CN1438315A - β－内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶融合基因其表达产物其组合物及其应用 - Google Patents

β－内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶融合基因其表达产物其组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及抗生素耐药酶基因的分离，其融合基因的制备，及耐药酶基因及融合基因表达产物的分离，含有该耐药酶蛋白及融合蛋白的组合物，及其在医学和环境保护中的应用。具体的，本发明涉及β－内酰胺酶，氨基糖苷钝化酶的编码基因的分离，β－内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶融合基因的制备，及其表达产物的分离，含有该耐药酶蛋白融合蛋白的组合物，及其在医学和环境保护中的应用。

Description

β-内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶融合基因 其表达产物其组合物及其应用
发明领域
本发明涉及抗生素耐药酶基因的分离，其融合基因的制备，及耐药酶基因及融合基因表达产物的分离，含有该耐药酶蛋白及融合蛋白的组合物，及其在医学和环境保护中的应用。具体的，本发明涉及β-内酰胺酶，氨基糖苷钝化酶的编码基因的分离，β-内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶融合基因的制备，及其表达产物的分离，含有该耐药酶蛋白融合蛋白的组合物，及其在医学和环境保护中的应用，
涉及抗生素治疗过程中，保护肠道、阴道、口腔、呼吸道等微生态区域的稳定性，消除特定环境，如医疗场所，药厂中药物的污染，以及作为动物源食品的预处理添加剂，以降解其中所含有的抗菌药物。更具体的，本发明涉及β-内酰胺酶，氨基糖苷乙酰基转移酶的编码基因的分离，β-内酰胺酶/氨基糖苷乙酰基转移酶融合基因的制备，该基因及其融合基因表达产物的分离，含有该耐药酶蛋白及融合蛋白的组合物及其在医学和环境保护中的应用。具体而言，保护微生态区域的正常微生态菌群(如阴道、肠道、口腔等)不被治疗药物所杀灭、避免微生态菌群失调所致的抗菌素伴联性疾病(如伪膜性肠炎、阴道炎、口腔炎以及其它亚临床性疾病)，并防止因药物诱导产生耐药菌株、以及其它毒副作用的发生；对某些特定环境(如医疗场所、药厂等)中残留的抗菌药物进行降解与清除，消除抗菌药物所造成的化学性与生物性污染(如环境耐药菌的增加与传播等)，同时，还包括以上述酶制剂作为动物源食品的预处理添加剂，以降解其中所含有的抗菌药物(如人工饲养的动物源食品的预处理等)。
背景技术
1、机体微生态菌群及其耐药性
正常微生物群寄居于机体的体表与体腔内，形成了完整的微生态体系(Microeologic system)。
抗生素治疗已是最常用的医疗防治措施。但是在这一过程中，抗菌药物的代谢是全身性的，即肠道、阴道、口腔、呼吸道等微生态区域也有足以抑制或杀灭其敏感菌株的药物浓度。这些防治药物同样能够大量抑制或杀灭上述区域正常的非致病性菌群，从而导致局部或全身的微生态平衡失调，诱发各种各样的抗菌素伴联性疾病如艰难芽孢梭菌(Clostridium difficile)过度繁殖引发的伪膜性肠炎、抗菌素伴联性腹泻、阴道炎和某些亚临床性疾病等。这些非感染部位对抗菌素敏感的菌群被大量地杀灭，留下了耐药性菌群，今后一旦发生内源性感染，其治疗难度的增加是无法预期的，这是目前严重困扰医学界的难题之一。简言之，在以抗菌素进行预防和治疗期间，抗菌药物对非感染部位的微生态菌群既有大量杀灭而诱发各种并发症的危险，也有使这些区域微生物菌群耐药性大幅度增加的作用。
二.环境微生态菌群及其耐药性
外环境的微生态菌群构成十分复杂，不同区域存在构成各异的微生态环境，其微生物种群的组成和生物学特征不尽相同。例如，在医疗和药厂等特定环境中的微生物群表现出对药物的耐受性高于其它外环境者，主要原因是由于这些区域的抗菌药物残留量高于其它环境。防止医院内感染和减少特定环境中药物的污染已成为全球性的公共卫生和环保问题。
与环境相关的如食品、饲料等也与机体和环境微生态菌群的失调与耐药性形成有着密切的关系，例如，在人工饲养各类动物(如禽类、猪、牛、羊、鱼、鳖、虾、蟹等)的饲料中，大多具有较高含量的不同抗菌药物，因此，这些动物的排泄物中含有大量的耐药性微生物菌群与抗菌药物，既对环境造成了生物性和化学性污染、也引发了环境微生态菌群中的耐药性菌株大量增加，再者，这些饲养性动物一旦加工成食品，因其具有较高含量的抗菌药物，对人体的微生态菌群也构成了平衡失调和耐药性菌株增加的潜在威胁。所以，各种食品、饲料的抗菌药物残留量控制，已是发达国家制定质量标准的主要指标。
三.抗生素耐药酶及其对于抗生素分子的失活作用
然而，任何一种抗生素使用不久，针对此种抗生素的耐药机制随即出现。其中耐药酶是主要机制。
抗菌素耐药酶是以其功能定义的各种酶的统称，通过水解、酯化、乙酰化、磷酰化、核苷化等作用，使抗菌药物分子失去抗菌活性。这类酶可以由质粒介导和染色体编码，具有不同的基因型，同一菌体内可以同时存在不同机制的编码或介导酶，可以是位于菌细胞外层周质区的“胞内酶”，也可以是排泌至菌细胞外的“胞外酶”。
目前已经发现的抗菌素耐药酶主要有：对β-内酰胺类药物有灭活作用的β-内酰胺酶(β-lactamase，BLA)，对氨基糖苷类药物(Aminoglycosides)有灭活作用的某些钝化酶(modifyingenzymes，AME)、如乙酰转移酶(acetyltransferases，AAC)、核苷转移酶(adenylyltransferases或nucteolidyl transferases，AAD)、磷酸转移酶(Phosphotransferases，APH)，对氯霉素有灭活作用的乙酰转移酶(Chloramphenicol acetyltransferases，CAC)；对红霉素(Erythromycin)、林可霉素(Lincomycin)等具有灭活作用的酯化酶(Macrolides esterase，MES)等。
四.现有技术状况
WO 88/07865，A61K 35/74公开了一种药物组合物，其中加入能够产生β-内酰胺酶样活性物质的活大肠埃希菌。该活性菌来源于经体外培养的人类粪便分离株，所用活菌在体外培养能产生β-内酰胺酶，以保护肠道正常菌丛不被β-内酰胺药物破坏，该专利忽略了耐药菌对人体肠道所造成的耐药菌增加、耐药性传播等生物污染问题。
WO 93/13795，A61K 37/54公开了以天然菌株产生的β-内酰胺酶或酰胺酶(amidases)制成肠溶性缓释胶囊，在β-内酰胺类抗菌素治疗期间，用以保护肠道正常菌群和防止药物的毒副作用。
发明内容
一.发明概述及机制
本发明涉及耐药性菌株的筛选，特别是具备β-内酰胺酶，或氨基糖苷钝化酶，特别是氨基糖苷乙酰转移酶活性的耐药性菌株的筛选。来自耐药性菌株的β-内酰胺酶或氨基糖苷钝化酶，特别是氨基糖苷乙酰转移酶的编码基因的分离；含有该编码β-内酰胺酶，及氨基糖苷钝化酶基因的表达质粒及含有β-内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶融合基因的表达质粒的构建及其在受体细胞中的表达，其表达产物的纯化，该表达产物及分离自天然抗性株的耐药酶作为工具酶，在两种及两种以上抗菌素的联合治疗期间，通过耐药酶对非感染部位抗菌药物的水解，乙酰化、磷酸化、核苷化、酯化等作用，使到达这些部位的抗菌药物得到减少或清除。应用于特定外环境，以消除其中的抗菌药物(如医疗场所、药厂等特定区域)。在将含有高剂量抗菌药物人工动物饲料喂养动物加工成食品之前，给予抗菌素耐药酶制剂，以消除其中的抗菌药物。
本发明所涉及的抗菌药物耐药酶，可以是天然菌或重组的工程菌发酵液获取的胞外酶、也可以是发酵后浓集菌获取的胞内酶；还可以是富含这些耐药酶的生物性组织或细胞的提取酶。耐药酶的表达菌株(或生物性组织、或细胞)，可以是天然筛选株，也可以是通过基因工程重组或改造株。其编码基因所表达的酶既可以是染色体酶(Chromosomal enzymes)，也可以是质粒酶(Plasmid enzymes)，酶蛋白表达形式可以是单一的纯化酶，也可以由重组基因所编码的融合酶蛋白形式。(一)β-内酰胺酶及其作用机制
凡能催化水解6-氨基青霉烷酸(6-APA)、7-氨基头孢烷酸(7-ACA)及其N-酰基衍生物分子中内酰胺环的酶，均为β-内酰胺酶。目前为止，在β-内酰胺酶的家族中已发现约200余种亚型(种)。可按多种分类标准对其分类，例如，基于底物轮廓或底物谱、基因编码位置、氨基酸序列、等电点(Isoelectric point，pI)、理化性质等分类，各种分类方法均有应用和引述，例如，按照其底物谱可分为：青霉素酶(penicillnase)、头孢菌素酶(cephalosporinase)、广谱酶(broad-spectrum enzymes)和超广谱酶(extended-spectrum enzymes)；Ambler，RP等根据酶的氨基酸序列差异，将其分为A、B、C、D四种类型：Bush，K等根据底物谱、分子类型、抑制特性等，将其分为1、2、3、4群，其中，2群和3群又可以分成许多亚群，大部分的超广谱酶属于2be群和Ambler A类。简要表述于表1。
                  表1  细菌β-内酰胺酶分类方案Bush-                           被抑制Jacoby-   分子
               优先底物                                 代表酶Medeiros  类型                  CA EDTA群
                                             革兰阴性菌产生的AmpC酶；MIR 1，1    C    头孢菌素               --
                                              MOX 1，CMY 1，BIL 1 LAT 12a    A   青霉素                 +-               革兰阳性菌产生的青霉素酶2b    A   青霉素、头孢菌素       +-               TEM 1，TEM 2，SHV 1
                                              TEM 3-TEM 29，TEM 42，TEM 43，
      青霉素、窄谱和超
                                              TEM 46-TEM 52，SHV 2-SHV 9，PER2be   A   广谱头孢菌素及         +-
                                              1
      单酰胺类
                                              CTX-M1，产酸克雷伯氏菌K1
                                              TEM 3-TEM 41，TEM 44，TEM 45，TRC2br   A   青霉素                 ±-
                                              12c    A   青霉素、羧苄西林       +-               PSE 1，PSE 3，PSE 42d    D   青霉素、氯唑西林       ±-              OXA 1-OXA 21，PSE 2(OXA 10)2e    A   头孢菌素               +-               普通变形菌产生的诱导头孢菌素酶
      青霉素、头孢菌                          阴沟肠杆菌的NMC 1和IMI 1，粘2f    A                          +-
      素、碳青霉烯类                          质沙雷菌的Sme 1
      大部份β-内酰
                                              嗜麦芽假单胞菌的L1，脆弱拟杆菌3a    B   胺类、包括碳青霉       -+
                                              的CcrA，粘质沙雷菌的IMP 1
      烯类
                                              嗜水气单胞菌的CphA，芳香黄杆菌3b    B   碳青霉烯类             -+
                                              的PCM 14     ND  青霉素                 -？              洋葱假单胞菌的青霉素酶注：CA：克拉维酸；EDTA：乙二胺四乙酸；ND：未测定；
目前已经确认的200余种β-内酰胺酶中，理化性质上表现为：分子量范围约为1.3-5.0万道尔顿，等电点(pI)范围约为4.3-0.5，表现出同功酶的特征(如TEM1和TEM2型仅在第39位由赖氨酸取代谷氨酰胺)，酶动力学特征(水解底物的速率服从于V＝Vmax×[S]/Km+[S])，以及酶抑制剂特征等。(二)氨基糖苷类抗菌素及其耐药酶
氨基糖苷类抗菌素的分子结构中都有一个氨基环醇和一个或数个氨基糖分子，由配糖键相连。该类药物可由微生物发酵获取，如链霉菌属发酵产生的链霉素、小单孢菌发酵产生的庆大霉素等等，也有化学合成的如卡那霉素的半合成衍生物丁胺卡那霉素(Amikacin)等，临床广泛应用的达数十种之多，如链霉素(Streptomycin)、卡那霉素(Kanamycin)、庆大霉素(Gentamicin)、妥布霉素(Tobramycin)、丁胺卡那霉素(Amikacin)、新霉菌(Neomycin)、核糖霉素(Ribostamycin)、巴龙霉素(Paromomycin)、福提霉素(Fortimicin)、地贝卡星(Dibekacin)、异帕米星(Isepamicin)、达地米星(Dactimicin)、小诺霉素(Micronomicin)、大观霉素(Spectinomycin)等等。这类抗菌素的性质稳定、抗菌谱广，抗菌机制是作用于细菌体内的核糖体，抑制蛋白质合成，既有抑菌作用，又有强大的杀菌作用。这类药物又称为静止期杀菌剂。
在微生物对该类药物的耐药性机制中，产生钝化酶是重要原因，主要有三类酶，每类酶又包括多种异构酶，总数已高达数十种之多。这些酶在底物谱(或底物轮廓)、pI、分子量、酶活中心的氨基酸序列、编码基因等方面存在一定的差异，但是，在功能上均是通过钝化氨基糖苷类分子中的游离羟基或游离氨基而使药物分子失去抗菌活性，表现为：乙酰转移酶(AAC)-使药物分子中的游离氨基乙酰化，核苷转移酶(AAD)-使药物分子中的游离羟基核苷化，磷酸转移酶(APH)-使药物分子中的游离羟基磷酸化。氨基糖苷类药物主要钝化酶的种类和底物谱见表2，并将上述两类耐药酶的机制综述于表3：
         表2    主要氨基糖苷类钝化酶的种类及其作用底物钝化酶种类    酶标记(异构)                            底物谱乙酰转移酶
          AAC(2’)                 庆大霉素、妥布霉素、奈替米星
          AAC(6’)                 卡那霉素、妥布霉素、丁胺卡那霉素、奈替米星
          AAC(3)                   庆大霉素、妥布霉素、奈替米星、卡那霉素、西索
                                   米星核苷转移酶
          AAD(4’)                 妥布霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素
          AAD(2”)                 庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素、西索米星
          AAD(3”)                 链霉素、大观霉素
          AAD(6)                   链霉素磷酸转移酶
          APH(3’)-I，II，         卡那霉素、新霉素
          III
          APH(3”)                 链霉素
          APH(2”)                 庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、西索米星
          APH(5”)                 核糖霉素
          APH(6)                   链霉素
          APH(2’)                 庆大霉素、丁胺卡那霉素
                 表3  主要抗菌药物的耐药性机制药物类型       主要耐药机制                           耐药酶举例
           耐药酶灭活                             β-内酰胺酶类，如青霉素β-内酰胺类
           青霉素结合蛋白(PBP)的低亲              酶、头孢菌素酶、广谱酶、
          合力                                     超广谱酶等。
          外膜孔蛋白(通道蛋白)变异
          耐药酶灭活                               乙酰转移酶氨基糖苷类    核糖体(靶位)耐受                         磷酸转移酶
          药物转运不当                             核苷转移酶等二.发明详述
菌株
本发明的一方面提供了具有耐药性的菌株。
发明人从临床样本获取的大肠埃希菌(E.coli)、肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)、铜绿假单胞菌(P.aeruginose)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、弗劳地枸椽酸菌(C.freundii)等二十余株多重耐药性抗生素抗性菌株中，筛选出具有高表达的β-内酰胺酶活性或氨基糖苷钝化酶活性菌株，特别是氨基糖苷乙酰转移酶活性的菌株。
多核苷酸
(一)本发明的一个目标是提供编码β-内酰胺酶多肽的多核苷酸，特别是编码此处命名为ESBL的多肽的多核苷酸。
在本发明一个特别优选的实施方案中，所述多核苷酸包括一段陈述于SEQ ID NO：1，的序列，或者其编码基本具有β-内酰胺酶活性的活性多肽的变体。
SEQ ID NO：1的多核苷酸，是来自肺炎克雷伯菌菌株编码超广谱β-内酰胺酶(ESBL)的多核苷酸。
本发明编码β-内酰胺酶多肽的多核苷酸，例如陈述于SEQ IDNO：1的多核苷酸序列，可以通过使用标准的克隆和筛选方法得到，例如使用本发明的肺炎克雷伯菌菌株细胞作为起始材料，从细菌中分离总DNA，用来自部分序列的放射性标记的寡聚核苷酸探测总DNA克隆文库。然后，通过杂交条件，可以辨别出携有与探针DNA同源的DNA的克隆。通过使用按多核苷酸序列设计的测序引物，对经杂交鉴定的单个克隆进行测序，有可能对多核苷酸序列向两个方向进行扩增，以确定全长基因序列。例如，方便起见，使用由质粒克隆制备的变性的双链DNA进行测序。Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONE，A LABORATORYMANUAL)，第二版；冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1989)中对合适的方法进行了描述。
此外，陈述于SEQ ID NO：1的DNA序列，包含编码蛋白质的开放阅读框架，该蛋白质具有陈述于SEQ ID NO：2中的大约氨基酸残基数目，本领域技术人员可以方便地推导其分子量。
本发明提供的一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸包括或者由下面的多核苷酸序列组成：
(a)一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列与SEQ ID NO：1就SEQ ID NO：1全长而言，分别有至少70％同一性，优选有80％同一性，更优选有85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者完全同一；或者
(b)一种编码一种多肽的多核苷酸序列，该多肽与SEQ IDNO：2的氨基酸序列分别就SEQ ID NO：2全长而言有至少70％同一性，优选有80％同一性，更优选至少85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者100％同一。
本发明提供了一种多核苷酸序列，其全长与SEQ ID NO：1的编码序列(开放阅读框架)同一。本发明也提供了一段编码成熟多肽或者其片段的序列本身，以及阅读框架中有另一段编码序列，例如编码前导序列或者分泌序列，前蛋白质序列，或原蛋白质序列，或前原蛋白质序列的序列的编码成熟多肽或者其片段的编码序列。本发明的多核苷酸也包括至少一段非编码序列，例如包括但并不局限于至少一段5’和3’非编码序列，例如转录但并不翻译的序列，终止信号(例如rho-依赖的终止信号和rho-不依赖的终止信号)，核糖体结合位点，Kozak序列，稳定mRNA的序列，内含子，以及多腺苷酸化信号。
多核苷酸序列也可以包含编码额外氨基酸的额外编码序列。例如，可以编码一段有助于纯化融合多肽的标记序列。在本发明的特定实施方案中，标记序列是6xHN标记物，有助于纯化与之融合的多肽序列。
本发明的多核苷酸也包括但不局限于，包含结构基因和控制基因表达的天然结合序列的多核苷酸。
本发明还包括这样的核苷酸序列，其因为遗传密码的简并性而编码SEQ ID NO：2的超广谱β-内酰胺酶多肽的核苷酸序列，换言之，它可以是一段编码SEQ ID NO：2的多肽的序列，该序列是遗传密码简并的结果。
(二)本发明的一个目标是提供编码氨基糖苷钝化酶，特别是乙酰转移酶多肽的多核苷酸，特别是编码此处命名为aaC2的多肽的多核苷酸。
在本发明一个特别优选的实施方案中，所述多核苷酸包括一段陈述于SEQ ID NO：3，的序列，或者其变体。
SEQ ID NO：3的多核苷酸，是来自大肠埃希菌菌株编码乙酰转移酶多核苷酸。
本发明编码乙酰转移酶多肽的多核苷酸，例如陈述于SEQ ID NO：3的多核苷酸序列，可以通过使用标准的克隆和筛选方法得到，例如使用本发明的大肠埃希菌菌株细胞作为起始材料，从细菌中分离总DNA，用来自部分序列的放射性标记的寡聚核苷酸探测总DNA克隆文库。然后，通过杂交条件，可以辨别出携有与探针DNA同源的DNA的克隆。通过使用按多核苷酸序列设计的测序引物，对经杂交鉴定的单个克隆进行测序，有可能对多核苷酸序列向两个方向进行扩增，以确定全长基因序列。例如，方便起见，使用由质粒克隆制备的变性的双链DNA进行测序。Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONE，A LABORATORY MANUAL)，第二版；冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1989)中对合适的方法进行了描述。
此外，陈述于SEQ ID NO：3的DNA序列，包含编码蛋白质的开放阅读框架，该蛋白质具有陈述于SEQ ID NO：4中的大约氨基酸残基数目，本领域技术人员可以方便地推导其分子量。
本发明提供的一种分离出的多核苷酸，该多核苷酸包括或者由下面的多核苷酸序列组成：
(a)一种多核苷酸序列，该多核苷酸序列与SEQ ID NO：3就SEQ ID NO：3全长而言，分别有至少70％同一性，优选有80％同一性，更优选有85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者完全同一；或者
(b)一种编码一种多肽的多核苷酸序列，该多肽与SEQ ID NO：4的氨基酸序列分别就SEQ ID NO：4全长而言有至少70％同一性，优选有80％同一性，更优选至少85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者100％同一。
本发明提供了一种多核苷酸序列，其全长与SEQ ID NO：3的编码序列(开放阅读框架)同一。本发明也提供了一段编码成熟多肽或者其片段的序列本身，以及阅读框架中有另一段编码序列，例如编码前导序列或者分泌序列，前蛋白质序列，或原蛋白质序列，或前原蛋白质序列的序列的编码成熟多肽或者其片段的编码序列。本发明的多核苷酸也包括至少一段非编码序列，例如包括但并不局限于至少一段5’和3’非编码序列，例如转录但并不翻译的序列，终止信号(例如rho-依赖的终止信号和rho-不依赖的终止信号)，核糖体结合位点，Kozak序列，稳定mRNA的序列，内含子，以及多腺苷酸化信号。
多核苷酸序列也可以包含编码额外氨基酸的额外编码序列。例如，可以编码一段有助于纯化融合多肽的标记序列。在本发明的特定实施方案中，标记序列是6xHN标记物，有助于纯化与之融合的多肽序列。
本发明的多核苷酸也包括但不局限于，包含结构基因和控制基因表达的天然结合序列的多核苷酸。
本发明还包括这样的核苷酸序列，其因为遗传密码的简并性而编码SEQ ID NO：4的氨基糖苷乙酰转移酶多肽的核苷酸序列，换言之，它可以是一段编码SEQ ID NO：4的多肽的序列，该序列是遗传密码简并的结果。
多肽
(一)本发明一方面提供了肺炎克雷伯菌的超广谱β-内酰胺酶(ESBL)多肽，以及其基本具有β-内酰胺酶活性的变体。
本发明进一步提供了：
(a)一种分离出的多肽，或其基本具有β-内酰胺酶活性的片段，该多肽包含一段氨基酸序列，这段氨基酸序列与SEQ ID NO：2有至少70％同一性，优选有80％同一性，更优选有至少85％同一性，更优选有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或者完全同一；
(b)一种由分离出的多核苷酸编码的多肽，或其基本具有β-内酰胺酶活性的片段，该多核苷酸包含一段多核苷酸序列，这段多核苷酸序列与SEQ ID NO：1，就SEQ ID NO：1全长而言，分别有70％同一性，优选有80％同一性，更优选有至少85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者完全同一；
(c)上述多肽的变体，即通过保守氨基酸置换而与原多肽不同的多肽，由此一个残基被另一个具有相似特性的残基所置换。典型的这种置换发生在丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸之间；丝氨酸和苏氨酸之间；酸性残基天冬氨酸和谷氨酸之间；天冬酰胺和谷氨酰胺之间；以及碱性残基赖氨酸和精氨酸之间；或者芳香族残基苯丙氨酸和酪氨酸之间。
优选的片段包括，例如包含部分SEQ ID NO：2氨基酸序列或其变体的截断多肽，例如一系列包含氨基-和/或羧基-末端氨基酸序列的残基。由宿主细胞或者在宿主细胞中产生的本发明多肽的降解形式也是优选的。
特别优选的是其中的几个，5-10，1-5，1-3，1-2或1个氨基酸以任意组合被置换、删除或者添加的变体。
本发明的多肽，可以以“成熟的”蛋白质形式存在或者以其例如前体形式存在。包含一段额外的氨基酸序列常常是有利的，这种额外的氨基酸序列包括分泌或者前导序列，原序列(pro-sequence)。
本发明的多肽可以用任何合适的方式制备。这样的多肽包括分离出的天然存在的多肽，重组产生的多肽，合成产生的多肽，或者这些方法结合产生的多肽。制备这些多肽的方法在本领域是熟知的。
其中的几个，少数，5-10个，1-5个，1-3个，2个，1个氨基酸或没有氨基酸，以任意组合被置换、修饰，删除和/或添加。其中特别优选的是不改变ESBL多肽的性质和活性的沉默置换、删除和添加。
(二)本发明一方面提供了大肠埃希菌菌株的氨基糖苷乙酰转移酶多肽，以及其变体。
本发明进一步提供了：
(d)一种分离出的多肽，或其基本具有氨基糖苷乙酰转移酶活性的片段，该多肽包含一段氨基酸序列，这段氨基酸序列与SEQ IDNO：4有至少70％同一性，优选有80％同一性，更优选有至少85％同一性，更优选有至少90％的同一性，更优选至少95％的同一性，最优选至少97-99％的同一性或者完全同一；
(e)一种由分离出的多核苷酸编码的多肽，或其基本具有氨基糖苷乙酰转移酶活性的片段，该多核苷酸包含一段多核苷酸序列，这段多核苷酸序列与SEQ ID NO：3，就SEQ ID NO：3全长而言，分别有70％同一性，优选有80％同一性，更优选有至少85％同一性，更优选至少90％的同一性，甚至更优选至少95％的同一性，更优选至少97-99％的同一性或者完全同一；
(f)上述多肽的变体，即通过保守氨基酸置换而与原多肽不同的多肽，由此一个残基被另一个具有相似特性的残基所置换。典型的这种置换发生在丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸之间；丝氨酸和苏氨酸之间；酸性残基天冬氨酸和谷氨酸之间；天冬酰胺和谷氨酰胺之间；以及碱性残基赖氨酸和精氨酸之间；或者芳香族残基苯丙氨酸和酪氨酸之间。
优选的片段包括，例如包含部分SEQ ID NO：4氨基酸序列或其变体的截断多肽，例如一系列包含氨基-和/或羧基-末端氨基酸序列的残基。由宿主细胞或者在宿主细胞中产生的本发明多肽的降解形式也是优选的。
特别优选的是其中的几个，5-10，1-5，1-3，1-2或1个氨基酸以任意组合被置换、删除或者添加的变体。
本发明的多肽，可以以“成熟的”蛋白质形式存在或者以其例如前体形式存在。包含一段额外的氨基酸序列常常是有利的，这种额外的氨基酸序列包括分泌或者前导序列，原序列(pro-sequence)。
本发明的多肽可以用任何合适的方式制备。这样的多肽包括分离出的天然存在的多肽，重组产生的多肽，合成产生的多肽，或者这些方法结合产生的多肽。制备这些多肽的方法在本领域是熟知的。
其中的几个，少数，5-10个，1-5个，1-3个，2个，1个氨基酸或没有氨基酸，以任意组合被置换、修饰，删除和/或添加。其中特别优选的是不改变AAC多肽的性质和活性的沉默置换、删除和添加。
融合蛋白
另一方面，本发明涉及遗传工程制备的包含本发明多肽或者其片段的融合蛋白，这些蛋白质可以化学结合，也可以作为重组融合蛋白表达，融合蛋白与非融合蛋白相比，可以增加在表达系统中的产量。
在本发明的一个实施例中，该融合蛋白通过遗传工程制备，具体而言，发明人构建了包含氨基糖苷乙酰转移酶及超广谱β-内酰胺酶编码基因的表达载体，通过将此载体转化宿主细胞，通过本领域技术熟练者熟知的方法制备本发明的重组多肽。
组合物
本发明也涉及这样的组合物，该组合物包含此处讨论的抗生素抗性菌和/或多核苷酸和/或多肽。例如，这种组合物包括，治疗有效量的本发明的抗生素耐药菌和/或多肽和/或多核苷酸以及可药用载体或者赋形剂。
本发明药物组合物可以以任何有效方便的方式给药，例如其中包括局部用药，口服，肛门用药，阴道用药，静脉内用药，腹膜内用药，肌内用药，皮下用药，鼻内用药或皮内用药途径，其形式可以是常用的无毒性的药物上可接受的载体混合制成片剂、丸剂、胶囊、栓剂、溶液、乳剂、混悬剂、注射剂、软膏、涂抹剂、滴眼液、洗剂、凝胶、霜剂和任意其它适用的剂型等等。这种载体可以包括但是不局限于盐水，缓冲液，葡萄糖，水，甘油，乙醇和它们的混合物。制剂应当适合用药的方式。
本发明的环保制剂包括液态、固态、粉剂、微胶囊剂、颗粒制剂。就其属性而言，包括消毒剂、清洗剂等。
本发明的化合物可以组合药学上可接受的缓释基质例如生物可降解性聚合物以形成缓释制剂。缓释基质选自生物可兼容性材料例如脂质体、聚丙交酯(聚乳酸)、聚乙交酯(羟基乙酸的聚合物)、聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和羟基乙酸的共聚物)聚酸酐、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、多氨基酸、氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、多核苷酸、聚乙烯基丙烯、聚乙烯吡咯烷酮和硅酮。优选的生物可降解性基质是聚丙交酯和聚乙交酯之一或者为聚丙交酯-共-乙交酯(乳酸和羟基乙酸的共聚物)。
局部给药方式包括给药至皮肤、粘膜和肺以及眼睛的表面。局部给药的组合物包括吸入剂，可以制备成干粉，所述干粉可以高压密封，也可以不加压。如果是对眼局部给药，本发明的化合物在可药用的眼用载体中释放，可药用的眼用载体包括例如软膏、植物油或胶囊包封材料。
本发明的化合物可以加压密封，并含有压缩气体例如氮气和夜化气体抛射剂。液化抛射剂基质和真正的总组合物优选这样的形式：活性成分不在非常大的程度上溶解。该加压密封的组合物还可以含有表面活性剂例如液体或固体非离子表面活性剂或者可以是固体阴离子表面活性剂。优选应用钠盐形式的固体非离子表面活性剂。
直肠或阴道给药组合物优选栓剂，其制备方式是：将本发明的化合物同合适的非刺激性载体或辅料例如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡，它们在室温下为固体，但在体温下为液体，因此在直肠或阴道中溶解，释放出活性化合物。
阴道给药组合物还优选泡腾剂。其制备方式是：将本发明的化合物同合适的非刺激性载体或辅料及发泡剂，如碳酸氢钠等在阴道环境下产生气泡的药剂混合。
本发明的组合物还含有助剂、稳定剂、增稠剂、增溶剂和着色剂以及香料。优选的，含有酶稳定剂。
附图说明
图1描述机体与环境微生态菌群的保护、耐药性菌群，及其相互之间的关系。
图2描述本发明所涉及的技术路线。
图3表达载体质粒图谱说明：pPROTet.E 6×HN是Clontech公司产品，为融合蛋白原核表达系统。Plteto-1：杂合型启动子-操纵子；RBS：核糖体结合位点；6×HN：表位标志序列；EK site：肠激酶酶切位点；T1：转录终止序列；ColE1：复制起始子；t0：转录终止序列；Cmr：氯霉素耐药基因。该系统优点：具有强效顺式作用元件Plteto-1；融合蛋白中的6×HN tag可易被商品化的免疫亲和层析试剂分离纯化；可利用肠激酶得到天然蛋白；具有Cmr基因。
图4、表达产物的SDS凝胶电泳照片。
以下实例是用标准技术进行的，这些技术，除了另外详细描述的以外，对于本领域技术人员来说都是熟知的和常规的。实施例是说明性的，但是不限制本发明。
实施例1
1、具有β-内酰胺酶活性肺炎克雷伯菌的筛选
用E-Test方法(E-试验试剂盒为瑞典AB Biodisc.Co.产品)对40株β-内酰胺酶和乙酰转移酶阳性的多重耐药性临床分离菌株进行筛选，从病人样本分离到肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)菌株，发酵扩增并分离了部份BLA(参考文献：Edited byV.Lorian.Antibioticin Laboratory Medicine.2nd.Williams &Wilkins，Baltimore，1986，陆永绥、陈秀枢等，六种β-内酰胺酶定性试验方法评价及其临床应用，中华医学检验杂志1993.16：328；孙长贵、陈汉美等，评价三种筛选方法检测超广谱β-内酰胺酶及其临床应用，中华医学检验杂志1999.22：228))，评价其底物谱与酶的比活力。结果证明，同一菌株可以表达不同的酶型，不同酶型之间的底物谱及其水解能力存在一定的差异。见表6。
     表6、四类底物谱命名的β-内酰胺酶底物谱与活力底物              青霉素酶         头孢菌素酶     广谱酶    超广谱酶Penicillin           2+                1+           3+         3+Oxacillin            1+                -            1+         3+Carbenicillin        1+                -            1+         3+Cephalothin          1+                3+           2+         2+Cefuroxime           -                 -            1+         2+Cefotaxime           -                 -            1+         2+Moxalactam           -                 -            -          2+Aztreonam             -             -            1+         1+Imipenem              -             -            -          3+
注：“1+”：代表以各种药物为底物、酶活力近似为1,000 IU/mg酶蛋白；国际单位定义为37℃、pH4.0-8.5的条件下，每分钟水解或灭活1μmol底物为一个单位。
实施例2
酶在体内灭活β-内酰胺药物及其保护正常微生物菌群的效力，
9只日本大耳白家兔，分三组(3只/组)。空白组：不给药，给予等体积的无菌生理盐水；对照组和试验组分别静脉大剂量(0.3克/kg体重)给予头孢氨噻肟(Cefotaxime)，每日两次，连续三天；试验组在使用抗菌素的同时，立即直肠给予β-内酰胺酶制剂(为 广 谱和超广谱酶的混合制剂)；三组受试兔同样条件饲养与护理，于用药当日起，每天采粪样作肠道厌氧菌总数和肠杆菌总数的定量分析，连续四日；结果证明：试验组与空白组之间菌群总数定量结果差异不显著(P＞0.05)；而对照组菌群总数定量明显减少，与试验组和空白组相比，差异非常显著(P＜0.01)；上述结果证明，β-内酰胺酶混合酶制剂在药物治疗期具有显著的保护肠道菌群与微生态平衡的作用。
实施例3. 具有氨基糖苷类药物钝化酶活性的大肠埃希菌菌株的 分离
用E-Test方法对40株β-内酰胺酶和氨基糖苷酶阳性的多重耐药性临床分离菌株进行筛选，从临床样本中分离大肠埃希菌菌株，发酵扩增，分离获取了乙酶转移酶(AAC)、核苷转移酶(AAD)和磷酸转移酶(APH)，对其体外灭活该类抗菌药物的能力进行实验，结果见表7。
表7、三种氨基糖苷类药物钝化酶不同型别的底物谱
                     抗       菌       药        物酶型         庆大霉素       卡那霉素        妥布霉素      丁胺卡那霉素
       (Geniamicin)    (Kanangcin)    (Tobramycin)      (Aamikacin)乙酰转移酶AAC(2’)              2+             -             +           -AAC(6’)              -              2+            +           2+AAC(3’)              3+             2+            2+          2+核苷转移酶AAD(4’)              -              2+            2+          2+AAD(2”)              2+             2+            2+          ±磷酸转移酶APH(3’)              -              2+            -           +APH(2’)              2+             +             -           2+
注：“1+”：代表以各种药物为底物、酶活力近似为500 IU/mg酶蛋白；单位定义同表6。
实施例4
酶在体内灭活氨基糖苷类药物及其保护正常微生物菌群的效力，
为了评价该类酶在体内灭活氨基糖苷类药物的能力，我们以 三组 酶(AAC、AAD、APH)的混合酶制剂(包括不同类型)，对9只日本大耳白家兔进行平行对照试验，分三组(3只/组)。设空白组：不给药，给予等体积的生理盐水；对照组：给药，但不给予酶制剂；试验组：给药后立即直肠给予酶制剂；给予药物为丁胺卡那霉素(Amikacin)、静脉给药，每次2片，剂量为0.3克/kg体重，连续三天，于用药当日起，每日采集粪样作肠杆菌总数定量计数，连续四日。结果证明：对照组与空白组、试验组相比，肠杆菌总数非常显著地减少(P＜0.01)，说明：静脉给药已导致肠道的肠杆菌被大量被杀灭；而试验组和空白组之间肠杆菌总数相差不显著(P＞0.05)，说明：酶制剂对静脉用药后的肠道菌群具有显著地保护作用。
实施例5：从耐药菌肺炎克雷伯菌菌株分离超广谱β-内酰胺酶ESBL基因
1.从耐药菌肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)菌株提取总DNA(参考文献：《精编分子生物学实验指南》，科学出版社，1999：39页)。
2.用于扩增超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因的引物的设计：
根据美国gene bank of 027199 Kebsiella pneumoniae plasmidpkk50-2 EXTEND3ED SPECTRUM BETA-LACTAMATASE(BLAtem-52)genecompletete cds公布的信息，设计了以下一对引物：
上游引物：218-239
5’GGT
Figure A0210503800221
GGTGGCGGCGGATCTAGTATTCAACATTTTCGTGTCG 3’
(g gatcc)BamHI中间接头(link)
下游引物：1040-1062
3’CGACTCTATCCACGGAGTGACTA
Figure A0210503800222
TCTAGAGCA 5’
           XbaI(t ctaga)
其中，下划线的碱基表示限制性内切酶位点。
3.经PCR扩增获得超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因
取1微克步骤1中获得的DNA，按照Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONE，ALABORATORY MANUAL)，第二版；冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1989)的方法扩增ESBL基因。
实施例6：从大肠埃希菌(Escherichia coli.)菌株分离氨基糖苷乙酰转移酶aacC2-Link基因。
1.从大肠埃希菌(Escheri chia coli.)菌株分离总DNA，
2.根据美国gene bank  gi|45769|emb|X54723.1|PRAACC2 E.coliR-plasmid aacC2 gene for
       aminoglycos ide-(3)-N-acetyl transferase
设计用于扩增氨基糖苷乙酰转移酶aacC2基因的引物：aacC2-Link
上游引物：822-843：5’ACGC
Figure A0210503800223
CATACGCGGAAGGCAATAACGG3’
                 SalI(g tcgac)
下游引物：1657-1679：
3’CGAGAACGCTCGGAAGTCCAATCCCACCGCCACCTAGACCGCCACCA CCA 5’
      中间接头(link)                   BamHI
其中，连接aacC2和ESBL的中间接头是一含15个氨基酸的短肽(Gly4Ser)3，在其编码序列5′GGTGGCGGTGGATCTGGCGGTGGT GGTGGCGGCGGATCT3′中后部。设计出一个BamHI位点，(利用简并性)aacC2-Link下游引物和ESBL上游引物的合成均起始于此位点
4.经PCR扩增获得氨基糖苷乙酰转移酶aacC2-Link基因
取1微克步骤1中获得的DNA，按照Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等，在分子克隆：实验手册(MOLECULAR CLONE，ALABORATORY MANUAL)，第二版；冷泉港实验出版社，冷泉港，纽约(1989)的方法扩增aacC2基因。
实施例7：具有超广谱β-内酰胺酶和氨基糖苷乙酰转移酶活性的融合蛋白的生产
1.质粒pPaacC2-L的构建
将aacC2-link的SalI/BamHI酶切产物与pPROTet.E的BamHI/SalI酶切产物(大片段)按正确的读码框进行连接.
2构建质粒pPALE
将重组质粒pPaacC2-L再进行BamHI/XbalI酶切，将其大片段与ESBL的BamHI/XbalI酶切产物进行连接，构建质粒pPALE。
实施例8：融合蛋白的原核表达
将pPALE质粒转化宿主菌DH5aPRO E.coli(Clontech公司产品)-，以LB+氯霉素(20微克/毫升)进行抗性筛选.选获高效表达菌，命名为CWL888。通过发酵、色谱纯化(Clontech公司产品TALONTMPurification Kit(#K1253-1)获得纯品(见图8)，纯化融合蛋白的分子量为65 KD、等电点为(pI)7.8、氨基酸序列如下述。该重组性融合酶以氨苄青霉素、丁胺卡那霉素为底物的比活分别为≥2,000IU/mg酶蛋白和≥1,000 IU/mg酶蛋白。
实施例9：超广谱β-内酰胺酶ESBL基因的测序
测序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer，以5’&3’PROTetSequencing Primers为测序引物，序列见SEQ ID No：1。
实施例10：AAC基因的测序
测序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer，5’& 3’PROTetSequencing Primers为测序引物，序列见SEQ ID No：3。
实施例11：本发明的融合基因的测序
测序采用ABI PRISM377 DNA Sequencer，5’& 3’PROTetSequencing Primers为测序引物，序列见SEQ ID No：5。实施例12.500mg的肠溶性胶囊，每个胶囊含有：
融合蛋白(BLA+AAC)                                4mg
胰蛋白酶抑制剂                                   120mg
低聚果糖(FOS)                                    350mg
硬脂酸镁                                         26mg实施例13.500mg的阴道泡腾片，每片含有：
融合蛋白(BLA+AAC)                                2mg
胰蛋白酶抑制剂                                   18mg
硼酸                                             120mg
碳酸氢钠                                         60mg
低聚果糖(FOS)                                    200mg
硬脂酸镁                                        100mg实施例14.500mg的阴道泡腾片，每片含有：
BLA                                              1mg
AME                                              1mg
胰蛋白酶抑制剂                                   18mg
硼酸                                             120mg
碳酸氢钠                                         60mg
低聚果糖(FOS)                                    200mg
硬脂酸镁                                         100mg实施例15.20％微胶囊(microcapsulation)颗粒剂(颗粒直径1.0-2.5mm)，含：
融合蛋白(BLA+AAC)                            20g
酶蛋白酶抑制剂                               30g
硬脂酸镁                                     50g实施例16.20％微胶囊(microcapsulation)颗粒剂(颗粒直径1.0-2.5mm)，含：
AME                                          20g
酶蛋白酶抑制剂                               30g
硬脂酸镁                                     50g实施例17.20％微胶囊(microcapsulation)颗粒剂(颗粒直径1.0-2.5mm，含：
BLA                                          10g
AME                                          10g
酶蛋白酶抑制剂                               30g
硬脂酸镁                                     50g实施例18.急性经口毒性试验一、材料和动物
1.受试物：实施例14的阴道泡腾片，样品为浅乳黄色粉状。
2.动物：ICR小白鼠20只，体重18-22g，由昆明医学院省重点天然药物药理试验室提供(动物合格证号：滇实动证第9806号)。二、方法
1.检验依据：《消毒技术规范》第三版第一分册3.4急性经口毒性试验。
2.试验方法：取20只动物，雌雄各半，灌胃前动物禁食12h，一次经口灌胃，连续观察14天，记录动物中毒症状及死亡情况。三、试验结果：
             阴道泡腾片对小鼠急性经口毒性试验结果动物性别            剂量         动物数         死亡动物数        死亡率
             (mg/kg.bw)       (只)             (只)            (％)
雌              5000           10                0              0
雄              5000           10                0              0
受试动物在观察期间，未见动物有明显中毒症状，未见死亡。半数致死量LD50＞5000mg/kg.bw四、结论
在本实验条件下，受试物阴道泡腾片对受试动物小白鼠急性经口毒性试验按急性毒性LD50剂量分级标准判定为实际无毒。
实施例19眼刺激试验一、材料和动物
1.受试物：实施例14的阴道泡腾片，样品为浅乳黄色粉状。
2.动物：日本大耳白兔4只，雌雄各半，体重2.4kg-2.8kg，由昆明医学院提供，合格证号：云动管第9903号。二、方法
1.检验依据：《消毒技术规范》第三版第一分册3.7眼刺激试验。
2.方法：取受试物0.1g湿润后置于受试动物一侧眼结膜囊内，使眼被动闭合4s，用生理盐水冲洗5min。于滴眼后6h、24h、48h、4d、7d用肉眼观察动物眼结膜、虹膜和角膜的损伤和恢复情况。另一侧眼作为正常对照。三、实验结果
             阴道泡腾片对大白兔眼睛刺激试验结果动物  观察                                  眼刺激性反应积分编号  部位       6h          24h         48h        72h          4d          7d
         样品  对照  样品  对照  样品  对照  样品  对照  样品  对照  样品  对照
  角膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  虹膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     01
  结膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  总分    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  角膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  虹膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     02
  结膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  总分    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  角膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  虹膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     03
  结膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  总分    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  角膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  虹膜    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     04
  结膜    4     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0
  总分    4     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0各时间积分指  1     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0数染毒后前7天最高积分指数                  1四、结论
在本试验条件下，受试物阴道泡腾片对大白兔眼刺激试验按眼刺激强度评价标准判定为无刺激性。
实施例20皮肤刺激试验一、材料和动物
1.受试物：实施例14的阴道泡腾片，样品为浅乳黄色粉状。
2.动物：日本大耳白兔4只，雌雄各半，体重2.1kg-2.4kg，由昆明医学院提供，动物合格证号：云动管第9903号。二、方法
1.检验依据：《消毒技术规范》第三版第一分册3.6皮肤刺激试验。
2.试验前24h，将大白兔背部脊柱两侧的毛剪掉，去毛范围约3×3cm2。取受试物0.5g直接涂抹于预先润湿的一侧皮肤上。用洁净纱布覆盖，再用无刺激性胶布固定。另一侧为空白对照。4h后取掉纱布，用温水除去残留受试物，于除去受试物后1h、24h、48h观察皮肤局部反应，进行刺激反应评分。三、实验结果
              阴道泡腾片对家兔皮肤一次刺激反应评分
动物编号 体重kg              1h            24h           48h
  样品红斑  水肿     对照红斑   水肿     样品红斑  水肿   对照红斑  水肿   样品红斑  水肿     对照红斑  水肿
 1 ♀ 2.1   0    0   0     0   0    0   0    0   0    0   0    0
 2 ♀ 2.4   0    0   0     0   0    0   0    0   0    0
 3 ♂ 2.1   0    0   0     0   0    0   0    0   0    0
 4 ♂ 2.2   0    0   0     0   0    0   0    0   0    0
总积分均值   0    0        0     0   0    0        0    0   0    0
在观察期间，试验动物经受试物作用部位未见红斑，水肿和其它毒性作用。四、结论
在本实施条件下，受试物阴道泡腾片对受试动物大白兔皮肤刺激试验按皮肤刺激强度分级判定为无刺激性。实施例21  小鼠髓嗜多染红细胞微核试验一、材料和动物
1.受试物：实施例14的阴道泡腾片，样品为浅乳黄色粉状。
2.阳性物：环磷酰胺。由上海华联制药有限公司生产。
3.动物：昆明种小白鼠，由中科院昆明动物研究所提供(动物合格证号：滇实动证第9712号)。二、方法
1.检验依据：《消毒技术规范》第三版第一分册3.11.4小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验。
2.试验方法，选用体重25-30g小白鼠50只，随机分为5组，每组10只，雌雄各半。设3个剂量组和阴性对照组及阳性对照组(环磷酰胺40mg/kg.bw)，采用30h二次灌胃法，于第二次染毒后6h取材，用小牛血清冲洗骨髓腔，常规制片染色镜检，每只小鼠计数1000个嗜多染红细胞(PCE)中微核细胞数，计算不同性别动物微核率。三、试验结果：
          阴道泡腾片小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验结果
    剂量mg/kg.bw 试验动物数(只)   性别 观察PCE细胞数(个) 微核细胞数(个) 微核细胞率‰
阴性对照 10     ♂     5000     6     0.12
    ♀     5000     6     0.12
1250 10     ♂     5000     4     0.08
    ♀     5000     2     0.04
2500 10     ♂     5000     5     0.10
    ♀     5000     4     0.08
5000 10     ♂     5000     2     0.04
    ♀     5000     2     0.04
阳性对照 10     ♂     5000     127     2.54
    ♀     5000     121     2.42
采用X2检验对结果进行统计，各剂量组微核细胞率与阴性对照组比较差异无显著性，p＞0.05，各剂量组间无剂量反应关系。四、结论
在本试验条件下，受试物阴道泡腾片对小鼠骨髓嗜多染红细胞无致微核作用。
                                序列表<110>陈秀枢<120>β-内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶基因，其融合基因及表达产物，
 其组合物，在医学及环境保护中的应用<130><140><141>2002/02/11<160>6<170>Patentln Vers.2.0<210>1<211>1620<212>DNA<213>肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)<220><221>CDS<222>(84)..(1559)<400>11 ataaaattct tgaagacgaa agggcctcgt gatacgctta tttttatagg ttaatgtcat
    61  gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc
   121  tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg
   181  gtaaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt ttcgtgtcgc
   241  ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt
   301  gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct
   361  caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac
   421  ttttaaagtt ctgctatgtg gtgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact
   481  cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttaag tactcaccag tcacagaaaa
   541  gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga
   601  taacactgct gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt
   661  tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga
   721  agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gacgcctgca gcaatggcaa caacgttgcg
   781  caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat
   841  ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat
   901  tgctgataaa tctggagcca gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc
   961  agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga
   1021 tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc<210>2<211>268<212>PRT<213>肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)<400>2MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVKYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTTPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGASERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW<210>3<211>1620<212>DNA<213>大肠埃希菌(E.coli)<220><221>CDS<222>(84)..(1559)
 1 tttggtactc tcagaatacc cttttgagtt cgtttttgtg ccaacagaac agcccgtagg
61   taaatctcgg agcatttcag gaagtgtctg tgtgagttga atctgaatggcagttaatat
121  tttagtggtc aaggtcttag gcgagttgaa tgcagggcga cctcgttttttggcaggcgg
181  ttttacaaca ggagggagaa ctattttctc aacaccttcg cgtgctggaatcatggttgc
241  atcacggact aatatgaccg attaacgtat ccgcaagatt ggacttcaccatctgctcat
301  gaacgcgagt ggttagttta cgcgctgcaa attcagcaaa aacacggctaaatgtccctt
361  cgctgggtag ttttttatac agattgaagc cgcaaattcg ccgcaatctacgatcaactt
421  ctaggcgttc aatcaagccc cgtgtggtga cgataccaag ttcagcttttgcaataaaag
481  gcacatgcca aagcgcagcg gtcagcagga ggtcttccca cagcacacccttgatattgg
541  tataccaagg attcgatgtc actccactcg agcacacgaa taatgcgttcgagctttgag
601  ctgatgccgt cctaaatcgg ctgcgactaa aggaataagt tcgtattgtaaggcttgaaa
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901  ttaaagcgat tggtccggtc gaaggaggag cggagacggt cgttgccgcgttacgctccg
961  cggttgggcc gactggcact gtgatgggat acgcatcgtg ggaccgatcaccctacgagg
1021 agactcgtaa tggcgctcgg ttggatgaca aaacccgccg tacctggccgccgttcgatc
1081 ccgcaacggc cgggacttac cgtgggttcg gcctgctgaa tcagtttctggttcaagccc
1141 ccggcgcgcg gcgcagcgcg caccccgatg catcgatggt cgcggttggtccactggctg
1201 aaacgctgac ggagcctcac aagctcggtc acgccttggg ggaagggtcgcccgtcgagc
1261 ggttcgttcg ccttggcggg aaggccctgc tgttgggtgc gccgctaaactccgttaccg
1321 cattgcacta cgccgaggcg gttgccgata tccccaacaa acggcgggtgacgtatgaga
1381 tgccgatgct tggaagcaac ggcgaagtcg cctggaaaac ggcatcggattacgattcaa
1441 acggcattct cgattgcttt gctatcgaag gaaagccgga tgcggtcgaaactatagcaa
1501 atgcttacgt gaagctcggt cgccatcgag aaggtgtcgt gggctttgctcagtgctacc
1561 tgttcgacgc gcaggacatc gtgacgttcg gcgtcaccta tcttgagaagcatttcggaa
1621 ccactccgat cgtgccagca cacgaagtcg ccgagtgctc ttgcgagccttcaggttaga
1681 ggccgtcgac aatgataatc tggatcaacg gacctttcgg cgcgggaaagacgacgctcg
1741 ctgagcggtt gcgcgatcgg cgttccaaat cgctgatctt tgaccccgaggaaatcgggt
1801 tcgttgtgaa agaaacggtc cccatgccgg cgagcggaga ctatcaggatctcctattat
1861 gcaattaatc caaaaactgc ccagaaagtt aataatctag aattctttcccttgagtatt
1921 caaaggaact tctaataaat attattcaag aaaataaaca atctattcaaaaaattgaag
1981 aaatattaca taccataata cctgttcagt tatctgaaga ttctgaaaatgaatatcaac
2041 gagtgctgtc aaaatcaata aatgcagcat ttaaaaactg cggagccaaagaaggagaaa
2101 ttattcaagg gcaacacata aataagttag tagaatgtct actagaagaattaactcctt
2161 ggataaatca taacatcaag aaatagacca ttaattgaac caatttcttaaagttctagt
2221 agtcacatct agctgctttg aaatttcaat attccccata ccctgctttt taa
<210>4<211>491<212>PRT<213>大肠埃希菌(E.coli)
“MHTRKAITEALQKLGVQTGDLLMVHASLKAIGPVEGGAETVVAALRSAVGPTGTVMGYASWDRSPYEETRNGARLDDKTRRTWPPFDPATAGTYRGFGLLNQFLVQAPGARRSAHPDASMVAVGPLAETLTEPHKLGHALGEGSPVERFVRLGGKALLLGAPLNSVTALHYAEAVADIPNKRRVTYEMPMLGSNGEVAWKTASDYDSNGILDCFAIEGKPDAVETIANAYVKLGRHREGVVGFAQCYLFDAQDIVTFGVTYLEKHFGTTPIVPAHEVAECSCEPSG<210>5<211>1748<212>DNA<213>人工序列<220><221>CDS<223>斜体下划线为LinkCATACGCGGAAGGCAATAACGGAGGCGCTTCAAAAACTCGGAGTCCAAACCGGTGACCTATTGATGGTGCATGCCTCACTTAAAGCGATTGGTCCGGTCGAAGGAGGAGCGGAGACGGTCGTTGCCGCGTTACGCTCCGCGGTTGGGCCGACTGGCACTGTGATGGGATACGCATCGTGGGACCGATCACCCTACGAGGAGACTCGTAATGGCGCTCGGTTGGATGACAAAACCCGCCGTACCTGGCCGCCGTTCGATCCCGCAACGGCCGGGACTTACCGTGGGTTCGGCCTGCTGAATCAGTTTCTGGTTCAAGCCCCCGGCGCGCGGCGCAGCGCGCACCCCGATGCATCGATGGTCGCGGTTGGTCCACTGGCTGAAACGCTGACGGAGCCTCACAAGCTCGGTCACGCCTTGGGGGAAGGGTCGCCCGTCGAGCGGTTCGTTCGCCTTGGCGGGAAGGCCCTGCTGTTGGGTGCGCCGCTAAACTCCGTTACCGCATTGCACTACGCCGAGGCGGTTGCCGATATCCCCAACAAACGGCGGGTGACGTATGAGATGCCGATGCTTGGAAGCAACGGCGAAGTCGCCTGGAAAACGGCATCGGATTACGATTCAAACGGCATTCTCGATTGCTTTGCTATCGAAGGAAAGCCGGATGCGGTCGAAACTATAGCAAATGCTTACGTGAAGCTCGGTCGCCATCGAGAAGGTGTCGTGGGCTTTGCTCAGTGCTACCTGTTCGACGCGCAGGACATCGTGACGTTCGGCGTCACCTATCTTGAGAAGCATTTCGGAACCACTCCGATCGTGCCAGCACACGAAGTCGCCGAGTGCTCTTGCGAGCCTTCAGGTTAG
Figure A0210503800342
AGTATTCAACATTTTCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGTGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTAAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCTGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGACGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCAGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGAT<210>6    <211>583
<212>PRT
<213>人工序列<223>斜体下划线为LinkHTRKAITEALQKLGVQTGDLLMVHASLKAIGPVEGGAETVVAALRSAVGPTGTVMGYASWDRSPYEETRNGARLDDKTRRTWPPFDPATAGTYRGFGLLNQFLVQAPGARRSAHPDASMVAVGPLAETLTEPHKLGHALGEGSPVERFVRLGGKALLLGAPLNSVTALHYAEAVADIPNKRRVTYEMPMLGSNGEVAWKTASDYDSNGILDCFAIEGKPDAVETIANAYVKLGRHREGVVGFAQCYLFDAQDIVTFGVTYLEKHFGTTPIVPAHEVAECSCEPS
Figure A0210503800351
IQHFRVALIPFFAAFCLPVFAHPETLVKVKDAEDQLGARVGYIELDLNSGKILESFRPEERFPMMSTFKVLLCGAVLSRVDAGQEQLGRRIHYSQNDLVKYSPVTEKHLTDGMTVRELCSAAITMSDNTAANLLLTTIGGPKELTAFLHNMGDHVTRLDRWEPELNEAIPNDERDTTTPAAMATTLRKLLTGELLTLASRQQLIDWMEADKVAGPLLRSALPAGWFIADKSGASERGSRGIIAALGPDGKPSRIVVIYTTGSQATMDERNRQIAEIGASLIKHW

Claims (19)

1.一种β内酰胺酶基因，它是SEQ.ID.NO 1，及其能够编码具有β内酰胺酶活性的多肽的变体。
2.权利要求1的β内酰胺酶基因，它分离自肺炎克雷伯菌菌株。
3.一种氨基糖苷钝化酶基因，它是SEQ.ID.NO 3，及其能够编码具有氨基糖苷钝化酶活性的多肽的变体。
4.权利要求3的氨基糖苷钝化酶基因，它分离自权利要求大肠埃希菌菌株。
5.一种β内酰胺酶，它是SEQ.ID.NO 2，及其具有β内酰胺酶活性的多肽的变体。
6.权利要求5的β内酰胺酶，它分离自肺炎克雷伯菌菌株。
7.一种氨基糖苷钝化酶，它是SEQ.ID.NO 4，及其具有氨基糖苷钝化酶活性的多肽的变体。
8.权利要求7的氨基糖苷钝化酶，它分离自大肠埃希菌菌株。
9.由权利要求1或2的基因编码的蛋白，及其具有β内酰胺酶活性的多肽的变体。
10.由权利要求3或4的基因编码的蛋白，及其具有氨基糖苷钝化酶活性的多肽的变体。
11.β内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶融合基因，它是SEQ ID NO：5，或其能够编码具有β内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶活性的变体.
12.一种融合蛋白，它由权利要求11的融合基因编码，它是SEQ.ID.NO 6。
13.一种多肽，它是权利要求12的融合蛋白的具有β内酰胺酶/氨基糖苷钝化酶活性的变体。
14.一种药物组合物，它含有一种或多种权利要求5-13之任一的蛋白，及药学上可接受的载体。
15.权利要求14的组合物在制备用于失活β内酰胺类和氨基糖苷类抗生素的制剂中的应用。
16.权利要求15的应用，该组合物是用于失活β内酰胺类和氨基糖苷类抗生素的阴道泡腾片。
17.权利要求15或16的应用，其中，该制剂用于保护非感染部位的正常微生物菌群免受杀灭。
18.权利要求15的应用，其中，该制剂用于特定环境中的残留抗菌药物的清除。
19.权利要求15的应用，其中，该制剂用于动物源食品的预处理，以降解其中所含的抗生素。
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