDCCLEDGQVMDCGSKCLEDGQVMDVDLCGSKCLEDGQVMDVDLCPREAAEGDKCLEDGQVMDVDLCGGSSGGK  309310311312313314315316317318319320321322323324325326327328
由本发明方法制备的免疫原，包括表1经修饰的肽或者表2的环肽，形成本发明一个优选的方面。与这些肽具有相同特征的模拟物，含有这些能产生免疫反应的模拟物并能与IgE分子的IgE抗原决定簇产生交叉反应的免疫原，也形成本发明的一部分。模拟物的含义被定义为一种与表1或2所列天然IgE肽足够相似、使得其能被识别天然IgE肽的抗体所识别的实体；(Gheysen，H.M.等，1986，Syntheticpeptides as antigens.Wily，Chichester，Ciba foundationsymposium 119，p130-149；Gheysen，H.M.，1986，MolecularImmunology，23，7，709-715)；或定义为当其偶联到合适的载体上时能产生与天然IgE抗原决定簇进行交叉反应的抗体的实体。
本发明的方法或免疫原中所用的优选的肽是模拟IgE结构的表面暴露区域，然而在这些区域中，本发明人认为，最主要的方面是这些区域在与环结构相关的表面暴露范围内。IgE结构域的结构描述于“Introduction to protein Structure”(page 304，2nd Edition，Branden和Tooze，Garland Publishing，New York，ISBN 0 81532305-0)，其采取由两条相对的反平行β-折叠组成的β-管结构(参见图8)。免疫原可包括由IgE结构域的环衍生的序列构成的二硫键环肽。优选的例子是Cε3的A-B环、Cε4的A-B环、Cε3的C-D环、Cε4的C-D环、Cε2的A-B环和Cε2的C-D环。
上述确定的IgE抗原决定簇的肽模拟物可通过增加、缺失或替代所选氨基酸来设计用于特定目的。因此，本发明的肽可为了容易偶联到蛋白质载体上而加以修饰。例如，某些化学偶联方法需要使IgE抗原决定簇包含末端半胱氨酸。另外，也期望偶联到蛋白质载体上的肽在其远离偶联末端处包含一个疏水末端，以使肽的非偶联自由末端仍与载体蛋白质表面结合。这样就减少了肽构象的自由程度，从而增加了使肽呈现的构象最接近地类似于完整IgE分子中IgE肽的可能性。例如，可对肽进行修饰以使其包含N末端半胱氨酸和C末端疏水性酰胺化端。或者可选择地，增加或替代一个或多个D-立体异构构型的氨基酸可能产生有利的衍生物，例如提高肽的稳定性。本领域技术人员将认识到，这样修饰的肽或模拟物可以全部或部分地是非肽模拟物，其中的组成残基不必限于20种自然存在的氨基酸。此外，它们可以通过本领域公知的技术被环化并限制肽的构象，以使其接近该肽序列在完整IgE分子中的形状。优选的肽环化方法包括加入半胱氨酸残基对以使其形成二硫键。
更进一步地，本领域技术人员将认识到，本发明的模拟物或免疫原可以比上述抗原决定簇大，这样就可以包括这里公开的序列。因此，本发明的模拟物包括在N和/或C末端的一端或两端增加其他天然残基而延长。肽模拟物也可以是天然IgE序列的反转序列，因为其序列方向是可逆转的；或者可选择地，其序列可以完全或至少部分包括D-立体异构的氨基酸(变型序列)。相应地，肽序列也可以是反转-变型的，因为其序列方向是可逆转的而且氨基酸是D-立体异构形式。这样的反转或反转-变型肽具有非自身的优点，这样就可以克服免疫系统中的自身耐受问题(参见实施例P14c)。
可选择地，肽模拟物可使用如噬菌体展示(phage display)技术(EP 0 552 267 B1)、利用本身能与本发明的IgE抗原决定簇结合的抗体来进行识别。该技术产生大量模拟天然肽结构的肽序列，因此能够结合抗天然肽的抗体，但是其自身不必与天然IgE肽有有效的序列同源性。该方法具有重要的优点，其可能识别具有增强的免疫特性的肽(例如与IgE受体或抗IgE的抗体有更高亲和力，或者能诱导以更高亲和力结合IgE的多克隆免疫反应)，或者能克服任何潜在的、与使用天然肽序列有关的自身抗原耐受的问题。此外，该技术允许根据待识别的模拟物序列中共有的化学特征来确定每种天然肽的识别模式。
可选择地，肽模拟物可根据增强肽免疫原性的目的来产生，即通过增强其与抗IgE肽的多克隆抗体的亲和力，其效果可通过本领域公知的技术检测(如Biocore实验)。为实现这一点，肽序列可按下述一般原则选择性地改变：
*为维持结构上的约束，不应替代脯氨酸和甘氨酸
*其他位置可用有类似物理化学性质的氨基酸替代
这样，每个氨基酸残基都可被其最近似的氨基酸替代。例如，如下面表3所描述的，A可被V、L或I替代。
 原残基  典型替换  优选替换
 A  V，L，I  V
 R  K，Q，N  K
 N  Q，H，K，R  Q
 D  E  E
 C  S  S
 Q  N  N
 E  D  D
 G  A  A
 H  N，Q，K，R  N
 I  L，V，M，A，F  L
 L  I，V，M，A，F  I
 K  R，Q，N  R
 M  L，F，I  L
 F  L，V，I，A，Y，W  W
 P  A  A
 S  T  T
 T  S  S
 W  Y，F  Y
 Y  W，F，T，S  F
 V  I，L，M，F，A  L
因此，本发明提供了一种制备疫苗的方法和包含使用本发明方法而偶联的二硫键环肽的新免疫原，以及该免疫原在制备用于预防或治疗疾病的药物组合物中的应用。优选地，本发明的方法和免疫原用于制备变态反应用的免疫预防或治疗的疫苗。
用于本发明方法的肽在设想中将是很小的。因此，这些肽在长度上应不超过100个氨基酸，优选少于75个氨基酸，更优选地不超过50个氨基酸，最优选在4到25个氨基酸长度的范围内。
用于本发明方法和偶联物中的最优选的肽是SEQ ID NO，99，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327和328。
用于本发明免疫原的免疫原性载体的类型是本领域技术人员容易了解的。载体的首选功能是提供细胞因子辅助以帮助诱导抗IgE肽的免疫反应。可用于本发明的载体的不完全列举包括：钥孔虫戚血兰素(KLH)、血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)、灭活的细菌毒素如破伤风或白喉毒素(TT和DT)，或它们的重组片断(例如，TT的片断C的结构域1，或DT的易位结构域)，或衍生于结核菌素的纯化蛋白(PPD)。可选择地，本方法可用于将环肽直接偶联到脂质体载体上，该脂质体可额外包含能提供T-细胞辅助的载体。优选地，肽和载体的比例为1∶1到20∶1，以及优选每个载体应携带3-15个肽。
在本发明一个具体实施方案中，优选的载体是流感嗜血杆菌的D蛋白(EP 0 594 610 B1)。D蛋白是来自流感嗜血杆菌的IgD结合蛋白，其专利已由Forsgren获得(WO 91/18926，授权EP 0 594 610 B1)。在某些情况例如在重组免疫原表达系统中，使用D蛋白片断如1/3 D蛋白(包含D蛋白N-端100-110个氨基酸(GB 9717953.5))是必要的。
肽容易使用“Fmoc”法，在全自动仪器中使用聚酰胺或聚乙二醇-聚苯乙烯(PEG-PS)支持物，通过本领域公知的技术制备(固相合成的技术和步骤描述于E.Atherton与R.C.Sheppard合著，IRL atOxford University Press出版的“Solid Phase Peptide Synthesis：A practical Approach”(1989))，随后通过酸介导的裂解获得线性的、脱保护的、修饰的肽。该肽容易被氧化和纯化，产生二硫键修饰的肽，其工艺方法概述于“Methods in Molecular Biology，Vol.35：Peptide Synthesis Protocols  (M.W.Pennington和B.M.Dunn)，chapter 7，pp91-171，D.Andreau等”。
可选择地，这些肽可通过重组方法制备，包括在细菌或哺乳动物细胞中表达编码模拟物的核酸分子，然后纯化表达的模拟物。肽和蛋白质的重组表达技术是本领域公知的，其描述于Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，Molecular cloning，a laboratorymannual，2nd Ed.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)。
每支疫苗制剂中蛋白质的量按这样的量选择，其可诱导典型的疫苗接种者产生免疫保护反应而没有明显不利的副作用。这个量的变化依赖于使用哪种特殊免疫原和它呈现何种状态。通常，每剂包含1-1000μg蛋白，优选为1-500μg，更优选为1-100μg，1-50μg是最优选的范围。特定疫苗最佳的量可通过标准研究确定，包括观察患者合适的免疫反应。在初次接种免疫后，患者可接受一次或几次足够时间间隔的加强接种免疫。
本发明的疫苗包含佐剂是有益的。适用于本发明疫苗的佐剂包括那些能增强抗免疫原的抗体反应的佐剂。佐剂是本领域公知的(Vaccine Design-The Subunit and Adjuvant Approach，1995，Pharmaceutical Biotehnology，Volume 6，Eds.Powell，M.F.，Newman，M.J.，Plenum Press，New York and London，ISBN 0-306-44867-X)。用于本发明免疫原的优选佐剂包括铝盐或钙盐(例如其氢氧化物或磷酸盐)。用于本发明免疫原的优选佐剂包括：铝盐或钙盐(氢氧化物或磷酸盐)，水包油型乳液(WO 95/17210，EP 0 399843)，或者微粒载体如脂质体(WO 96/33739)。具有辅助活性的、来源于南美洲树Quillaja Saponaria Molina树皮的免疫活性皂角苷组分(例如Quil A)是特别优选的。Quil A的衍生物例如QS21(一种源自QuilA的HPLC纯化组分)及其制备方法公开于美国专利No.5,057,540。在QS21(公知为QA21)中其他组分如QA17也被公开了。3-脱氧酰基化的单磷酰基脂质A是公知的由RiBi Immunochem，Montana生产的佐剂。它可由GB 2122204B教导的方法制备。3-脱氧酰基化的单磷酰基脂质A的一种优选形式是具有直径不大于0.2μm的小颗粒的乳液(EP 0 689 454 B1)。
佐剂也包括但不限于胞壁酰二肽和皂角苷如Quil A，细菌脂多糖如3D-MPL(3-脱氧酰基化的单磷酰基脂质A)或TDM。进一步作为一种代表性的可选择方案，蛋白质可包装在微粒如脂质体或者非微粒状的聚氧乙烯醚悬浮液中(英国专利申请No.9807805.8)。特别优选的佐剂是3D-MPL和QS21的复合物(EP 0 671 948 B1)，含有3D-MPL和QS21的水包油型乳液(WO 95/17210，PCT/EP98/05714)，用其他载体配制的3D-MPL(EP 0 689 454 B1)，或在含胆固醇的脂质体中形成的QS21(WO 96/33739)，或免疫刺激性寡核苷酸(WO 96/02555)。可选择地，佐剂包括那些WO 99/52549中描述的佐剂。
本发明的疫苗通常既可作为初次制剂给药，也可作为加强制剂给药。预期的加强制剂给药应有足够的时间间隔，或者优选地定为每年一次或者在循环抗体水平降到预期水平以下时给药。加强制剂可以由不含最初载体分子的肽构成。这些加强制剂构建物可以选择性地包含载体或者不含任何载体。
本发明更进一步的方面提供了一种这里描述的用于医学的免疫原或疫苗。
优选地，本发明的疫苗制剂可用于保护或治疗对变态反应敏感的或者正患有变态反应疾病的哺乳动物，其通过全身途径或黏膜途径施用所述的疫苗。这些施用可包括通过肌肉、腹膜内、皮内或皮下途径注射；或者通过黏膜施用到口腔/食道，呼吸道，泌尿生殖道。优选的施用途径是经皮肤途径，例如通过皮肤垫片给药。因此，本发明提供了一种治疗变态反应的方法，包括给正患有变态反应疾病或对其敏感的病人施用本发明的肽，免疫原或配体。
疫苗的制备概括地描述于New Trends and Developments inVaccines，、Voller等编辑，University Park Press，Baltimore，Maryland，U.S.A.1978。蛋白质与大分子的偶联由Likhite公开于美国专利4,372,945和Armor等人公开于美国专利4,474,757。
本发明由下面的实施例进行说明，但不限于这些实施例。
实施例1，二硫键环肽与载体的偶联，其通过将马来酰亚胺活化的肽偶联到硫醇盐化的D蛋白或BSA载体上进行。
在本实施例中，马来酰亚胺衍生的环肽与带巯基的载体反应。通过还原载体的SPDP衍生物，在作为载体的D蛋白(PD)或BSA上生成巯基。
N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)是一种杂双官能化交联剂，其在温和的条件下以它的NHS-酯基与蛋白质的氨基反应(图3)(Hermanson G.T.Bioconjugate Techniques，1996)。NHS-酯交联反应最常在磷酸盐，碳酸氢盐/碳酸盐和硼酸盐缓冲液中进行。其他缓冲液只要不含伯胺都能用。用DTT(二硫苏糖醇，或其他二硫键还原剂)处理SPDP修饰的蛋白质以释放吡啶-2-硫酮离去基团并形成游离巯基(图3A)。该反应一般用25mM DTT在pH 4.5下反应以防止蛋白质S-S键的还原。对不含S-S键的蛋白质，DTT还原可在pH 7-9进行。肽上增加的马来酰亚胺基团与载体上出现的巯基之间的反应产生了本发明的免疫原(图3B)。马来酰亚胺活化的肽通过肽(P)与杂双官能化交联剂如GMBS(γ-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)反应获得。
方法
SPDP修饰的蛋白质
BSA(Pierce)以10mg/ml浓度溶于50mM磷酸钠、0.15M NaCl，pH 7.2中。SPDP以6.2mg/ml浓度溶于DMSO(配制20mM母液)。将足量SPDP母液加入欲修饰的蛋白质中(对BSA，SPDP过量于蛋白质15倍摩尔，对PD，过量25倍摩尔)。室温反应一小时后，修饰的蛋白质通过对50mM磷酸钠，10mM EDTA，pH 6.8透析或凝胶过滤从反应产物中纯化。样品置于以磷酸盐缓冲液pH 6.8(或者100mM乙酸钠，0.15M NaCl，1mM EDTA pH 4.5，如果含S-S键的蛋白质欲在下一步还原的话)平衡的脱盐柱(Sephadex G25)。收集1ml组分并通过280nm吸光值测定。收集含有SPDP修饰蛋白的组分。
引入BSA的硫代吡啶基团的数目由分光光度法估测：转移200μl修饰的BSA到分光光度管，加入200μl溶解在100mM磷酸盐缓冲液(pH 7)中的50mM巯基乙醇。加入巯基乙醇前后测量343nm处的吸光度。用A343nm＝8000M-1cm-1来估计释放的硫代吡啶酮量。
用DTT裂解含二硫键的交联剂
加入DTT至终浓度1-10mM。室温下保温2h。用Sephadex G25凝胶过滤除去过量的DTT。为维持暴露的巯基基团的稳定性，层析缓冲液(100mM磷酸盐pH 6.8)包含10mM EDTA。氧化DTT的存在可在洗脱过程中通过测定280nm吸光值监测。
马来酰亚胺修饰的肽
肽溶于100mM磷酸钠pH 6.8中。然后加入GMBS(Pierce)到肽样品中。使用过量于肽2.5倍摩尔的交联剂。室温反应1小时后，用sephadex G-10(100mM磷酸钠pH 6.8)凝胶过滤除去反应副产物。收集1ml组分并通过280nm吸光值测定。用Ellman反应证明马来酰亚胺基团的存在。
SPDP修饰的蛋白质和马来酰亚胺活化的肽之间的反应
过量的马来酰亚胺活化的肽(马来酰亚胺活化的肽大约过量于蛋白质22倍摩尔)加入到SPDP修饰的蛋白质中，室温搅拌1小时，然后对100mM磷酸钠pH 6.8透析三次。通过0.2μm孔径(milliporefilter)滤膜过滤后，用Lowry方法估测蛋白质含量。
结果
1.SPDP修饰的蛋白质的Obtention
以BSA或PD为载体用不同的SPDP浓度进行了几次测试
1.a在PD上的测试
引入的硫代吡啶基团的数目通过加入巯基乙醇后释放的硫代吡啶酮以分光光度法估测。用浓度为6.6mg/ml或10mg/ml的PD进行了几次测试.结果至少14个硫代吡啶基团能引入到PD上(图4)。然而，在PD浓度为10mg/ml时，只有4-5个硫代吡啶基团能引入到PD上(图5)。实际上，为获得更多的硫代吡啶基团而进行测试时，观察到了PD的沉淀。不过，这种沉淀部分地是由用来溶解SPDP(6.2mg/ml)的DMSO引起的。使用水溶性的磺化-LC-SPDP(磺化琥珀酰亚胺基-6-[2-吡啶基二硫基)-丙酰胺]-己酸酯)可以解决这个问题。
1.b在BSA上的测试
最多8到10个硫代吡啶基团能加到BSA上。如果使用过量于BSA 20倍摩尔的SPDP则能获得更高的硫代吡啶基团数目(图6)。然而，随后在反应中观察到了轻微的浑浊，导致SPDP修饰的BSA的产率更低。
用DTT还原吡啶二硫键的测试在乙酸钠pH 4.5(防止天然二硫键的还原)或磷酸盐缓冲液(用于SPDP修饰的PD)中进行。DTT的效力通过吡啶-2-硫酮的释放来确定。
2.限定的p15肽的偶联
五种限定的肽用以上描述的化学方法偶联到BSA上：
原始序列：EDGQVMDVD(SEQ ID NO.1)
p15a：GGCLEDGQVMDVDC(SEQ ID NO.324)
p15b：Ac-CLEDGQVMDCGSK-NH2(SEQ ID NO.325)
p15c：Ac-CLEDGQVMDVDLCGSK-NH2(SEQ ID NO.326)
p15d：Ac-CLEDGQVMDVDLCPREAAEGDK-NH2(SEQ ID NO.327)
p15e：Ac-CLEDGQVMDVDLCGGSSGGK-NH2(SEQ ID NO.328)
由此产生的偶联物是可溶的，用SDS-PAGE鉴定(考马斯蓝染色)(图7)。
3.限定的p14肽的偶联
三种限定的肽用于偶联：
原始序列：PEWPGSRDKRT(SEQ ID NO.63)
p14e：ACPEWPGSRDRCTLAG-NH2(SEQ ID NO.323)
p14f：AcCPEWPGSRDRCGSK-NH2(SEQ ID NO.304)
p14I：AcCWPGSRDRRCGSK-NH2(SEQ ID NO.305)
由此产生的偶联物是可溶的，用SDS-PAGE鉴定(考马斯蓝染色和蛋白印迹)(图7B，第7道，图8和图9)。
4.巯基-二硫键交换
含有二硫键的化合物可参与同另一个巯基的二硫键交换反应。二硫键交换过程包括巯基攻击二硫键，断裂S-S键，结果形成一种新的混合二硫化物并构成原始二硫键化合物的一部分。如果巯基过量存在，则混合二硫化物继续反应形成完全由巯基还原剂组成的对称性二硫化物。如果巯基并非大量过量地存在，混合二硫化物产物是最终结果。
为检验在BSA-SH与马来酰亚胺活化的二硫键环肽之间的反应过程中是否能观察到二硫键交换，在同一偶联条件下(缓冲液，pH，肽/载体比例和温度)进行了BSA-SH与未修饰的p14i肽之间的反应。1小时后，样品经透析或用磷酸盐缓冲液pH 6.8平衡的脱盐柱(sephadexG25)处理。所得产物在SDS-PAGE上分析(考马斯蓝染色)(图10)。包括的阳性对照来自发生了二硫键交换的SPDP修饰的BSA与p14a肽(AcAPEWPGSRDKRTLAGGC)之间的反应(图3A)。所得的偶联物经透析或凝胶过滤纯化。
没有观察到BSA-SH与p14i反应所得产物的分子大小的增加(图10A：第9道)。而且，用mAb 31没有检测到蛋白质(图1B：第9道)表明至少在用于偶联的条件下的反应过程中不存在二硫键交换。
结论
两种化学方法结合用于限定的肽与载体的偶联。获得了载体上带有6到8个肽的可溶性偶联物，并用抗p14的抗体进行SDS-PAGE鉴定。如蛋白印迹所确认的，所得的偶联物主要通过GMBS活化肽与BSA-SH之间的反应获得，而不是通过二硫键交换。这些结果证明，这些化学方法能用于将限定的肽偶联到载体上。在上面的实施例中，通过马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺酯试剂与赖氨酸侧链或N-末端氨基反应将马来酰亚胺加到肽上。清楚的是，添加马来酰亚胺的可替代方法能够容易地想到：特别对于表位内含赖氨酸的肽，可在肽合成的过程中、最后的侧链脱保护和肽裂解之前加入马来酰亚胺。
实施例2，不同的二硫键环肽-BSA偶联物诱导的免疫反应
为评估实施例1制备的偶联物的免疫原性，对每组10只小鼠用25μg偶联物与AS2佐剂(油/水乳液，3D-MPL，QS21)混合在第0，14和28天进行肌肉内免疫。在第28天和42天用ELISA分析P14肽的血清反应(第III次后14天)。结果示于下面的表4。
                   表4，抗P14肽的IgG反应，第III次后14天
肽偶联物 IgG抗肽反应(中值滴度) 平均值 标准偏差 几何平均数
P14e 3151 3224 3051 2873 4647 1461 4227 3821 2345 3200 963 3051
P14f 67086 36031 74838 56496 51304 92885 92868 113041 89155 101502 77521 24519 73541
P14I 85882 39268 39460 57276 50834 54664 62263 36621 26202 28989 48146 17926 45336
不同的P15-BSA偶联物诱导的免疫反应
25μg实施例1制备的P15肽偶联物也与AS2佐剂(油/水乳液，3D-MPL，QS21)混合在第0，14和28天对每组10只小鼠进行肌肉内免疫。抗肽和抗IgE抗体反应示于表5(第III次后14天)。所有的环化P15肽都获得了非常同源的反应。抗IgE抗体反应通过与单克隆抗体mAb11对比进行了分析，已知mAb11可识别P15靶位点(Cε2的c-d环)并抑制人类嗜碱细胞分析中组胺的释放，抗IgE水平表示为μg/ml mAb11当量。
         表5，利用环化P15-BSA偶联物进行的免疫反应
BSA偶联物 抗肽(中值滴度) 抗IgE(μg/ml或mAb11当量)
平均值 标准偏差 几何平均数 平均值 标准偏差 几何平均数
P15b 11169 10766 8385 70 104 35
P15c 66452 10917 65685 200 64 189
P15d 35118 11601 32801 174 168 111
P15e 57432 16589 55207 129 68 113
人类嗜碱细胞分析
用人类嗜碱细胞(HBA)进行了两类分析，其一是确定疫苗诱导的抗体的过敏原性，包括将抗体加入分离的PBMC；其二是通过HBA与疫苗诱导的抗体预保温来测定其对Lol PI(一种强过敏原)触发的组胺释放的抑制。
从4个变态反应供体静脉穿刺收集血液于试管中，其中含0.1体积的2.7％ EDTA，pH 7.0。然后用含0.1％人血清白蛋白的HBH培养基(HBH/HSA)等体积稀释1/2。所得细胞悬液在50％体积的Ficoll-Paque上铺层，在室温下400g离心30分钟。收集界面上的外周血单核细胞(PBMC)，丢弃沉淀。细胞在HBH/HAS中漂洗一次，记数，然后按每毫升2.0×106个的细胞密度重新悬浮于HBH/HSA。将100μl细胞悬浮液加入V-型底96孔板的孔中，其中含100μl稀释的测试样品或疫苗诱导的抗体。每个测试样品在一定的稀释度范围内测试，每个稀释度6孔。孔内物用平板混合器简单混合后在37℃、120rpm振荡保温30分钟。
对每个血清稀释度，3孔通过加入10μl Lol pI提取物(终稀释度1/10000)触发，另3孔加入10μl HBH/HAS以估测过敏原性。孔内物用平板混合器再次简单混合后在37℃、120rpm振荡再保温30分钟。500g离心5分钟，终止保温。去除上清后用于组胺分析，分析采用作为商品提供的组胺EIA测试试剂盒进行(Immunotech)。按常规包括对照孔，其包含无测试样品的细胞，用于测定自发触发的释放。也包括含有细胞和0.05％ Igepal去垢剂的孔，用于测定总的细胞组胺。
结果表示如下：
过敏原性分析
由测试样品引起的组胺释放＝％从测试样品处理的细胞释放的组胺-％自发的组胺释放
抑制分析
组胺释放的抑制程度可用公式计算：
％抑制＝1-(从测试样品处理的细胞释放的组胺*)/(从抗原刺激的细胞释放的组胺*)×100
*对自发释放进行了数值校正。
结果
用本发明的化学方法偶联到BSA载体上的P15二硫键环肽的组胺释放活性结果示于图11到14。
图11A和B显示P15c，P15d和P15e诱导的抗血清对组胺释放的抑制活性；并对比于阳性对照：1079 BSA，PT 11和mAb005，以及阴性对照BSA-BAL(单独的活化载体)，抗BSA，非特异性同型对照(IgG1和IgG2b)；也显示了组胺自发释放、过敏原触发后的组胺释放以及细胞总组胺含量(由去垢剂释放)数据。
图12A和B显示P15c诱导的抗血清对组胺释放的抑制活性，其对照组与图11相同，并增加一个阳性对照1079 HBC和一个额外的阴性对照野生型HBC。
图13显示与图11所述相同的测试样品(P15c，P15d和P15e)的过敏原性(将抗血清加入没有过敏原的HBA中)。图14显示与图12所述相同的测试样品的过敏原性。
概括地说，P15c，P15d和P15e诱导了抗血清，其抑制了过敏原触发后从人嗜碱细胞释放组胺，而抗血清本身没有过敏原性。

Claims (13)

1.一种制备疫苗免疫原的方法，包括将二硫键环肽偶联到免疫原性载体上，包括，(a)在二硫键环肽上添加一个包含能与含巯基载体形成硫醚键的活性基团的部分，以及(b)将这样形成的活化环肽与含巯基的免疫原性载体反应。
2.如权利要求1中所述的方法，其中能与含巯基载体形成硫醚键的活性基团是马来酰亚胺基。
3.如权利要求1中所述的方法，其中二硫键环肽衍生自人IgE。
4.如权利要求3中所述的方法，其中人IgE肽选自SEQ ID Nos.1至328的任意一种。
5.如权利要求1中所述的方法，其中载体选自流感嗜血杆菌蛋白D，BSA，钥孔虫戚血兰素(KLH)，血清白蛋白如牛血清白蛋白(BSA)，灭活的细菌毒素如破伤风或白喉毒素(TT和DT)，或者其重组片断(例如，TT片断C的结构域1，或DT的易位结构域)，或者结核菌素衍生的纯化蛋白(PPD)。
6.一种二硫键环化IgE肽的马来酰亚胺衍生物。
7.如权利要求6所述的肽衍生物的用途，用于制备治疗变态反应的药物。
8.一种适用于疫苗的偶联物，结构式为(I)：
Figure A0181777700021
其中，载体是一种免疫原性载体分子，X是连接体或键，Y是连接体或键，以及P是二硫键环肽。
9.如权利要求8所述的偶联物，其中P选自下列组：SEQ IDNO.s99，304，305，306，307，308，309，310，311，312，313，314，315，316，317，318，319，320，321，322，323，324，325，326，327和328。
10.一种包含权利要求1至5任一项所述方法的产物、和适当佐剂或载体的疫苗组合物。
11.一种包含如权利要求8或9中所述的偶联物、和适当佐剂或载体的疫苗组合物。
12.如权利要求10或11中所述的疫苗组合物，其中疫苗是变态反应疫苗。
13.如权利要求8中所述的偶联物，用于治疗变态反应。
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