CN1469746A - 逆转录病毒免疫疗法 - Google Patents

Abstract

本发明人注意到在对感染哺乳动物的逆转录病毒应答中产生至少两种免疫细胞群体。更具体地讲，感染逆转录病毒的哺乳动物免疫系统能够通过一组在本文中统称为“效应细胞”的细胞建立针对所述病毒的免疫应答，然而也产生了可调节所述“效应细胞”、能够限制哺乳动物有效控制或根除所述逆转录病毒感染、在本文中统称为“调节细胞”的第二种细胞群体。因此，本发明运用这些观测结果来提供用于治疗有逆转录病毒感染的哺乳动物的方法。

Description

逆转录病毒免疫疗法

发明领域：

本发明提供一种治疗哺乳动物患者逆转录病毒感染的方法。更具体地讲，本发明提供一种治疗引起人类患者免疫缺陷相关疾病的逆转录病毒感染的方法。

发明背景：

人免疫缺陷病毒(HIV)诱发在大多数情况下可以导致发生获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的持续进行性感染。至少存在两种不同类型的HIV：HIV-1和HIV-2。在人类中，HIV感染最终导致免疫机能不全、机会性感染、神经性机能障碍、肿瘤生长，最终导致死亡。

HIV是逆转录病毒慢病毒科中的一员。逆转录病毒是含单链RNA基因组的小包膜病毒，并且通过将由病毒编码的逆转录酶产生的DNA中间体插入到宿主DNA中而进行复制。其它逆转录病毒包括例如致癌病毒例如人T细胞白血病病毒(HTLV-I、HTLV-II、HTLV-III)、猫白血病病毒和小鼠丙型逆转录病毒。

HIV病毒颗粒组成包括：病毒核心(部分由称为p24和p18的衣壳蛋白组成)以及病毒RNA基因组和早期复制事件所需的酶。肉豆蔻化gag蛋白构成围绕病毒核心的病毒外壳，它进而被来源于感染细胞膜的脂膜包膜所包围。HIV包膜表面糖蛋白作为单一160千道尔顿前体蛋白合成，然后在病毒出芽期间被细胞蛋白酶切割成两种糖蛋白gp41和gp120。gp41是一种跨膜糖蛋白，而gp120是一种仍与gp41非共价连接、可能以三聚体或多聚体形式存在的胞外糖蛋白。

HIV感染是广泛流行性的并且HIV相关性疾病是一个重大的世界健康问题。虽然已经投入相当大的努力用以设计有效的治疗药，但是目前仍然没有研制出有疗效的抗逆转录病毒药或抗AIDS疗法。为了开发这类药物，考虑了将HIV生活周期的若干阶段作为治疗性干扰的靶(Mitsuya等，1991)。

值得注意的是开发用于治疗HIV感染的疫苗。已经显示HIV-1包膜蛋白(gp160、gp120、gp41)是AIDS患者体内存在的抗HIV抗体的主要抗原(Barin等，1985)。因此，迄今为止，这些蛋白似乎是用作抗原用于抗HIV疫苗开发最具前景的候选物。多个研究小组已经开始应用gp160、gp120和/或gp41的各个部分作为宿主免疫系统的免疫原性靶(US 5,141,867；WO 92/22654；WO 91/09872；WO 90/07119；US6,090,392)。尽管进行了这些努力，但是尚未开发出用于治疗HIV感染的有效疫苗策略。

本发明提供一种用于治疗逆转录病毒感染的替代免疫疗法。

发明概述：

本发明人注意到在对感染哺乳动物的逆转录病毒应答中产生至少两种免疫细胞群体。更具体地讲，感染逆转录病毒的哺乳动物免疫系统能够通过一组在本文中统称为“效应细胞”的细胞建立针对所述病毒的免疫应答，然而也产生了可调节所述“效应细胞”、有限制哺乳动物有效控制或根除所述逆转录病毒感染能力、在本文中统称为“调节细胞”的第二种细胞群体。

虽然不希望受理论的限制，但是已提出人类含有许多作为稳定遗传元件、与逆转录病毒序列同源或几乎同源、在整个人类基因组中片段化的序列。因此，由这些序列编码的蛋白可以在发生免疫应答期间被识别为“自身”的。然后，逆转录病毒的后续感染也可以被部分识别为“自身”的，从而限制免疫系统建立成功免疫应答的能力。这一建议可以至少部分解释为何迄今为止难以开发出抵抗HIV的有效疫苗。

这一假说得到Rakowicz Szulczynska及其同事的支持(1998和2000)，他们已经表明某些与乳腺癌相关的抗原在分子水平和免疫学上与由HIV-1编码的蛋白类似。其它癌症获得了相似的观测结果。另外，Coll等(1995)报道了结合自身免疫病例如斯耶格伦综合征(Sjogren′ssyndrome)和系统性红斑狼疮患者体内HIV-1的抗体。此外，BLAST搜索人类基因组数据库与人免疫缺陷病毒基因组序列表明，在这两种基因组中有许多显著同一性的区。

也注意到在对抗原应答时，在调节细胞扩充之前有相当数目的效应细胞得到扩充。这提供防止“调节细胞”产生或破坏所述“调节细胞”而同时保留“效应细胞”的机会。

因此，在第一个方面，本发明提供一种治疗哺乳动物患者逆转录病毒感染的方法，所述方法包括给予所述患者一种增加针对所述逆转录病毒的效应细胞的数目和/或激活所述效应细胞的组合物，随后给予所述患者一种抑制调节细胞产生和/或破坏所述调节细胞的药物，其中选择使得所述效应细胞的活性不被显著降低的时间给予所述药物。

有多种可以增加针对逆转录病毒的效应细胞的数目和/或活性的方式。在某些情况下，见于疏忽性逆转录病毒感染，例如被带有所述病毒的注射器针头刺伤。众所周知，健康工作者和研究人员存在针头刺伤而感染病毒之风险。同样，普通群众也会由于接触废弃注射器而遇到这种危险，特别是在沙滩上和用这类注射器抢劫时。因此，当怀疑接触了逆转录病毒、特别是HIV时，哺乳动物患者可以使用本发明的方法。

本发明的方法也可以用来治疗感染逆转录病毒有一段时间的哺乳动物患者。尽管这种患者的免疫系统已经接触了所述逆转录病毒，但是加入其它逆转录病毒抗原可以导致其它效应细胞应答，随后可能消除这些新效应细胞的调节细胞。

感染逆转录病毒的患者可以用抗逆转录病毒药进行治疗，以保持低的病毒负荷。也可以将所述组合物给予这样的患者，以引发新的效应细胞免疫应答，随后给予所述药物消除调节细胞。

在第一个方面的一个优选实施方案中，大约在对所述组合物给予作出反应的CD8+CD4-T细胞数目达到峰值时，给予所述药物。

此外，最好是大约在给予所述组合物后，当病毒颗粒数目开始稳定或增加时，给予所述药物。

在第一个方面的再一个优选实施方案中，感染哺乳动物患者体内效应细胞的再刺激可以通过包含逆转录病毒抗原多肽的组合物得以实现。优选通过给予一种包含所述逆转录病毒抗原多肽和药学上可接受的载体的疫苗，使所述抗原多肽提供给所述患者。更优选所述疫苗还包含佐剂。

在另一个实施方案中，通过给予编码所述逆转录病毒抗原多肽的DNA疫苗，使所述抗原多肽提供给所述患者。

在再一个实施方案中，通过食用表达所述逆转录病毒抗原多肽的转基因植物，使所述抗原多肽提供给所述患者。

停止抗逆转录病毒治疗在受感染患者体内常常引起针对重新出现的病毒的效应细胞的快速再扩充。因此，可以在适当时间给予所述药物以消除所述调节细胞，而不需要给予如本文定义的组合物。

因此，在第二个方面，本发明提供一种治疗哺乳动物患者逆转录病毒感染的方法，所述方法包括使所述患者接受抗逆转录病毒药物疗法，随后给予所述患者一种抑制调节细胞产生和/或破坏所述调节细胞的药物，其中所述药物在结束所述抗逆转录病毒药物疗法之后给予，并且在逆转录病毒数目方面所产生的扩充导致针对所述逆转录病毒的效应细胞数目增加和/或激活所述效应细胞，其中选择使得所述效应细胞的活性不被显著降低的时间给予所述药物。

在第二个方面的一个优选实施方案中，大约在对结束所述抗逆转录病毒药物疗法作出反应的CD8+CD4-T细胞数目达到峰值时，给予所述药物。

当停止抗逆转录病毒药物疗法后，病毒负荷会增加(例如参见Daar等，1998)。这导致针对逆转录病毒的效应细胞的扩充和/或活化，开始稳定所述病毒负荷。应该大约在所述逆转录病毒数目达到峰值或者在该峰值之后开始减少时给予所述药物。

因此，在第二个方面的再一个优选实施方案中，大约在结束所述抗逆转录病毒药物疗法影响下所述病毒颗粒数目达到峰值或者在该峰值之后开始减少，给予所述药物。

在调节细胞消除中所用的药物最好选自抗增殖药物、放射疗法和与CD4+T细胞特异性结合的抗体。所述抗增殖药物最好选自长春碱和脱水长春碱。

所述逆转录病毒最好选自HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2。

本领域技术人员将会容易认识到，本发明的方法可以重复进行，以提供更加完全的治疗。

所述哺乳动物患者最好是人类。

在第三个方面，本发明提供抑制调节细胞产生和/或破坏所述调节细胞的药物在生产用于治疗哺乳动物患者逆转录病毒感染的药物中的应用。

在第三个方面的一个优选实施方案中，所述药物最好选自抗增殖药物和与CD4+T细胞特异性结合的抗体。

在以上概述的各个方面，“调节”细胞群体的消除使得“效应”细胞群体可以减少或根除所述逆转录病毒负荷，因为效应细胞的任何负调节(由于自身耐受机制所致)已被除去。

在本发明的说明书中，用语“包含”或诸如“包括”的变化用语，应该理解为包括所述整数(integer)或步骤要素(step)或者成组的整数或步骤要素，但不排除任何其它整数或步骤要素或者成组的整数或步骤要素。

下文将通过以下非限制性附图和实施例来描述本发明。

附图简述：

图1：MAIDS在感染LP-BM5的B6小鼠中的时程。

图2：单剂量的长春碱(6mg/kg i.p.)对感染后10周MAIDS进程的影响。

图3：感染后10周，长春碱治疗小鼠的脾组织学。

图4：感染后20周，长春碱治疗后对MAIDS的防治作用。n＝5。

图5：在保护性长春碱疗法后再用MAIDS病毒攻击。n＝5。

图6：第14天长春碱对MAIDS感染小鼠(MAIDS+)和对照小鼠(MAIDS-)的脾细胞百分率的影响。n＝3。

图7：脾转移实验方案。

图8：从MAIDS感染供体小鼠转移脾细胞。n＝7。

图9：体内耗竭实验方案。

图10.感染后第14天CD4+或CD8+细胞的体内耗竭。n＝5。

发明详述： 对逆转录病毒感染的免疫应答

本文所用的术语“治疗”是指实现逆转录病毒负荷的降低。最优选完全根除所述逆转录病毒负荷。

尽管尚未确定“调节细胞”的准确性质，但是已经认定这些细胞包括CD4+细胞亚群。

CD4+细胞表达本领域称为CD4的标记。通常，本文所用的术语“CD4+T细胞”不是指也表达CD8的细胞。然而，该术语可以包括也表达其它抗原标记例如CD25的T细胞。

尽管尚未确定“效应细胞”的准确性质，但是已知这些细胞包括被称为CD8+细胞的T细胞群体。

本文所用的术语“消除”，当涉及使所述“调节细胞”暴露于所述药物时，是指调节细胞的数目和/或活性被所述药物负调节。最优选调节细胞的数目和/或活性被所述药物完全消除。抑制调节细胞产生和/或破坏所述调节细胞的药物

所述药物可以是选择性或非选择性导致破坏调节细胞或抑制所述调节细胞产生的任何因子或疗法。例如，可以用CD4+特异性抗体特异性地靶向CD4+T细胞。然而，在某些情况下，可以使用非选择性药物，例如抗增殖药物或放射疗法，这两种疗法都可以破坏分裂细胞。

术语“抗增殖药物”是本领域众所周知的术语，是指任何破坏分裂细胞或抑制所述细胞进一步增殖的化合物。抗增殖药物包括氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、六甲基-三聚氰胺、塞替派、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链佐星、达卡巴嗪、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、巯嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁、长春碱、脱水长春碱、长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、L-门冬酰胺酶、顺铂、米托蒽醌、羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、氨鲁米特、泼尼松、己酸羟孕酮、醋酸美屈孕酮、醋酸甲地孕酮、己烯雌酚、炔雌醇、他莫昔芬、丙酸睾酮、放射性同位素、蓖麻毒蛋白A链、紫杉醇、白喉毒素和假单胞菌外毒素A。使所述患者接受所述药物的时间选择

如上所述，本发明依赖于这样的观测结果：效应细胞的相对数目在对抗原应答时在调节细胞之前得到扩充。因此，本文所用的术语“效应细胞的活性未被显著降低”是指选择给予所述药物的时间使得所述药物对调节细胞的效应成倍高于对效应细胞的效应。显然所述药物最好在其对调节细胞的效应与对效应细胞的效应之比为最大时给予。

据报道在进行抗病毒治疗后病毒负荷开始下降后，例如感染HIV的患者，当停止治疗后病毒负荷会增加，随后刺激对病毒负荷增加的免疫应答(Oritz等，1999；Kilby等，2000；Lifson等，2000)。因此，可以采用先使所述患者接受抗病毒疗法，然后停止所述疗法，以增加针对逆转录病毒的效应细胞的数目和/或激活所述效应细胞，使靶向调节细胞扩充。

给予所述药物的恰当时间的一个实例可以参考Daar等(1998)所述来确定。该文件提供来源于停止高度积极的抗病毒疗法(也称为HAART)的患者的病毒负荷以及CD8+和CD4+T细胞水平。在病毒负荷开始上升后，当CD8+T细胞达到最大数目时发生病毒负荷降低(肩峰(Shoulder)大约在第225天)，因此可发挥作用(参见Daar等(1998)的图1)。紧接该时间点(几天后，CD8+T细胞开始下降，而在所述下降之后病毒负荷开始稳定。该点(峰值)可以用作参比点，以预测后续调节细胞的克隆扩充，因此是调节细胞消除的干涉点。正是由于病毒负荷停止下降，调节细胞才负调节效应细胞，因而在该点之前应该应用所述药物，即当大多数调节细胞正处于克隆扩充(有丝分裂)时应用所述药物。

在刺激免疫应答之后，可以用本领域已知的技术监测调节细胞生长群。

可以收集系列血样，通过FACS分析定量筛选所有CD4+亚群。必需保持这种FACS监测，直到调节细胞在对所述刺激应答中开始克隆扩充。在大多数情况下，该时间点在患者不同感染阶段凭经验确定，因为其免疫应答动力学可能有所变化。其它可能的测定包括淋巴细胞增殖/活化测定和各种细胞因子水平测定(例如IL-6的测定)。

确定给予所述药物的时间点的另一种方法是监测刺激免疫应答后的病毒负荷。设想病毒负荷由于效应细胞的活性而降低，然而，调节细胞的后续增加将会负调节所述效应细胞，从而导致病毒负荷下降减慢。因此，所述药物可以在病毒负荷下降减慢之前给予。可以用本领域已知的技术例如RT-PCR来监测这些情况下的病毒负荷。

监测可能必须是经常性的，例如每几个小时，以确保选出给予所述药物的准确时间点。

监测最好连续进行，以确定所述药物的作用。在例如大约治疗7天内，调节细胞不完全消除、再次出现或病毒负荷增加意味着应该重复本发明的方法。治疗的这种重复循环可以产生免疫记忆。因此可能重复模式使用的本发明可以提供某些预防性保护效应。抗原多肽

本文所用的“抗原”多肽是任何含有能够产生针对所述逆转录病毒的免疫应答的表位的多肽。通常，所述抗原多肽将包含在大多数逆转录病毒分离物中高度保守的序列。然而，设想可以表征感染个体的特定逆转录病毒，然后产生匹配所述分离物序列的抗原多肽，使有效免疫应答最大化。

有关HIV抗原例如gp120和其它候选物的信息可以在Stott等(1998)中找到。

可以以本领域已知的产生免疫应答的任何方式提供所述抗原多肽。抗原多肽可以是例如天然、重组或合成抗原多肽。这样的抗原多肽包括但不限于负责附着细胞表面受体以起始感染过程的病毒蛋白例如包膜糖蛋白。

天然抗原多肽可以例如通过提供减毒逆转录病毒、热灭活逆转录病毒或任何其它灭活逆转录病毒来制备。

所述抗原多肽可以作为疫苗组合物中的分离多肽来提供。在这种情况下，所述多肽可以从逆转录病毒感染的细胞中纯化出来、可以由重组细胞表达和从重组细胞中分离出来或者用肽合成仪合成生产。

除非另有说明，否则本发明中所用的重组DNA技术都是本领域技术人员熟知的标准技术。这类技术在以下来源的文献中有介绍和解释：例如J.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning，John Wiley和Sons(1984)，J.Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989)，T.A.Brown(编著)，Essential Molecular Biology：A Practical Approach，第1卷和第2卷，IRLPress(1991)，D.M.Glover和B.D.Hames(编著)，DNA Cloning：APractical Approach，第1-4卷，IRL Press(1995和1996)和FM.Ausubel等(编著)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Pub.Associatesand Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止所有的最新资料)，所述文献通过引用结合到本文中。疫苗

疫苗可以用一种或多种逆转录病毒多肽来制备。含有抗原多肽的疫苗制备是本领域技术人员已知的。通常，这样的疫苗制备为注射用制剂或口服制剂，或者为液体溶液剂或者为混悬剂；也可以制备为在注射或口服之前适合于溶于或悬浮于液体的固体形式。也可以将所述制剂乳化，或者使所述蛋白质包囊在脂质体中。通常将所述抗原多肽与药学上可接受的且与所述有效成分相容的载体/赋形剂混合。合适的载体/赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等以及它们的组合物。

另外，如有需要，所述疫苗可以含有少量的辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂和增强所述疫苗作用的佐剂。

本文所用的术语“佐剂”是指非特异性地增强针对抗原多肽的免疫应答的物质。可能有效的佐剂的实例包括但不限于氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和RIBI，RIBI含有用2％鲨烯/Tween 80乳剂从细菌中提取的三种组分：单磷酰脂质A、二分枝菌酸海藻糖(trehalose dimycolate)和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。佐剂的进一步实例包括氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝钾(明矾)、细菌内毒素、脂质X、小棒杆菌(Corynebacterium parvum)(疮疱丙酸杆菌(Propionobacterium acnes))、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、多核糖核苷酸、藻酸钠、羊毛脂、溶血卵磷脂、维生素A、皂苷、脂质体、左旋咪唑、DEAE-葡聚糖、嵌段共聚物或其它合成佐剂。这类佐剂可商业性得自各种来源，例如Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，N.J.)或弗氏不完全佐剂和弗氏完全佐剂(DifcoLaboratories，Detroit，Michigan)。

抗原多肽和佐剂的比例可以在宽范围内变动，只要这两种成分以有效量存在即可。例如，氢氧化铝的存在量可以约为所述疫苗混合物的0.5％(以Al₂O₃浓度计)。传统上，配制所述疫苗以含有抗原多肽的终浓度在0.2-200μg/ml的范围内、优选5-50μg/ml、最优选15μg/ml。

配制后，可以将所述疫苗装在一个无菌容器中，然后密封，低温贮藏，例如贮藏于4℃，或者可以将其冻干。冻干法使其以稳定形式长期贮藏。

所述疫苗可以通过注射例如或者皮下或者肌内注射常规胃肠外给予。适合于其它给药模式的其它制剂包括栓剂，在某些情况下为口服制剂。对于栓剂而言，传统的粘合剂和载体可以包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酯；这样的栓剂可以用含有0.5％-10％、最好是1％-2％范围有效成分的混合物来制备。口服制剂包括这样的常用赋形剂，例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物可为溶液剂、混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释制剂或散剂形式，并且含有10％-95％有效成分、最好是25％-70％有效成分。在所述疫苗组合物被冻干的情况下，冻干物质可以在给药前重建为例如混悬剂。重建最好在缓冲液中实现。

用于口服给予患者的胶囊剂、片剂和丸剂可以肠溶包衣，所述肠溶包衣包含例如Eudragit“S”、Eudragit“L”、醋酸纤维素、醋酸邻苯二甲酸纤维素或羟丙基甲基纤维素。DNA疫苗接种

DNA疫苗接种包括将编码抗原的DNA直接体内引入患者的组织中，供由患者组织的细胞表达所述抗原。这类疫苗在本文中被称为“DNA疫苗”或“核酸型疫苗”。DNA疫苗描述于US 5,939,400、US6,110,898、WO 95/20660和WO 93/19183，所述专利的公开内容通过引用全部结合到本文中。直接注射编码抗原的DNA以诱发保护性免疫应答的能力在多个实验系统中已得到证实(参见例如Conry等，1994；Cardoso等，1996；Cox等，1993；Davis等，1993；Sedegah等，1994；Montgomery等，1993；Ulmer等，1993；Wang等，1993；Xiang等，1994；Yang等，1997)。

迄今为止，哺乳动物系统中的大多数DNA疫苗依赖于来源于巨细胞病毒(CMV)的病毒启动子。这些疫苗在各种各样的哺乳动物种类中在肌肉和皮肤接种时有良好的功效。一种已知影响DNA免疫诱发的免疫应答的因素是给予DNA的方法，例如胃肠外途径可使基因转移的速率低且产生基因表达的相当大的变异性(Montgomery等，1993)。运用基因枪高速接种质粒可增强小鼠的免疫应答(Fynan等，1993；Eisenbraun等，1993)，推定可能是因为DNA转染的效率更高，通过树突细胞呈递抗原的效率更高。含有本发明核酸型疫苗的载体也可通过本领域已知的其它方法导入所需宿主中，所述方法例如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)或DNA载体转运蛋白。来源于转基因植物的疫苗

采用本领域众所周知的方法，可以构建生产逆转录病毒抗原多肽的转基因植物。目前已经对动物和人类病原体开发出许多植物源性可食用疫苗(Hood和Jilka，1999)。用产生病毒样颗粒(VLP)或表现出抗原表位的嵌合植物病毒的转基因植物口服免疫也可以产生免疫应答(Mason等，1996；Modelska等，1998；Kapustra等，1999；Brennan等，1999)。已经提出，这些VLP或嵌合病毒的颗粒形式可以导致所述抗原在胃肠中更高的稳定性，从而有效增加可从肠中摄入的抗原量(Mason等1996，Modelska等1998)。

实施例

为了说明本发明，使用一种小鼠AIDS模型。

在易感小鼠中由LP-BM5小鼠白血病病毒(MuLV)诱发的小鼠AIDS(MAIDS)病理是一种研究逆转录病毒诱导的免疫缺陷机制的有效工具。MAIDS动物模型表现出人类AIDS的许多特征。用LP-BM5感染诸如C57BL/6小鼠的易感品系导致慢性脾大、高丙球蛋白血症且T细胞和B细胞发育免疫缺陷。在体外，存在T-细胞和B-细胞对促有丝分裂或特异性抗原刺激的反应性进行性削弱。在体内，受感染小鼠变得对各种各样的机会生物的攻击越来越敏感，并且可发生B-细胞淋巴瘤。在感染后(pi)8-10周首先观察到死亡，所有小鼠都在24周内死亡(图1)。在免疫功能方面的这些改变反映出在表型和免疫网络所有组分功能方面的复杂变化。1.感染后不同时间给予单剂量长春碱的疗效

在感染后不同时间用单剂量的抗有丝分裂剂长春碱(Vb)进行治疗能够阻止MAIDS的发生/进程。图2显示在感染后的各种时间(6小时至28天的范围内)给予一次6mg/kg i.p.剂量的Vb可影响MAIDS的发生(以感染后10周的平均脾重表示)。显然，Vb治疗是当在感染后6小时或14天时给予时非常好的治疗，100％(10/10)小鼠和74％(20/27)小鼠在感染后10周分别显示无MAIDS发生体征(通过脾重、组织学和FACS分析测定)。在感染后6天治疗的部分小鼠中观察到相似的保护效应(6/13或46％)。虽然没有第14天治疗后观察到的保护作用显著，但是仍然观察到MAIDS发生的中等保护作用。然而，重要的是也注意到，在许多其它时间点例如感染后第2天和第7天进行治疗，都导致不阻止MAIDS发生。在感染后6小时给予Vb的小鼠中观察到MAIDS发生的完全保护并不是意料之外的，因为所述病毒正在有效复制的细胞中复制，所述细胞是抗有丝分裂剂的靶，因此任何感染所述病毒的细胞都将被Vb杀死，从而防止病毒在所述宿主中快速建立感染。然而，在感染后14天用Vb进行一次治疗后观察到的高保护效应是相当显著的，因为到该阶段，病毒感染已很好建立了并且早期发病过程正在进行之中。我们提出这种高疗效可能是由于Vb靶向其扩充期的特定免疫调节细胞亚群所致，从而改变针对所述病毒感染的免疫应答。假设免疫效应细胞的负调节被靶向调节细胞的Vb治疗除去，则因此允许免疫系统的效应细胞更有效地清除所述病毒，甚至可能完全清除所述病毒。2.第14天疗效的进一步表征 2.1.感染后10周Vb治疗小鼠的脾组织学

将来自感染后第14天Vb治疗的小鼠以及受感染对照小鼠和未受感染对照小鼠的脾脏称重，然后进行组织学检查。如先前报道(Hartley等，1989)，所有受MAIDS感染小鼠的脾结构彻底破坏。相反，正常脾重(低于0.25g)的Vb治疗小鼠的脾结构不能与未受感染对照小鼠的脾结构区分开来(图3)。

支持这一组织学数据的是，在感染后第10周，根据对来自感染后第14天Vb治疗小鼠脾细胞FACS分析的初步结果显示，细胞比例(CD4⁺、CD8⁺和B细胞)和分布与正常未受感染小鼠中观测到一致(数据未显示)。2.2.Vb疗法后长期阻止MAIDS发生

为了确定所述受感染小鼠是否完全保护以阻止MAIDS发生或者所述Vb治疗是否仅仅是延迟所述疾病的发生和进程，我们在感染后第14天用Vb治疗小鼠并且等到感染后20周才检查小鼠。该实验结果(图4)表明，80％(4/5小鼠)在感染后20周防止任何脾大，证明第14天Vb治疗方案的作用非常有效。2.3.Vb疗法后不保护病毒再攻击

为了确定感染后第14天Vb治疗防止MAIDS的小鼠是否产生免疫应答，随后保护其后续用MAIDS病毒再攻击，在感染后第14天给予Vb疗法的多组小鼠在Vb治疗后3周或8周用MAIDS病毒再攻击。所述小鼠未被保护病毒再攻击且发生脾大和淋巴结病，表明在20周发生MAIDS(图5)。这并不是预料之外的结果，因为调节细胞群体的显性免疫抑制已被恢复，结果是有针对第二次(未治疗)感染的免疫效应物应答。3.Vb疗法针对CD4⁺细胞3.1.感染后第14天Vb疗法后脾细胞的直接FACS分析

对从感染后第14天用Vb治疗的小鼠的脾脏制备的CD4⁺和CD8⁺T细胞进行FACS分析(图6)。也检查了CD25⁺CD4⁺T细胞，因为它们最近在小鼠自身免疫病模型和小鼠肿瘤免疫学模型中被鉴定为具有重要的调节功能(Takahashi等，1998；Shimizu等，2000)。有可能这些细胞在调节对MAIDS的免疫应答方面可以起作用。给感染后第14天的小鼠和未受感染的对照小鼠Vb疗法，Vb治疗后48小时收集脾脏。数据的分析表明，当所有细胞亚群由于Vb疗法而降低时，未受感染与受感染小鼠比率的比较显示，在受MAIDS感染小鼠中Vb治疗优先靶向的正是CD4⁺T细胞和CD25⁺CD4⁺T细胞。3.2.脾细胞转移实验：Vb疗法针对CD4⁺细胞

先前的实验表明，居留在脾脏的主要免疫细胞亚群(CD4⁺和CD8⁺细胞)全部受Vb治疗的影响，然而，似乎优先靶向CD4⁺细胞，说明这些细胞亚群可以在感染后第14天进行克隆扩充。图7所示实验设计用来确定在感染后第14天给予的单剂量Vb，可消除扩充中的CD4⁺调节T细胞群体，从而除去负调节而释放效应细胞且清除宿主的MAIDS病毒。

小鼠用MAIDS感染，感染后第14天接受Vb治疗，然后接受来自如图7所述制备的供体小鼠过继性转移的～10⁷脾细胞。对于每个实验[命名为(I)、(II)和(III)]而言，每组由7只受体小鼠和9只供体小鼠组成。组I小鼠接受来自尚未接受任何Vb治疗的受感染小鼠全脾。组II小鼠接受来自受染小鼠的全脾细胞制剂，所述受感染小鼠在用荧光染料标记的抗CD4单克隆抗体染色后，用FACS细胞分选器已耗竭CD4⁺细胞。细胞分选导致除去所述脾细胞制剂中CD4⁺细胞的99.5％。组III小鼠接受来自在感染后第14天也接受Vb治疗的受感染供体小鼠的全脾。

用来自受MAIDS感染供体的脾细胞灌注Vb治疗的受MAIDS感染小鼠完全阻止Vb保护小鼠不发生MAIDS(图8)。此外，克服Vb保护效应的脾细胞是CD4⁺细胞，因为当CD4⁺细胞在转移前从供体脾细胞中除去时，通过FACS分选法，Vb的保护效应未被克服。另外，用来自在第14天也给予Vb的受MAIDS感染供体小鼠的脾细胞灌注Vb治疗的受MAIDS感染小鼠显示，这些小鼠被完全保护，不发生MAIDS(图8)。3.3.感染后第14天CD4⁺细胞的体内耗竭导致阻止MAIDS发生

脾转移结果符合以下解释：在感染后第14天，免疫效应细胞与克隆扩充的调节细胞群体(它们是CD4⁺)共存并且Vb根据其破坏后者的能力是一种治疗药。因此，在感染后第14天时间点，CD4⁺细胞的体内耗竭应该模拟Vb的效应。所述实验的流程图示于图9中。5只小鼠为一组的小鼠用MAIDS病毒感染，然后用单克隆抗体治疗，以在感染后第14天耗竭宿主的或者CD4⁺或者CD8⁺T细胞亚群。从抗体生产杂交瘤细胞系上清液收集单克隆抗体，然后通过硫酸铵沉淀纯化。根据一次注射(0.5mg i.p.)适当浓缩的单克隆抗体制剂的体内试验结果表明，CD4⁺细胞减少98％，而CD8⁺细胞减少95％。

显然，在感染后第14天用抗CD4⁺单克隆抗体进行治疗，导致在受感染小鼠中阻止MAIDS发生，从而模拟在感染后第14天Vb注射的效应(图10)。相反，在感染后第14天CD8⁺细胞的体内耗竭并不影响疾病进展。这一结果进一步支持这样的假说：CD4⁺T细胞群体在功能上负调节响应所述病毒感染的免疫效应细胞。另外，显性CD4⁺调节细胞的去除能够使免疫效应细胞对所述病毒感染的应答更为有效，导致疾病进展减慢许多或者也许完全清除其宿主的MAIDS病毒。4.总结

本发明的实施例表明，存在负调节针对MAIDS病毒的免疫应答的“调节”细胞群体，使得所述病毒可以增殖且引起疾病。在感染后适当时间除去所述调节细胞使得效应细胞(例如B细胞和CD8⁺T细胞)可以更有效地清除所述病毒，从而预防疾病发生。提出这些调节细胞控制诸如CD8⁺T细胞和B细胞的细胞的活化和/或功能，该细胞可作为效应细胞起作用，以抵抗病毒感染。

Robert North及其同事应用小鼠T细胞淋巴瘤模型先前研究了通过特异性地消除免疫调节细胞群体来调节免疫应答(North和Awwad，1990)。North提出由于CD4⁺调节T细胞群体负调节免疫应答，因此使免疫原性肿瘤能够建立和生长。这种调节使得不能在引起肿瘤消退的程度上发生免疫应答。值得注意的是，在肿瘤接种后不同时间用单剂量的长春碱(Vb)进行治疗，导致所述肿瘤增加(第10天)或消退(第4、6、13和15天)。North假设所观测到的消退是由于在该时间点CD4⁺调节T细胞的消除所致。在一系列涉及选择性耗竭CD4⁺和CD8⁺T细胞的实验中，所述调节细胞被鉴定为具有CD4⁺表型。

近交小鼠和野生型小鼠的染色体DNA都含有与MuLV核酸探针反应的多拷贝序列。许多MuLV的完全潜在感染性基因组属于这样的序列(Chattopadhyay等，1980)。所有MuLV共享的序列同源性高。我们假设当这些内源MuLV蛋白在发育期间被表达时，它们被免疫系统识别为自身抗原。由于在内源和外源MuLV核酸序列和氨基酸序列之间有高水平的同源性，因此感染MuLV也可以被免疫系统部分识别为自身的，针对所述病毒感染的任何免疫应答都将被负调节，导致缺乏病毒清除且发生疾病。

本领域技术人员将会认识到，在不偏离广义描述的本发明精神或范围的情况下，可以对具体实施方案描述的本发明进行多种变化和/或修改。因此认为本发明的实施方案在所有方面都是说明性的而非限制性的。

以上讨论的所有出版物通过引用全部结合到本文中。

在本发明的说明书中所包括的文件、报告、材料、装置、物品等的任何论述仅用来理解本发明，这并不是承认在本申请每项权利要求的优先权日之前，任何或所有这些主题构成现有技术基础组成部分或者为本发明相关的领域中、尤其在澳大利亚是众所周知的知识。

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Claims (19)

1.一种治疗哺乳动物患者逆转录病毒感染的方法，所述方法包括给予所述患者增加针对所述逆转录病毒的效应细胞的数目和/或激活所述效应细胞的组合物，随后给予所述患者抑制调节细胞产生和/或破坏所述调节细胞的药物，其中选择使得所述效应细胞的活性不被显著降低的时间给予所述药物。

2.权利要求1的方法，其中大约在给予所述组合物作用下CD8+CD4-T细胞数达到峰值时，给予所述药物。

3.权利要求1的方法，其中大约在给予所述组合物后病毒颗粒数已经开始稳定或增加时，给予所述药物。

4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述组合物包含逆转录病毒抗原多肽。

5.权利要求4的方法，其中通过给予包含所述逆转录病毒抗原多肽和药学上可接受的载体的疫苗，使所述逆转录病毒抗原多肽提供给所述患者。

6.权利要求5的方法，其中所述疫苗还包含佐剂。

7.权利要求4的方法，其中通过给予编码所述逆转录病毒抗原多肽的DNA疫苗，使所述抗原多肽提供给所述患者。

8.权利要求4的方法，其中通过食用表达所述逆转录病毒抗原多肽的转基因植物，使所述抗原多肽提供给所述患者。

9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述患者在给予所述组合物之前已接受抗逆转录病毒药物疗法。

10.一种治疗哺乳动物患者逆转录病毒感染的方法，所述方法包括使所述患者接受抗逆转录病毒药物疗法，随后给予所述患者抑制调节细胞产生和/或破坏所述调节细胞的药物，其中在结束所述抗逆转录病毒药物疗法之后给予所述药物并且在逆转录病毒数目方面所产生的扩充已导致针对所述逆转录病毒的效应细胞的数目增加和/或激活所述效应细胞，并且其中选择使得所述效应细胞的活性不被显著降低的时间给予所述药物。

11.权利要求10的方法，其中大约在结束所述抗逆转录病毒药物疗法影响下CD8+CD4-T细胞数达到峰值时，给予所述药物。

12.权利要求10的方法，其中大约在结束所述抗逆转录病毒药物疗法影响下病毒颗粒数达到峰值或者在该峰值之后开始减少时，给予所述药物。

13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述药物选自抗增殖药物、放射疗法和特异性结合CD4+T细胞的抗体。

14.权利要求13的方法，其中所述抗增殖药物选自长春碱和脱水长春碱。

15.权利要求1-14中任一项的方法，其中所述逆转录病毒选自HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2。

16.权利要求1-15中任一项的方法，其中所述方法至少重复一次。

17.权利要求1-16中任一项的方法，其中所述哺乳动物患者是人类。

18.抑制调节细胞产生和/或破坏所述调节细胞的药物在生产用于治疗哺乳动物患者逆转录病毒感染的药物中的应用。

19.权利要求18的应用，其中所述药物选自抗增殖药物和特异性结合CD4+T细胞的抗体。

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