CN1445524A - 基于原子力显微镜的超薄切片厚度的测量方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于原子力显微镜的超薄切片厚度的测量方法，制备包埋块和进行超薄切片选定所需要的片子后，用洁净的铂金环捞取并轻轻浸在清洁云母表面的水滴中，移走铂金环或将铂金环倒扣，使切片飘浮在水面上，再将云母片缓慢烘干，使切片平整地贴附在云母表面，利用原子力显微镜采用接触模式扫描包含切片边缘和云母的区域，实时平面调整参数设为“补偿”，控制温度和湿度，对获得的图像进行平整化处理时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。本发明的方法简单，表面扫描和厚度测量可以同时进行，不会破坏样品的超微结构，所得数据准确。
Description
技术领域：
本发明涉及一种超薄切片厚度的测量方法，特别涉及的是利用原子力显微镜来扫描切片边缘并用软件处理图像，然后测量切片厚度的方法，属于生物工程技术领域。
背景技术：
超薄切片法是一种用于透射电子显微镜 (transmission electron microscope，TEM)观察的生物组织样品的制备方法。利用超薄切片法观察生物组织大体的步骤包括：(1)取材，要求低温下快速操作，尽可能减少机械损伤，材料的体积要小；(2)样品的固定，通常用的是戊二醛和四氧化锇双固定法；(3)脱水，用乙醇或者丙酮梯度脱水；(4)包埋，用国产的环氧树脂618或者进口的Epon812先渗透后包埋；(5)切片，使用超薄切片机切片，选择银白色或铅白色的片子，铜网捞取晾干；(6)染色，通常用铅铀双染色；(7)TEM观察并记录。
对电子显微镜照片的正确解释，必须精确地了解切片的厚度。自从超薄切片技术发明以来，已有不少方法来测量切片的厚度。当切片漂浮在刀槽内的液面上时，可以从切片上反射光的干涉色来估计它的厚度，即用切片的干涉色作为切片厚度的近似指标。Peachy(J.Biophys.Biochem.Cytol.1958，4：233)最早给出了连续的干涉色的颜色和对应切片厚度的关系。但由于用白炽灯观察到的干涉色和用日光灯观察的稍有不同，并且判断颜色的主观性因素也必须予以考虑，因此需要强调，按照干涉色估计切片厚度是不够准确的，特别是需要定量时。
Silverman等(J.Cell Biol.1969，40：768)介绍了一种利用定量电镜(quantitativeelectron microscopy)来测量切片厚度的方法。他们使用一种松散的阴离子交换树脂，磷钨酸染色后作为切片厚度测量的标准。这种方法的优势就是保证了厚度的测量与材料的自身结构密切相关。
Gillis和Wibo(J.Cell Biol.1971，49：947)发明了另一种干涉法来测切片厚度，宣称精确度可以达到1nm。在暴露于电子射线前，这种方法显示出了比较高的精确性和可靠性。
Edie和Karlsson(J.Microscopie 1972，13：13)提供了一种在电镜观察时计算切片厚度的方法。切片厚度由电子束穿过包埋介质之后的衰减程度决定。
上述提到的多种方法都是基于电子显微镜或者为电镜观察做准备的。近年来，随着原子力显微镜(AFM)在生物领域的应用越来越多，其中也有一些是将超薄切片作为研究对象的，利用AFM来研究组织或细胞超薄切片的精细结构，在这种情况下，切片的厚度也是一个很关键的条件，它直接影响切片表面凹凸起伏的程度。但是，从切片上反射光的干涉色来估计切片的厚度是不够准确的，若利用定量电镜的方法又不适合AFM制样的要求。因此，基于AFM的切片厚度测量是一项全新研究，很有必要也十分关键，但目前尚未见有关基于AFM的超薄切片厚度的测量方法的报导。
发明内容：
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于原子力显微镜的超薄切片厚度的测量方法，操作简便，无需配备其它额外装置，不破坏样品表面结构，可以和AFM测量样品表面形貌同时进行。
为实现这样的目的，本发明的技术方案为，制备包埋块和进行超薄切片选定所需要的片子后，用洁净的铂金环捞取并轻轻浸在清洁云母表面的水滴中，移走铂金环或将铂金环倒扣，使切片飘浮在水面上，再将云母片缓慢烘干，使切片平整地贴附在云母表面，利用原子力显微镜采用接触模式扫描包含切片边缘和云母的区域，实时平面调整参数设为“补偿”，控制温度和湿度，对获得的图像进行平整化处理时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。
本发明的方法具体包括如下步骤：
采用现有成熟的超薄切片技术，先制备包埋块和进行超薄切片选择所需要的片子，用洁净的铂金环捞取。
滴15μl超纯水在清洁的云母表面，将铂金环轻轻浸在水滴中，从侧面移走铂金环，使切片飘浮在水面上，或将铂金环倒扣在水面上，切片也会漂浮在水面上。
将云母片置于烘片机上缓慢烘干，使切片平整地贴附在云母表面。烘片机温度控制在40-65℃之间。
利用AFM扫描包含切片边缘和云母的区域，扫描模式为空气中的接触模式，实时平面调整(realtime planefit)参数必须设为“补偿”(offset)，温度控制在25±1℃，湿度控制在40％以下。
对获得的图像进行平整化处理，平整化时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。
本发明在现有超薄切片技术的基础上进行改进，增加了将切片转移到云母表面的步骤，并独创了利用水的张力使薄切片平整地贴附在云母表面的技术。在AFM成像操作过程中，调整参数使其适合扫描台阶式的包含云母和切片边缘的区域，并在平整化处理中采用了特殊办法，即将包含切片的区域排除在外，大大提高了高度测量的可行性和准确性。本发明的方法步骤简单，根据AFM的特点设计，测量厚度和表面扫描可以同时进行，不会破坏样品的精细结构，适用于各种厚度的超薄切片，所得数据准确，误差小。
附图说明：
图1、图2为本发明实施例中制备的样品在AFM(Nanoscope IIIa from DigitalInstrument，Santa Babara，CA)空气中接触模式下观察的图像。图像中亮的部分为切片，暗的部分为云母。所用DI公司提供的离线处理软件(版本号4.42r4)仅对图像作平整化处理。
图1样品为人舌鳞状细胞癌组织切片，切片干涉色为蓝紫色。
图2样品为人舌鳞癌培养细胞Tca8113，切片干涉色为蓝色。
具体实施方式：
实施本发明的方法，需要先将超薄切片贴附在平整的云母表面。首先按一般电镜超薄切片法制备包埋块，包埋液可用国产的环氧树脂618或者进口的Epon812，但样品固定时无需锇酸，也无需块染，因重金属无助于提高分辨率，且锇酸昂贵。超薄切片机切片，用新制备的玻璃刀，半薄切片定位后，选取所需要部位进行超薄切片，刀槽中为超纯水，选择所需要片子，从干涉色可以大致判断该切片厚度。将铂金环在氯仿中很快浸一下然后晾干或者在酒精灯火焰中灼烧冷却后用来捞取切片，切片将会留在铂金环内的水膜上。事先准备新剖裂的云母薄片，将表面碎屑用洗耳球吹去。滴一滴超纯水于云母表面，将铂金环轻轻浸在水滴中，然后从侧面移走铂金环，切片就飘浮在水面上。或者将环迅速倒扣在水滴上，然后取走环，切片也会飘浮在水面上，不过切片面的朝向与刚才的方法正好相反。调烘片机温45～60℃之间，将上述云母片置于烘片机上，缓慢烘干，切片就在水的张力作用下展开，最终平整地贴附于云母表面。将云母表面贴附着的超薄切片置AFM下扫描，模式为空气中的接触模式，实时平面调整(realtime planefit)参数必须设为“补偿”(offset)，温度控制25±1℃，湿度控制在40％以下，扫描范围包含切片边缘和云母的区域。然后对获得的图像进行平整化处理，平整化时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。
实施例1
人舌鳞状细胞癌组织样品取自某医院口腔颌面外科临床手术，以2％戊二醛固定液低温固定1～2小时，或者在冰箱中冷藏过夜。以PBS缓冲液冲洗，乙醇梯度脱水，环氧乙烷置换，环氧树脂618包埋。LKB-2088 V型超薄切片机切片，所用的玻璃刀为LKB-7800制刀机新制备。选择蓝紫色的片子，用本发明的方法收集至云母表面。烘片机温度调至55℃，将云母缓慢烘干。AFM接触模式下观察切片边缘，见图1A。显示切片边缘清晰，作截面测量切片和云母平面的平均相对高度为162.21±0.32nm，如图1B、图1C。
扫描范围：30μm×30μm。
实施例2
实验所选用的人舌鳞癌细胞系(Tea 8113)是某肿瘤生物实验室于1981年建立的，体外培养平均倍增时间为38.8±4h，细胞单层贴壁生长在含10％小牛血清的RPMI 1640培养液中，培养条件为37℃饱和湿度5％CO2和95％的空气2％戊二醛固定，脱水后离心收集，环氧树脂618包埋。切片后用本发明的方法收集蓝色片子，置45℃烘片机上缓慢烘干。AFM接触模式下观察并成像。所得图像见图2A，显示的切片边缘清晰平整，对获得的图像平整化处理后作切面测量切片和云母平面的平均相对高度为211.80±0.34nm，如图2B、图2C。
扫描范围：30μm×30μm。
Claims (1)
1、一种基于原子力显微镜的超薄切片厚度的测量方法，其特征在于制备包埋块和进行超薄切片选定所需要的片子后，用洁净的铂金环捞取，滴15μl超纯水在清洁的云母表面，将铂金环轻轻浸在水滴中，从侧面移走铂金环或将铂金环倒扣，使切片飘浮在水面上，再将云母片置于烘片机上缓慢烘干，使切片平整地贴附在云母表面，烘片机温度控制在40-65℃，利用原子力显微镜扫描包含切片边缘和云母的区域，扫描模式为空气中的接触模式，实时平面调整参数设为“补偿”，温度控制在25±1℃，湿度控制在40％以下，对获得的图像进行平整化处理时将包含切片的区域排除在外，作截面测量切片和云母表面之间的平均相对高度，即为切片厚度。
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