CN107108749A - 能够抑制至少一种抗生素的杂合蛋白分子和包含所述杂合蛋白分子的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及杂合蛋白分子，其包含能够抑制至少一种抗生素之活性的至少两种蛋白质，所述蛋白质各自具有不同的生物化学特性并且彼此结合。所述杂合蛋白分子抑制至少一种抗生素的活性以降低抗生素的肠副作用，例如由抗生素引起的严重腹泻和继发于肠胃外抗生素治疗的医院内感染。

Description

能够抑制至少一种抗生素的杂合蛋白分子和包含所述杂合蛋 白分子的药物组合物

技术领域

本发明涉及防止抗生素继发于其对胃肠菌群的作用和抗性细菌菌株的选择的不良效应。

背景技术

肝可将很多肠胃外施用的抗生素以活性的、未经修饰的活性形式或作为活性代谢物排泄到胆汁中。这些抗生素可在回肠内被重吸收，并且由此通过门静脉返回到肝以最终被排出。该循环被称为肠肝循环。

当以未经修饰的活性形式或作为活性代谢物排泄到消化道中时，这些抗生素可对形成肠和结肠的正常微生物菌群的细菌群施加选择压力。这样的微生物选择具有两个主要后果：由抗生素诱发的急性腹泻的发生以及抗性细菌菌株的选择和播散。

在用肠胃外广谱抗生素时常常观察到发生由抗生素引起的急性腹泻。频率和严重程度由多种因素决定，包括治疗的持续时间、所使用抗生素的活性谱和剂量(Aires，Kohler等，1999)。因此，在以下中观察到由抗生素诱发的急性腹泻：接受阿莫西林抗生素治疗的所有患者中的约5％至10％、阿莫西林-克拉维酸联合的10％至25％以及第三代头孢菌素、氟喹诺酮、阿奇霉素、克拉霉素、红霉素和四环素类的2％至5％(Gilbert，1994；Bartlett，1996，Hogenauer，Hammer等，1998；Wistrom，Norrby等，2001)。

尽管由抗生素引起的急性腹泻中的大多数病例是良性的，但是在所有病例中有10％至20％可伴随有严重的结肠炎。在大部分病例中，该结肠炎继发于对大部分抗生素具有抗性的艰难梭菌(Clostridium difficile)(一种形成芽孢的革兰氏阳性厌氧菌)的选择(Gerding，1989；Anand，Bashey等，1994)。该细菌的致病性与毒素A和毒素B二者的产生有关。这些毒素诱发强烈的炎性反应且在固有层(lamina propria)内募集中性粒细胞，并且在最严重的形式中，诱发假膜性结肠炎，之所以如此命名是由于结肠直肠黏膜的外观(Kelly，Pothoulakis等，1994)。假膜性结肠炎的死亡率较高，尤其是在幼儿和年长者中。在2010年，在美国这些结肠炎导致超过7200例的死亡(Sherry，Murphy等，2012)。另一些病原体也可导致由抗生素诱发的不同严重程度的急性腹泻，例如产酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、A型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type A)、金黄色葡萄球菌(Straphylococcus aureus)和白念珠菌(Candida albicans)(Sparks，Carman等，2001；Gorkiewicz，2009)。

抗生素对肠微生物菌群施加的选择压力还导致抗性细菌在环境中扩散。医院内由这些微生物引起的感染(还称为医院内感染)中的大多数在重症监护室和外科手术室中是特别常见且严重的。特别地，其涉及导管感染、尿路感染、肺病和术后感染。其主要由革兰氏阴性肠杆菌、凝固酶阳性或阴性葡萄球菌、肠球菌和白念珠菌引起(Richards，Edwards等，2000)。

医院内感染是死亡的一个重要原因并且是主要的健康问题。继发于广泛使用抗生素治疗的抗性细菌出现使这些医院内感染的治疗变得复杂并且代表一项相当大的社会成本。在欧洲，医院内感染直接导致每年约25,000例的死亡并且导致每年在医疗保健和生产力损失方面的额外成本估计超过15亿欧元(ECDC/EMEA Joint Working Group，2009)。在美国，每年约170万例的医院内感染直接或间接导致近99,000例死亡(Klevens，Edwards等，2007)。

抗生素(特别是四环素类)在兽医学中广泛用于治疗家畜和宠物。另外，在美国允许使用这些抗生素来促进家畜的生长和增重。当然，这一密集使用参与了抗性细菌在环境中的播散(Institute of Medicine，1988；Committee on Drug Use in Food Animals，1999；Georgetown University Center for Food and Nutrition Policy，1999)。

β-内酰胺类

β-内酰胺类抑制参与形成革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的细胞壁的基本组分肽聚糖的转肽酶和转糖基酶(Walsh，2000)。β-内酰胺类具有β-内酰胺环以及修饰其药物动力学特性和其抗微生物谱的效力的可变侧链(例如，第1、2、3和4代头孢菌素)(Turner，2005)。该类别包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和单环β-内酰胺类。

β-内酰胺类抗生素是最常开处方的抗微生物剂。β-内酰胺类抗生素在临床上广泛用于不同类型的感染(例如，耳感染、呼吸道感染和肠胃感染)。数种施用途径均可使用，但是对于通常在医院内治疗的严重脓毒症而言优选肠胃外途径。对于严重感染，通常将β-内酰胺类抗生素与其他种类的抗生素联合，例如在非典型肺炎的情况下阿莫西林/克拉维酸与大环内酯类联合。

β-内酰胺类抗生素的广泛使用促进细菌抗性的出现。主要机理是获得β-内酰胺酶，其是能够水解β-内酰胺类抗生素的β-内酰胺核心的酶。到目前为止，存在数百种或甚至数千种不同的β-内酰胺酶，其根据序列同源性(底物和抑制剂)可分为数个家族。通常根据这些酶的优先底物对其进行分类(青霉素酶、头孢菌素酶、亚胺培南酶(imipénèmase)等)。此外，β-内酰胺酶已经进化变得对抑制剂具有抗性或拓宽其对最新的β-内酰胺类的作用谱(Turner，2005；Drawz和Bonomo，2010)。这些抑制剂(克拉维酸、舒巴坦等)通常与β-内酰胺类同时施用，并且与细菌β-内酰胺酶不可逆地结合。

Ambler的分类举例说明了这些β-内酰胺酶的巨大多样性。β-内酰胺酶根据其核苷酸序列分为四个家族(A、B、C和D)(Ambler，1980)。A组、C组和D组具有催化性丝氨酸而B组包括锌依赖性金属β-内酰胺酶。

A类β-内酰胺酶包括数个亚家族，包括TEM型酶(Bush和Jacoby，1997)，其是对青霉素和氨基青霉素类(例如氨苄西林、阿莫西林、巴氨西林)具有抗性的祖先酶。TEM-36是一种IR-TEM，即抗克拉维酸的β-内酰胺酶(Zhou，Bordon等，1994；Henquell，Chanal等，1995；Chaibi，Sirot等，1999)；在Lahey Clinic网站(http：//www.lahey.org/Studies/ temtable.asp)上的TEM-36或IRT-7标识符。克拉维酸在临床上与阿莫西林联合使用以拓宽对已经获得典型β-内酰胺酶(TEM-1)的病菌的抗生谱。在选择压力下，TEM通过突变数个目前已充分表征的氨基酸而逐渐变得对抑制剂具有抗性(Chaibi，Sirot等，1999)。

在A类β-内酰胺酶中，我们还发现了头孢噻肟酶(cefotaximase)，其是由TEM进化而来将其谱拓宽至第三代头孢菌素的酶(Salverda，De Visser等，2010)。例如，CTX-M16酶(该蛋白质的Genbank标识符：AAK32961)相较于不同的青霉素类优先水解头孢噻肟(Bonnet，Dutour等，2001)。

由基因blaZ编码的PC1酶(该蛋白质的UniProtKB/Swiss-Prot标识符：P00807)是具有催化性丝氨酸的A类β-内酰胺酶(Ambler，1975；Knott-Hunziker，Waley等，1979；Kemal和Knowles，1981；Hertzberg和Moult，1987)。由凝固酶阳性金黄色葡萄球菌和抗甲氧西林枯草芽孢杆菌(methi-R Bacillus subtilis)产生的这种酶水解甲氧西林的β-内酰胺环(Novick，1963)。

氨基糖苷类

氨基糖苷类(还称为氨基苷类)是通过糖苷桥与中心氨基环醇核心连接的氨基糖。该中心核心的结构用于区别三个组群：链霉素类(链霉素)、去氧链霉胺类(卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素)和福提霉素类(Dactamicine)。

氨基糖苷类的理论抗生素谱是非常宽的，并且包括需氧革兰氏阴性菌(杆菌、球菌和球杆菌)、凝固酶阳性或阴性葡萄球菌和革兰氏阳性杆菌。此外，链霉素对结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)具有活性，并且阿米卡星对非典型分枝杆菌(鸟-胞内分枝杆菌(Mycobacterium avium intracellulare)等)以及星形诺卡菌(Nocardia asteroids)具有活性。氨基糖苷类与β-内酰胺类和万古霉素具有协同活性。

氨基糖苷类由于在消化道内吸收很少或不吸收而通常肠胃外施用。氨基糖苷类主要通过肾小球滤过主要在尿中(85％至90％的施用剂量在24小时内消除)并且在较低程度上在胆汁中不经肠肝循环(根据抗生素的约0.5％至2％的施用剂量)以未改变的形式消除(Leroy，Humbert等，1978)。氨基糖苷类的这种胃排泄导致抗性细菌的选择，从而使由艰难梭菌引起的假膜性结肠炎的风险略微提高(Arnand，Bashey等，1994)。

氨基糖苷类的杀菌效果对很多病原体较快。氨基糖苷类固定在原核生物30S核糖体亚基上，并且改变细菌翻译的准确性(Poehlsgaard和Douthwaite，2005)。氨基糖苷类中的大部分在译码位点(位点A)与16S核糖体RNA(30S核糖体亚基的RNA组分)结合。

细菌可通过可共存于同一细胞中的三种主要机理发展对氨基糖苷类的抗性(Ramirez和Tolmasky，2010)。第一染色体机制通过其甲基化导致氨基糖苷对其核糖体靶标(16S核糖体RNA)的亲和力降低(Doi和Arakawa，2007)。第二机理基于通过改变膜渗透性来使细胞渗透性失效(Hancock，1981)或通过活性机理来使氨基糖苷外排到细胞外(Aires，Kohler等，1999)。最后，酶失活是最常观察到的机理。编码这些酶的基因由质粒和/或转座子携带。因此，抗性是可转移的并且常常在医院内流行。这些酶催化氨基糖苷类与不同化学基团的不可逆结合，并且分为三类(Shaw，Rather等，1993；Ramirez和Tolmasky，2010)。磷酸转移酶(APH)催化ATP或GTP的磷酸基团的转移反应，核苷酸基转移酶(ANT)能够转移腺苷酰基团并且使用ATP作为底物，并且乙酰转移酶(AAC)使用乙酰-CoA作为底物来转移乙酰基基团。根据氨基糖苷的取代基，每个酶类别均具有不同的亚类。同种酶可使具有相同分子位点的数种氨基糖苷类失活。

AAC(6’)-lb-cr(该蛋白质的Genbank标识符：ABC17627.1)是由肠杆菌天然产生的来自N-乙酰转移酶家族的酶。其催化6’位的-NH2基团的乙酰化，从而赋予该酶与ACC(6’)亚类中其他酶相同的抗性谱(Robicsek，Strahilevitz等，2006)。与ACC(6’)家族中的其他酶类似，AAC(6’)-lb-cr也对包括阿米卡星以及庆大霉素的C1a和C2对映异构体在内的广泛范围的氨基糖苷类具有活性，但是对庆大霉素的C1对映异构体具有非常低的活性(Robicsek，Strahilevitz等，2006)。AAC(6’)-lb-cr可能是由于AAC(6’)-lb酶通过Trp102Arg和Asp179Tyr残基的突变进化。这导致获得了对环丙沙星、氟喹诺酮的酶活性，这是对诺氟沙星和培氟沙星显著更低的活性。

氟喹诺酮类

氟喹诺酮类(例如，诺氟沙星、氧氟沙星、环丙沙星和培氟沙星)形成一大类由喹诺酮通过化学修饰(特别是添加氟原子)衍生的合成杀菌抗生素。

氟喹诺酮类是在抗生素之间彼此不同的广谱抗生素。氟喹诺酮类的谱包括革兰氏阴性杆菌(沙门菌属(Salmonella spp.)、埃希菌属(Escherichia spp.)、志贺菌属(Shigella spp.)、变形杆菌属(Proteus spp.)、肠杆菌属(Enterobacter spp.)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori))、革兰氏阳性球菌(凝固酶阳性和阴性葡萄球菌、链球菌、肠球菌)、革兰氏阴性球菌(淋球菌、脑膜炎球菌)和革兰氏阳性杆菌。

氟喹诺酮类的组织甚至在脑脊液、前列腺、骨和胆汁中分布优异。因此，氟喹诺酮类广泛地用于组织感染的病例(脑膜炎、肺炎、骨和关节感染、上尿路感染或前列腺感染等)。然而，氟喹诺酮类的血清水平通常较低，并且甚至可比某些病菌的MIC(最小抑制浓度)更低，从而有利于细菌抗性的出现。

氟喹诺酮类的排泄取决于所使用的产品。对于培氟沙星，排泄主要是经肝，而对于氧氟沙星及其他氟喹诺酮类，排泄主要是经肾。氟喹诺酮类的胆汁和消化消除导致由艰难梭菌(特别是由尤其强毒菌株BI/NAP1/027)引起的假膜性结肠炎的风险(Vardakas，Konstantelias等，2012；Deshpande，Pasupuleti等，2013；Slimings和Riley，2013)。

氟喹诺酮类靶向DNA促旋酶以及细菌拓扑异构酶II和IV。氟喹诺酮类在这些酶和细菌DNA之间形成不可逆的复合物，其阻止DNA复制并且导致细菌死亡。

四种喹诺酮类抗性机理已得到表征(Robicsek，Jacoby等，2006)：(i)外排泵的活性提高，引起抗生素的细胞内浓度降低(Morita，Kodama等，1998)；(ii)产生与DNA促旋酶和拓扑异构酶IV结合的蛋白质，从而保护它们并且固定氟喹诺酮类(Robicsek，Jacoby等，2006)；(iii)通过降低氟喹诺酮类对其靶标的亲和力而导致高水平抗性的DNA促旋酶或拓扑异构酶IV的修饰(Robicsek，Jacoby等，2006)；(iv)最后，产生氨基糖苷N-乙酰转移酶AAC(6’)lb-cr(该蛋白质的Genbank标识符：ABC17627.1))，其能够分解代谢环丙沙星以及在较低程度上诺氟沙星和培氟沙星的修饰(Robicsek，Strahilevitz等，2006)。

这些抗性机理的频率快速增加，已经在很多细菌物种中鉴定到，包括凝固酶阳性金黄色葡萄球菌、β-溶血性链球菌和肠球菌(Robicsek，Jacoby等，2006)。

大环内酯类

大环内酯类是代表物的数量相对有限的天然和半合成抗生素的同源家族(例如，红霉素、螺旋霉素、交沙霉素、克拉霉素、罗红霉素、阿奇霉素和泰利霉素)。

大环内酯类的活性谱相对较宽，并且包括需氧革兰氏阳性球菌(链球菌、肺炎球菌、肠球菌和葡萄球菌)和厌氧革兰氏阴性球菌、例如幽门螺杆菌的某些革兰氏阴性杆菌以及具有严格细胞内复制的不同细菌，例如嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)和解脲支原体(Mycoplasma urealyticum)、肺炎衣原体(Clamydiae pneumoniae)和沙眼衣原体(Clamydiae trachomatis)。然而，肠杆菌由于其外细胞膜阻止例如大环内酯类的疏水性分子通过而固有地对大环内酯类具有抗性。

大环内酯类在体内广泛分布，除脑脊液、脑和尿之外。消除主要是在被细胞色素P450代谢之后经胆汁。大环内酯类的施用与继发于艰难梭菌选择的假膜性结肠炎的风险提高有关(Gilbert，1994；Bartlett，1996；Hogenauer，Hammer等，1998；Wistrom，Norrby等，2001)。

大环内酯类为在位点P与原核生物核糖体的50S亚基可逆结合的抑制剂。由此，大环内酯类阻止肽基-tRNA复合物(转移RNA)从位点P向位点A的转移和解离，并且从而抑制肽链延伸(Tenson，Lovmar等，2003)。

大环内酯类的三种抗性机理是已知的(Roberts，Sutcliffe等，1999；Roberts，2008)：(i)通过形成50S核糖体RNA的细菌23S核糖体RNA的甲基化或突变来改变靶标。最常遇到该抗性机理的是大环内酯类、林可酰胺类和链阳性菌素类B(Weisblum，1995)；(ii)产生使抗生素泄露到细胞外的细胞泵，导致细胞内浓度降低；(iii)通过酶(红霉素酯酶、红霉素磷酸转移酶)修饰大环内酯类使得极大地降低其对核糖体的亲和力的失活。这一类型的抗性还通过可动遗传元件而传递。

红霉素酯酶通过水解大环内酯核来使大环内酯失活。这些酶中的大多数属于两个亚类：ereA(Ounissi和Courvalin，1985)和ereB(Arthur，Autissier等，1986)。ereB酶(UniProtKB/Swiss-Prot标识符：P05789.1)具有非常宽的谱(红霉素、克拉霉素、罗红霉素和阿奇霉素)，但是泰利霉素对水解具有抗性(Morar，Pengelly等，2012)。

四环素类

环素类或四环素类是由四环素衍生的杀菌抗生素的家族(例如氯四环素、多西环素、米诺环素)。这些分子的特征在于具有四个稠环，由此而命名。

四环素类的活性谱延伸至很多需氧和厌氧革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。四环素类还对非常规的病原体具有活性，例如支原体属(Mycoplasma spp.)、衣原体属(Chlamydiaspp.)、立克次氏体密螺旋体(rickettsies tréponèmes)和一些原生动物(分歧巴贝虫(Babesia divergens)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、小泰勒虫(Theileria parva))。分枝杆菌以及肠杆菌科变形杆菌(Proteus)和假单胞菌(Pseudomonas)天然具有抗性。

除氯四环素之外，四环素类中的大多数均是通过肾小球滤过以活性形式消除。四环素类还在胆汁中经肝肠循环消除。四环素类的使用还与继发于艰难梭菌选择的假膜性结肠炎的风险提高有关(Gilbert，1994；Bartlett，1996；Hogenauer，Hammer等，1998；Wistrom，Norry等，2001)。

来自环素家族的抗生素抑制核糖体30S亚基的位点A的氨酰基-tRNA的固定，并且从而抑制翻译(Chopra和Roberts，2001)。已鉴定出至少三种抗性机理：(i)外排蛋白的表达，诱导四环素的细胞内浓度降低；(ii)分子靶标的酶修饰，阻止四环素的结合；(iii)通过NADPH依赖性四环素氧化还原酶TetX(该蛋白质的GenBank标识符：AAA27471.1)的失活(Speer，Bedzyk等，1991)。该酶诱导针对所有四环素的细菌抗性。

林可酰胺类

林可酰胺类(林可霉素及其半合成衍生物克林霉素)是抑菌抗生素，其尽管化学结构与大环内酯类不同但是具有类似的作用模式并且与链阳性菌素类B分组在称为MLS(大环内酯、林可酰胺和链阳性菌素)的一个家族中。

林可酰胺类的活性谱覆盖除例如粪链球菌(Streptococcus faecalis)的少数之外的大多数革兰氏阳性菌(例如，蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、MSSA和MRSA、B葡萄球菌(BStaphylococcus)、不可分组的葡萄球菌(Staphylococcus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes))；以及值得注意地除艰难梭菌之外的大量厌氧菌(例如，放线菌(actinomyce)、拟杆菌(bacteroide)、梭形杆菌(fusobacterium)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes))。大部分的革兰氏阴性菌均具有抗性，除少数罕见的例外之外(例如，百日咳鲍特菌(Bordetella pertussis)、弯曲杆菌(Campylobacter)、衣原体(Chlamydia)、螺杆菌(Helicobacter)和军团菌(Legionella))。

林可酰胺类主要通过肾消除，并且在较低程度上在胆汁中经肠肝循环消除。林可酰胺类从胃肠道的消除及其抗菌活性解释了由艰难梭菌选择引起的假膜性结肠炎的高频率。

类似于大环内酯类，林可酰胺类通过在位点A和P与50S核糖体亚基可逆地结合来抑制细菌翻译(Tu，Blaha等，2005)。林可酰胺类获得的三种抗性机理是已知的(Roberts，Sutcliffe等，1999)：(i)通过构成50S核糖体RNA的细菌23S核糖体RNA的甲基化和突变来改变靶标。这种最常遇到的抗性机理对大环内酯类、林可酰胺类和B链阳性菌素类是常见的(Weisblum，1995)；(ii)细菌表达将抗生素外排到细胞外的泵，导致其细胞内浓度下降；(iii)林可酰胺类的酶失活，降低其对其分子靶标的亲和力。

能够使林可酰胺失活的酶属于林可霉素核苷酸基转移酶的家族：葡萄球菌中的Inu(A)或lin(A)、屎肠球菌中的Inu(B)或lin(B)和厌氧菌中的linB样(Leclercq，Brisson-Noel等，1987；Bozdogan，Berrezouga等，1999)。例如，Inu(B)酶(该蛋白质的UniProtKB/TrEMBL标识符：Q9WVY4)催化腺嘌呤基残基转移到林可霉素和克林霉素的第3位的羟基上(Bozdogan，Berrezouga等，1999)。

抵消这些抗生素的副作用

现有技术熟知旨在降低之前报道的肠内的不利反应的抗生素抑制剂。这些抑制剂基本上靶向β-内酰胺，并且主要由经口施用的β-内酰胺酶组成以使其在肠道内播散。

专利EP0671942涉及医疗应用、医疗方法和药物制剂。该发明可靶向肠胃外施用的β-内酰胺的作用，并且通过单独地或与抗生素同时经口施用例如β-内酰胺酶的酶由于使一部分抗生素在消化道中失活而降低不利反应。这导致抗生素的分解。

EP2086570申请以类似的方法使用A类β-内酰胺酶(更具体地P1A酶)来降低与将β-内酰胺和β-内酰胺酶抑制剂组合的抗生素治疗有关的肠副作用。

在临床前和临床上评价P1Aβ-内酰胺酶的效力。该酶水解氨基青霉素类(例如，阿莫西林)和酰脲青霉素(例如，哌拉西林)，但是对β-内酰胺抑制剂敏感。在狗中在肠胃外施用氨苄西林的同时进行其经口施用以剂量依赖性方式降低在这些动物中的空肠腔中检测到的氨苄西林量。此外，在循环中未检测到P1Aβ-内酰胺酶的存在，并且氨苄西林的血清浓度未显著改变(Harmoinen，Vaali等，2003；Harmoinen，Mentula等，2004)。在接受肠胃外施用哌拉西林的小鼠中经口施用该酶非常显著地降低粪便中针对该抗生素的抗性微生物的数量(VRE-屎肠球菌、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)和光滑念珠菌(Candidaglabrata))(Stiefel，Pultz等，2003；Mentula，Harmoinen等，2004)。

最后，临床实验表明，经口施用P1Aβ-内酰胺酶在静脉内施用氨苄西林之后在健康志愿者中降低对氨苄西林具有抗性的肠杆菌科分离菌的数量以及对其他种类抗生素具有抗性(特别是对四环素类具有抗性)的肠杆菌科分离菌的数量(Tarkkanen，Heinonen等，2009)。

还已经开发了属于其他种类β-内酰胺酶的重组β-内酰胺酶。专利EP2038411描述了在接受碳青霉烯类的患者中降低肠副作用的金属β-内酰胺酶突变体及其合成。

现有技术还涵盖靶向将这些酶在肠内之递送的剂型。专利FR2843302描述了能够抑制大环内酯类的酶(例如红霉素酯酶)限于结肠递送的用于经口施用的多颗粒剂型。

现有技术中解决方案的缺点

现有技术中的解决方案使用仅靶向一种类型的抗生素的酶，分解β-内酰胺类的β-内酰胺酶或抑制大环内酯类的红霉素酯酶。

通常将不同的抗生素用于医院患者，并且甚至在同一患者中组合。抑制单一种类的抗生素对抗性细菌菌株的出现仅具有适度或最小效果。

作为实例，通常用第三代头孢菌素类与氨基糖苷类的联合来治疗革兰氏阴性杆菌的严重感染，而用阿莫西林-克拉维酸与大环内酯类或四环素类的联合来容易地治疗非典型肺炎。

由于现有技术中所述的抗生素抑制剂针对单一种类的抗生素，因此其在同时使用不同种类抗生素的环境中(特别是在医院中)无法有效地防止抗性细菌菌株的出现。

本发明提供的解决方案

本发明在其最广泛认可的意义上提出通过提供包含能够抑制至少一种抗生素的活性的至少两种蛋白质的杂合蛋白分子来克服现有技术的缺点，每种蛋白质具有不同的生物化学特性，所述蛋白质连接在一起。在一个实施方案中，所述能够抑制至少一种抗生素的活性的蛋白质共价连接在一起。

根据本发明所述的杂合蛋白分子抑制至少一种抗生素的活性以降低抗生素的肠副作用，例如由抗生素引起的急性腹泻和继发于施用肠胃外抗生素的医院内感染。

应理解，与现有技术中的解决方案相比，本发明具有更宽的作用谱。

优选地，本发明中的杂合蛋白分子经口施用。根据本发明的杂合蛋白分子可包含能够抑制很多种类的抗生素(并且特别是临床实践中最常用的联合)的蛋白质。因此，单一杂合蛋白分子的施用可靶向数种抗生素，从而降低开处方产品的数量。

杂合蛋白分子是指通过将两种或更多种多肽链人工组合而形成的杂合蛋白。

抑制抗生素活性是指导致所考虑抗生素的生物活性降低或受到抑制的所有过程。这包括但不限于以特异性方式(例如，使用单克隆抗体或单克隆抗体的片段)或非特异性方式(例如，通过吸附)使抗生素结合在其他分子上、通过酶促或非酶促添加化学基团来修饰抗生素或者通过抗生素或非抗生素机理来水解抗生素。

有利地，所述蛋白质中的至少一种是能够抑制至少一种抗生素的活性的酶。

在另一个实施方案中，每种蛋白质均是能够优先地抑制至少一种抗生素的活性的酶。

有利地，每种蛋白质优先地抑制不同抗生素的活性。

在本发明的另一个实施方案中，所述杂合蛋白分子包含能够抑制至少一种抗生素的活性的至少两种蛋白质，每种酶均具有不同的生物化学特性，所述酶共价结合在一起。

应理解，每种酶均优先地分解两种不同的抗生素。

本发明出乎意料地证明，如上限定的杂合蛋白分子将形成它们的蛋白质的各自功能活性组合，使得扩大其作用谱并且增强其在经受高选择压力的医院环境中的效力。

可使用使一种或更多种抗生素失活的数种类型的蛋白质来形成杂合蛋白分子，所述蛋白质包括单克隆抗体的片段(例如，单价或二价ScFv)、水解酶或催化其他类型修饰的酶。

有利地，根据本发明的杂合蛋白分子由能够抑制抗生素(优选选自以下的抗生素)的活性的一种或数种蛋白质组成：β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、大环内酯类、四环素类和/或林可酰胺类。优选地，所述杂合蛋白分子中的每种蛋白质抑制不同抗生素的活性。在一个实施方案中，所述杂合蛋白分子包含能够抑制属于同一类别的抗生素的活性的两种蛋白质。

有利地，所述杂合蛋白中至少一种组成蛋白的序列与SEQ ID1至SEQ ID7具有至少40％的蛋白质序列同源性。该序列同源性使用CLUSTALW2或CLUSTALOMEGA软件用标准计算参数来确定(Thompson，Higgins等，1994；Larkin，Blackshields等，2007)。优选地，该序列同源性为与SEQ ID1至SEQ ID7的至少50％，并且甚至更优选至少60％。

所述杂合蛋白分子的组成蛋白或组成酶可包含0个、1个或数个糖基化。

在一个实施方案中，所述蛋白质或酶组合成单一单链蛋白质。

在一个优选实施方案中，所述杂合蛋白分子包含抑制至少一种抗生素的活性的结合在一起的两种酶，所述酶中的一种为β-内酰胺酶并且所述酶中的一种为选自以下的酶：β-内酰胺酶、抑制氨基糖苷类的酶、抑制氟喹诺酮类的酶、抑制大环内酯类的酶、抑制四环素类的酶或抑制林可酰胺类的酶。

应理解，所述杂合蛋白分子可包含：

-结合在一起的两种β-内酰胺酶；或者

-相互连接的选自β-内酰胺酶和抑制氨基糖苷类的酶的酶，所述抑制氨基糖苷类的酶为磷酸转移酶、核苷酸基转移酶或乙酰转移酶；或者

-相互连接的选自β-内酰胺酶和抑制氟喹诺酮类的酶的酶，所述抑制氟喹诺酮类的酶为氨基糖苷N-乙酰转移酶；或者

-相互连接的选自β-内酰胺酶和抑制大环内酯类的酶的酶，所述抑制大环内酯类的酶为红霉素酯酶或红霉素磷酸转移酶；或者

-相互连接的选自β-内酰胺酶和抑制四环素类的酶的酶，所述抑制四环素类的酶为NADPH依赖性四环素氧化还原酶；或者

-相互连接的选自β-内酰胺酶和抑制林可酰胺类的酶的酶，所述抑制林可酰胺类的酶为林可霉素核苷酸基转移酶。

本发明人出乎意料且令人惊讶地发现所述杂合蛋白分子针对其靶抗生素的效力等于单独的其所包含的酶。

这些杂合蛋白还可作为由翻译单个阅读框产生的单条蛋白质链来人工获得，所述单个阅读框通过将蛋白质组分的相应阅读框直接融合或者通过编码由一个或数个氨基酸组成的衔接子的核苷酸序列来获得。已知为惰性的并且没有特定生物作用的该衔接子可以是柔性的、半刚性的或刚性的(Chen，Zaro等，2013)。

根据另一个实施方案，所述蛋白质或酶通过交联共价连接在一起。

这些杂合蛋白还可使用化学试剂(Chen，Nielsen等，2013)、酶促催化(Paguirigan和Beebe，2007)、暴露于紫外光(Fancy和Kodadek，1999)或导致共价键形成的任何其他方法通过交联来人工获得。或者，这样的杂合蛋白可通过将一个或数个蛋白质亚基通过高亲和力配体非共价地组装来获得，例如，(链霉)亲和素/生物素复合物(Schultz，Lin等，2000；Lin，Pagel等，2006；Pagel，Lin等，2006)。

根据另一个实施方案，本发明提供了包含根据本发明的杂合蛋白分子的人用或兽用药物组合物，其用于防止肠菌群改变。

有利地，本发明提供了药物组合物，其用于防止医院内感染。

有利地，本发明提供了药物组合物，其用于预防与施用抗生素相关的腹泻。

根据一个优选实施方案，根据本发明的包含杂合蛋白分子的药物组合物是用于经口施用的剂型。

应理解，本发明提供了包含杂合蛋白分子的药物组合物，其用于防止正常肠菌群改变以防止抗性细菌在环境中扩散，降低由多重抗性微生物引起的医院内感染的风险和/或严重程度，并且降低由抗生素引起的腹泻的频率和严重程度。

有利地，所述药物组合物用于施用于人，包括儿科。应理解，根据本发明的药物组合物可在施用一种或数种抗生素之前、同时或之后施用，优选经口施用。

在另一个实施方案中，所述药物组合物用于兽用以防止通过接受抗生素的宠物或农场动物扩散针对抗生素的细菌抗性。

根据本发明的药物组合物还包含任何可药用的物质，例如辅料、赋形剂、稳定剂、盐、添加剂、黏合剂、润滑剂、包衣剂、着色剂、矫味剂或本领域技术人员已知的任何其他常规用试剂。

根据本发明的药物组合物可以是固体或液体形式，但不限于凝胶剂、糖浆剂、胶囊剂、片剂、混悬剂或乳剂的形式。

根据一个变体方案，所述药物组合物包含至少一种胃保护剂。

胃保护剂是指用于延迟杂合蛋白分子在肠内(优选在十二指肠和空肠内)释放的对胃液具有抗性的试剂。胃保护剂还可以是包衣剂，例如但不限于聚甲基丙烯酸酯(例如，)、基于纤维素的聚合物(例如的纤维素醚，纤维素酯)、聚乙酸乙烯酯共聚物(例如，)或本领域技术人员已知的用于包衣或包封或工艺的任何其他试剂。

根据另一个方面，本发明涵盖用于在活非人重组生物体中产生杂合蛋白分子的方法。

活重组生物体是指能够遗传改造以产生杂合蛋白分子的任何细胞。

在没有限制下，术语能够遗传修饰的细胞是指任何原核细胞(例如，大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica))、经或未经杆状病毒感染的昆虫细胞、哺乳动物细胞(例如，CHO、CHO-K1、HEK293、HEK293T)。

法明详述

根据对以下非限制性实施例的描述，将更好地理解本发明。

附图说明

图1示出了属于IR-TEM家族(Amber A类)的不同β-内酰胺酶的蛋白质序列比对。所述比对在https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2网站上用CLUSTALW2软件使用默认设置来进行。图1显示：通过数条序列的比对，IR-TEM酶显示出＞90％的蛋白质同一性。这些酶相对地保存良好且共有80％至99％的蛋白质序列同一性，并且还得到充分表征(Bonnet，2004)。

图2示出了属于CTX-M头孢噻肟酶家族(Amber A类)的不同β-内酰胺酶的蛋白质序列比对。所述比对在https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2网站上使用软件上的默认设置来进行。

图3提供了用于产生杂合蛋白的PCR技术的图示。首先，用组成接头的共有序列单独地扩增(分别在3’端和5’端)两种蛋白质。然后，使两个片段杂交至互补DNA序列(接头的互补DNA序列)的水平，并用外部引物重新扩增整体。

图4描述了用于在巴斯德毕赤酵母中表达TEM-36(SEQ ID1)、CTXM-16(SEQ ID2)、TEM36-GGGGGG-CTXM16(SEQ ID8)、CTXM16-GGGGGG-TEM36(SEQ ID9)和TEM36-G(EAAAK)2-CTXM16(SEQ ID 10)蛋白质的所有构建体。在XhoI/NotI中进行克隆到载体pJexpress915中，当需要时利用适度消化以保留CTXM16的编码DNA序列的内部NotI位点。

图5示出了克隆到XhoI/NotI中的DNA片段，其编码TEM-36(SEQ ID1)、CTXM-16(SEQID2)、TEM36-GGGGGG-CTXM16(SEQ ID8)、CTXM16-GGGGGG-TEM36(SEQ ID9)和TEM36-G(EAAAK)2-CTXM16(SEQ ID 10)蛋白质并且通过使用pJexpress915-SEQ-F和pJexpress915-SEQ-R引物和以下程序的PCR获得(95℃30秒-25个循环的[95℃30秒-53℃45秒-72℃1分钟]-72℃5分钟-4℃)。

图6示出了在12％SDS-PAGE凝胶上的杂合蛋白及其组成酶TEM-36(SEQ ID1)和CTMX-16(SEQ ID 2)，如通过在巴斯德毕赤酵母中表达并纯化和在通过EndoHf进行去糖基化处理之后获得的。

图7描述了用于在大肠杆菌中表达TEM-36(SEQ ID1)、CTMX-16(SEQ ID2)和杂合蛋白TEM36-GGGGG-CTXM16、CTXM-16-GGGGG-TEM36的所有构建体。通过NdeI/HindIII来进行克隆到pET-26(+)载体中。

图8示出了克隆到pET-26(+)中的NdeI/HindIII中的DNA片段，其编码TEM-36(SEQID1)、CTXM-16(SEQ ID2)、TEM36-GGGGG-CTXM16、CTXM16-GGGGG-TEM36并且通过使用T7-F和T7-R引物以及以下程序的PCR获得(95℃30秒-25个循环的[95℃30秒-55℃45秒-72℃1分钟]-72℃5分钟-4℃)。

图9示出了在12％SDS-PAGE凝胶上的杂合蛋白(TEM36-G₅-CTXM16和CTXM16-G₅-TEM36)及其组成酶TEM-36(SEQ ID1)和CTXM-16(SEQ ID2)，如通过在大肠杆菌(E.coli)中表达并从周质级分纯化获得的。

图10示出了在构建AAC-H6-CTXM16(SEQ ID 18)融合体中获得的编码AAC-6’-lb-cr(SEQ ID4)、CTXM-16(SEQ ID2)和AAC-H₆-CTXM16的DNA片段。

图11示出了在12％SDS-PAGE凝胶上的杂合蛋白AAC-H₆-CTXM16及其组成酶AAC-6’-lb-cr(SEQ ID4)和CTXM-16(SEQ ID2)，如AAC-6’-lb-cr和杂合蛋白在大肠杆菌中以及CTMX-16在巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)中表达并纯化之后获得的。

图12示出了在构建EreB-H6-CTXM16(SEQ ID 20)融合体中获得的编码EreB(SEQID5)、TEM36(SEQ ID1)和EreB-H6-TEM36的DNA片段。

序列表说明

下表1总结了序列的列表并且与每个SEQ-ID(表中的ID No.)、序列类型、其名称、其来源、其表达生物体及其大小相匹配。

表1.序列表中序列1至22的鉴定

实施例1：由TEM-36和CTX-M16通过柔性接头的融合体组成的杂合蛋白分子

本发明的第一实施方案描述了IR-TEM(SEQ ID1；(Chaibi，Sirot等，1999))与头孢噻肟酶(SEQ ID2；(Bonnet，Dutour等，2001))通过柔性多聚甘氨酸接头(在该实施例中为6个甘氨酸残基)的融合体，并且产生能够水解甚至克拉维酸存在下的阿莫西林以及头孢曲松的杂合蛋白(SEQ ID8)。

编码蛋白质TEM-36(SEQ ID1)和CTX-M16(SEQ ID2)的核苷酸序列在巴斯德毕赤酵母的表达载体中通过基因合成而商购获得(https：//www.dna20.com/services/gene- synthesis？gclid＝CPnQIp3c9r0CFaoewwodnREAlg)。插入到表达载体中的TEM-36的核苷酸序列对应于SEQ ID 11，并且插入到表达载体中的CTX-M16的核苷酸序列对应于SEQ ID 12。然后，通过使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)和如表2中所示的构成蛋白质接头(在该实施例中为GGGGGG)的部分互补引物的PCR(95℃30秒-25个循环的[95℃30秒-TM℃45秒-72℃1分钟]-72℃5分钟-4℃)来扩增这些序列。使用TM为57℃的TEM36-F和TEM36-6G-R引物对来扩增TEM-36。使用TM为57℃的6G-CTXM16-F和CTXM16-R引物对来扩增CTXM16。接头GGGGGG的组成序列在表2中以粗体示出并且加有下划线。

表2用于构建和测序具有刚性接头的TEM-36/CTX-M16杂合蛋白的引物的列表。

将由此获得的两种PCR片段在55℃的TM下杂交，并使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)在没有引物下在5个PCR循环(95℃30秒-55℃45秒-72℃2分15)内使其互补。在添加外部引物(TEM36-F+CTXM16-R)之后重新扩增编码杂合蛋白的完整序列。通过PCR进行融合的这一实施方案示意性地示于图3中。

用XhoI和NotI限制性酶将由此产生的TEM36-GGGGGG-CTXM16融合体克隆在pJexpress915载体(在巴斯德毕赤酵母中表达)中(图4)。在两个方向上验证杂合构建体的序列，并且其对应于所描述的融合体。图5总结了用引物pJexpress915-SEQ-F和pJexpress915-SEQ-R获得的PCR片段。

在盐消耗的LB培养基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、NaCl 5g/l，pH＝7.5)上通过维持25μg/ml的Zeocine(Invitrogen)选择压力来在大肠杆菌DH10B中扩增表达TEM-36、CTX-M16和融合体TEM36-GGGGGG-CTXM16的pJexpress915载体。为了转化巴斯德毕赤酵母，通过在1500V下电击将2μg线性化载体与Swa I酶电穿孔到60μl感受态细胞中。将经转化的细胞在1ml的1M冷山梨醇中复苏并在30℃下放入培养物中2小时，之后涂布(200μl)在包含100至400μg/ml Zeocin和头孢硝噻吩(20μg/ml)的YPD-琼脂培养基(酵母提取物10g/l、蛋白胨20g/l、右旋糖20g/l、琼脂15g/l-磷酸盐10mM pH＝6.8)上。

pJexpress915载体从巴斯德毕赤酵母中的表达导致在培养基中发现目的蛋白的分泌。在包含头孢硝噻吩的YPD-琼脂板上，分泌的β-内酰胺酶在集落周围诱导代表表达水平的红色水解晕(λ＝486nm)。在孵育48小时之后，将每种构建体表达最佳的转化株接种在包含5ml YPD和100μg/ml Zeocin的Sterlin管中并在30℃和200rpm的搅拌下培养48小时。

然后，将预培养物以在600nm下为0.2的初始光密度在没有抗生素选择压力下接种在400ml(每个带挡板的锥形瓶200ml)的新鲜YPD培养基中。将培养物在以100rpm搅拌下于30℃下静置48小时。在4℃下以10,000×g离心15分钟之后，将培养基(上清液)在苄脒(1mM终浓度)存在下储存在4℃下。然后，如下将培养基中的蛋白质浓缩10倍：通过10kDa膜(Vivaflow 10模块，Sartorius)切向过滤至40ml的体积，然后在10kDa膜(Centricon，Millipore)上通过超滤直至10ml的体积。将10ml进样到尺寸排阻色谱柱(Superdex G75用于TEM-36和CTX-M16蛋白；Superdex G200用于熔融；26＊60柱GE Healthcare)上，并在10mM磷酸钠缓冲液(pH＝7.0)中通过1ml级分且以1ml/分钟的流量洗脱。

将对头孢硝噻吩具有最高活性(VWR)且纯度最佳(SDS-PAGE)的级分合并并浓缩至约0.1mg/ml至0.5mg/ml。通过BCA(Pierce)、280nm下的吸光度和在SDS-PAGE凝胶上验证来测量样品的蛋白质含量。图6提供了结果。

对于具有N-糖基化位点的CTX-M16和融合体，通过用EndoHf酶(NewEnglandBiolabs)根据生产商的建议切割糖来验证糖基化(在没有变性剂的条件下于37℃下过夜)。通过胰蛋白酶消化和MALDI-TOF质谱分析来确定产生并纯化的蛋白质。

如图6所示，TEM-36蛋白未被糖基化，并且其大小符合28kDa的预期大小，与CTX-M16蛋白和不同的融合体相对。后者在SDS-PAGE凝胶上的表观分子量较高(CTX-M16和融合体分别为45kDa相对于28kDa和＞66kDa相对于56kDa)。EndoHf的切割提供了具有预期分子量的蛋白质(CTX-M16和相应的融合体为28kDa和56kDa)，从而确定这些蛋白质被糖基化。

对不同的β-内酰胺(阿莫西林(Apollo Scientific)、(GlaxoSmithKline)和头孢曲松(Roche))测试经纯化的蛋白质。在25ml的反应体积中在pH-STAT(Titrino 2.5，Metrohm)下在37℃和pH＝7.0下进行测定。在0.3mM Tris缓冲液(150mM NaCl)中以4g/l制备底物。β-内酰胺核的酶水解释放酸并且导致pH下降。测定的原理是通过添加0.1N氢氧化钠来补偿酸化以维持在pH＝7.0。在这些条件下，1单位对应于每分钟添加1μmole氢氧化钠，即每分钟水解1μmoleβ-内酰胺。下表3列出了测量的每种蛋白质对三种底物的比活性(6次重复的平均值)。

表3.在巴斯德毕赤酵母中产生并纯化的具有柔性接头的杂合蛋白TEM-36/CTX-M16及其组成酶的比活性

这些结果表明，TEM-36与CTX-M16之间的融合产生对氨基青霉素类(甚至在β-内酰胺酶抑制剂存在下)和第三代头孢菌素类二者均具有活性的杂合蛋白。由于文献中(Ripoll，Baquero等，2011)将两种活性描述为拮抗剂，因此尚没有已知的天然酶对这两种底物具有这样的高催化常数。

实施例2：由CTX-M16和TEM-36通过柔性接头的融合体组成的杂合蛋白分子

本发明的第二实施方案描述了头孢噻肟酶(SEQ ID2；(Bonnet，Dutour等，2001))与IR-TEM(SEQ ID1；(Chaibi，Sirot等，1999))通过柔性接头多聚甘氨酸(在该实施例中为6个甘氨酸残基)的融合体，并且产生能够甚至水解甚至克拉维酸存在下的阿莫西林以及头孢曲松的杂合蛋白(SEQ ID9)。

该实施方案与实施例1中描述的相同，不同之处在于用于扩增CTXM16和TEM-36序列的PCR引物。

使用TM为58℃的CTXM16-F和CTXM16-6G-R引物对来扩增CTXM-16。使用TM为58℃的6G-TEM36-F和TEM36-R引物对来扩增TEM-36。接头GGGGGG的组成序列在表4中以粗体示出并且加有下划线。

表4用于构建和测序具有柔性接头的CTX-M16/TEM-36杂合蛋白的引物的列表。

将由此获得的两种PCR片段在55℃的TM下杂交，并使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)在没有引物下在5个PCR循环(95℃30秒-55℃45秒-72℃2分15)内使其互补。在添加外部引物(CTXM16-F+TEM-36-R)之后再扩增编码杂合蛋白的全序列。

用于表达和纯化CTXM16-GGGGGG-TEM36杂合蛋白的条件与实施例1中描述的那些严格相同。如图6中所示，由此获得的杂合蛋白也是糖基化的，并且将克拉维酸存在下的持久青霉素酶活性与头孢噻肟酶活性组合。

如实施例1中的情况，没有天然蛋白质对底物阿莫西林/克拉维酸和头孢曲松二者显示出表5中所述的比活性。

表5.在巴斯德毕赤酵母中产生并纯化的具有刚性接头的杂合蛋白CTX-M16/TEM-36及其组成酶的比活性

实施例3：由TEM-36和CTX-M16通过刚性接头的融合物组成的杂合蛋白分子

本发明的第三实施方案描述了IR-TEM(SEQ ID1；(Chaibi，Sirot等，1999))与头孢噻肟酶(SEQ ID2；(Bonnet，Dutour等，2001))通过刚性蛋白质接头(在该实施例中为基序G(EAAAK)₂)的融合体，并且产生能够水解甚至克拉维酸存在下的阿莫西林以及头孢曲松的杂合蛋白(SEQ ID10)。

该实施方案与实施例1中描述的相同，不同之处在于用于扩增CTXM16和TEM-36序列的PCR引物。使用TM为58℃的TEM36-F和TEM36-G(EAAAK)₂-R引物对来扩增TEM-36。使用TM为58℃的CTXM16-G(EAAAK)₂-F和CTXM16-R引物对来扩增CTXM16。接头G(EAAAK)₂的组成序列在表6中以粗体示出并且加有下划线。

表6.用于构建和测序具有刚性接头的CTX-M16和TEM-36杂合蛋白的引物的列表。

将由此获得的两种PCR片段在55℃的TM下杂交，并使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)在没有引物下在5个PCR循环(95℃30秒-55℃45秒-72℃2分15)内使其互补。在添加外部引物(TEM36-F+CTXM16-R)之后再扩增编码杂合蛋白的全序列。

用于表达和纯化TEM36-G(EAAAK)₂-TEM36杂合蛋白的条件与实施例1中描述的那些严格相同。由此获得的杂合蛋白也是糖基化的(图6)，并且将克拉维酸存在下的持久青霉素酶活性与头孢噻肟酶活性组合。

表7在巴斯德毕赤酵母中产生并纯化的具有柔性接头的CTX-M16/TEM-36杂合蛋白及其组成酶的比活性

如实施例1和2中，没有天然蛋白质对底物阿莫西林/克拉维酸和头孢曲松二者显示出表7中所述的比活性。

实施例4：由TEM-36和CTX-M16(且反之亦然)通过柔性接头的融合体组成的非糖基化杂合蛋白分子

TEM-36(SEQ ID1)和CTXM16(SEQ ID2)的编码序列在大肠杆菌的周质表达载体中通过基因合成而商购获得(https：//www.dna20.com/services/gene-synthesis？qclid＝ CPnQlp3c9r0CFaoewwodnREAlg)。用起始甲硫氨酸的NdeI限制性位点和终止密码子后的HindIII限制性位点与编码周质靶向肽(MSIQHFRVALIPFFAAFCLPVFA)的阅读框同步获得核苷酸序列。然后，将基因片段NdeI/HindIII亚克隆在pET-26b(+)载体(Invitrogen)中。

如图3所示，我们通过重叠PCR产生了两种杂合蛋白分子。通过使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)和构成接头蛋白(在该实施例中为GGGGGG)的部分互补引物的PCR(95℃30秒-25个循环的[95℃30秒-TM℃45秒-72℃1分钟]-72℃5分钟-4℃)来扩增TEM-36和CTX-M16的核苷酸序列。在55℃的TM下使用T7-F和TEM36-G6-R-co引物对或者TEM36-G6-F-c0和T7-R引物对来扩增TEM-36。在55℃的TM下使用CTXM16-G6-F-co和T7-R引物对或者CTXM16-G6-R-co和T7-F引物对来扩增CTXM16。接头GGGGGG的组成序列在表8中以粗体示出并且加有下划线。

表8.用于构建和测序具有柔性接头的TEM-36/CTX-M16杂合蛋白的引物的列表。

将由此获得的两种PCR片段(TEM36-G6+G6-CTXM16和CTXM16-G6+G6-TEM36)在53℃的TM下杂交，并使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)在没有引物下在5个PCR循环(95℃30秒-53℃45秒-72℃2分15)内使其互补。在添加外部引物(T7-F+T7-R)之后于55℃的TM下再扩增编码杂合蛋白的全序列。

用NdeI和HindIII限制性酶将由此产生的融合体TEM36-GGGGGG-CTXM16和CTX-M16-GGGGGG-TEM36克隆在pET26b+载体(在大肠杆菌中表达)中(图7)。

在两个方向上验证杂合构建体的序列并且揭示，2种杂合蛋白分子的接头实际上仅由5个甘氨酸组成。可能在PCR杂交时发生更有利的核酸重排。图8总结了用T7-F和T7-R引物获得的PCR片段。

在LB培养基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、NaCl 10g/l，pH＝7)上通过维持50μg/ml的卡那霉素(Euromedex)选择压力来在大肠杆菌DH10B中扩增表达TEM-36(SEQ ID1)、CTX-M16(SEQ ID2)以及融合体TEM36-G₅-CTXM16和CTXM16-G₅-TEM36的pET-26b(+)表达载体。通过热休克来用表达载体转化表达菌株BL21(DE3)pLysS。将经转化的细胞涂布在包含50μg/ml卡那霉素的LB-琼脂培养基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、NaCl10g/l、琼脂15g/l，pH＝7)上。

在大肠杆菌中从pET-26b(+)载体的表达导致目的蛋白在其具有功能的细菌周质隔室中寻址。以2种互补的方式来评价如实施例4中所述产生的融合体：(i)通过在生物化学上表征经部分纯化的蛋白质和(ii)通过比较不同β-内酰胺类(阿莫西林、Augmentin和Rocéphine)对表达菌株的最小抑制浓度(MIC)。

大肠杆菌中杂合蛋白分子及其组分的纯化

将经转化的细菌在100ml LB+50μg/ml卡那霉素中于37℃和200rpm的搅拌下培养，直到饱和。然后，将预培养物以1/40接种在1L LB培养基+50μg/ml卡那霉素中。当OD600nm的值达到0.6时(约2小时)，通过添加终浓度为0.5mM的最终IPTG来诱导蛋白质产生，并在20℃下在以200rpm搅拌下继续进行16小时。将细胞在4℃下以5,000×g离心15分钟，并将沉淀物立即在渗透缓冲液中进行处理以破坏外膜并回收周质。将细胞用1ml缓冲液(磷酸盐100mM、蔗糖500mM、EDTA 1mM，pH＝7.0)处理以使OD600nm为120个单位，并在涡旋均化下孵育数分钟(改编自(Schlegel，Rujas等2013)的方案)。在4℃下以12,000×g离心20分钟之后，将包含周质蛋白的上清液在Amicon Ultra(15ml，10kDa，Millipore)上浓缩，直到体积不超过10ml。将全部蛋白质进样到排阻色谱柱(Superdex G75，GE Healthcare)上，并将蛋白质在磷酸盐缓冲液(磷酸盐10mM、NaCl 100mM，pH＝7.0)中按照1ml的级分且以1ml/分钟的流量洗脱。将对头孢硝噻吩具有最高活性(VWR)且纯度最佳(SDS-PAGE)的级分合并，并浓缩至约0.1至0.5mg/ml。通过280nm下的吸光度和在SDS-PAGE凝胶上验证来测量样品的蛋白质含量。图9示出了如在生物化学表征之前获得的经部分纯化的蛋白质。

如上述实施例中所述，对不同的β-内酰胺类(阿莫西林(Apollo Scientific)、(GlaxoSmithKline)和头孢曲松(Roche))测量经纯化蛋白质的酶活性，并且结果汇编在下表9中。

表9.在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中产生并纯化的杂合蛋白分子TEM36-G₅-CTXM16和CTXM16-G₅-TEM36(柔性接头)及其组成酶的比活性。

如实施例1至3中，没有天然蛋白质对底物阿莫西林和头孢曲松二者显示出表9中所述的比活性。

表达杂合蛋白分子的大肠杆菌菌株针对不同β-内酰胺类的抗性：

将经转化的细菌(表达TEM36、CTXM16或者融合体TEM36-G5-CTXM16和CTXM16-G5-TEM36)或空载菌株(BL21(DE3)pLysS)放入5ml LB+50μg/ml卡那霉素的培养物中，当需要时在37℃和200rpm的搅拌下放入，直到饱和。然后，将预培养物以1/40接种在5ml LB+50μg/ml卡那霉素培养基中，并且当OD600的值达到0.6时(约2小时)，通过添加最终1mM的IPTG来诱导蛋白质产生，并在37℃下在以200rpm搅拌下继续进行1.5小时。

将细胞以10⁸cfu/ml归一化，并级联稀释至10⁷cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml，并将5μl的每种悬浮液置于包含提高浓度的抗生素(阿莫西林0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml；Augmentin 0μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml；和Rocéphine0μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml)的LB-琼脂板上。

将皿在37℃下孵育过夜，并在第二天记录结果。MIC对应于最高接种物不生长下的最低抗生素浓度。

数据在下表10中提供。

表10.β-内酰胺类抗生素对表达杂合蛋白分子TEM36-G₅-CTXM16和CTXM16-G₅-TEM36(柔性接头)及其组成酶的大肠杆菌菌株的MIC。

如实施例4所述的表达杂合蛋白分子的大肠杆菌细胞显示出针对氨基青霉素类(在例如克拉维酸的抑制剂存在或不存在下)和第三代头孢菌素类(例如头孢曲松)的多重抗药性表型。到目前为止，在文献中还没有描述具有这样的表型的天然细菌菌株。

实施例5：由CTX-M16和AAC-6’-lb-cr通过多聚组氨酸接头的融合体组成的杂合蛋白分子

编码CTX-M16(SEQ ID2)和AAC-6’-lb-cr蛋白(在下文称为AAC)(SEQ ID4)的核苷酸序列分别在大肠杆菌的表达载体pJexpress411(KanR)和pJ404(AmpR)中通过基因合成而商购获得。插入到pJexpress411载体中的CTX-M16的核苷酸序列对应于SEQ ID16，并且插入到pJ404载体中的AAC的核苷酸序列对应于SEQ ID12。然后，通过使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)和如表11所示的构成蛋白质接头(在该实施例中为HHHHHH)的部分互补引物的PCR(95℃30秒-25个循环的[95℃30秒-TM℃45秒-72℃1分钟]-72℃5分钟-4℃)来扩增这些序列。使用TM为62℃的6H-CTX-F和T7R引物对来扩增CTX-M16。使用TM为50℃的AAC-F_coli和AAC-6H-R引物对来扩增ACC。接头HHHHHH的组成序列在表11中以粗体示出并且加有下划线。

表11.用于构建和测序具有多聚组氨酸接头的AAC-H6-CTXM16杂合蛋白的引物的列表。

将由此获得的两种PCR片段在62℃的TM下杂交，并使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)在没有引物下在5个PCR循环(95℃30秒一62℃45秒一72℃2分15)内使其互补。在添加外部引物(AAC-F_coli+T7R)之后再扩增编码杂合蛋白的全序列。通过PCR进行融合的这一实施方案示意性地示于图3中。将编码AAC、CTXM16和融合体AAC-6H-CTXM16的插入片段上样在1％琼脂糖凝胶上以示出其相应大小(图10)。

根据图7中示出的原理用NdeI和HinDIII限制性酶将由此产生的AAC-6H-CTXM16融合体克隆在pET26b+载体(大肠杆菌表达)中。

在两个方向上验证杂合构建体的序列并且其对应于所描述的融合体。

在LB培养基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、NaCl 10g/l，pH＝7.5)上通过维持100μg/ml氨苄西林(Euromedex)和50μg/ml卡那霉素(Euromedex)的选择压力来将表达AAC的pJ404-AAC表达载体和表达AAC-H6-CTXM16融合体的pET-AAC-6H-CTXM16转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中。AAC以及AAC-6H-CTX融合体在大肠杆菌中从pJ404载体的表达产生目的蛋白的包涵体。

对于每种蛋白质，从饱和的预培养物以1/40接种1L的LB，然后在37℃下在以200rpm搅拌下培养直到OD(600nm)为约0.4至0.6。通过添加终浓度为0.5mM最终IPTG在37℃和200rpm下诱导培养物。在产生结束时，将细胞离心，并将沉淀物以40ml/L的培养物在裂解缓冲液(10mM Tris-HCl、150mM NaCl、1mM EDTA、0.1％Triton X100 pH＝8.0和0.25mg/ml溶菌酶)中进行处理，然后在-80℃下冷冻。将细胞解冻并在环境温度下在MgSO₄(20mM)和DNA酶(10μg/ml)存在下裂解45分钟。将裂解物离心(在4℃下以12，000×g进行30分钟)并将包含目的蛋白(AAC和AAC-6H-CTXM16)的包涵体的沉淀物在缓冲液A(10mM磷酸盐、150mMNaCl、10mM咪唑、8M脲，pH＝8.0)中进行处理。通过镍亲和色谱来纯化蛋白质并用缓冲液B(10mM磷酸盐、150mM NaCl、500mM咪唑、8M脲，pH＝8.0)的梯度洗脱。

将包含目的蛋白的级分混合，在4℃下在1mM DTT存在下孵育1小时，然后在10mM磷酸盐缓冲液(150mM NaCl，pH＝8)中通过连续3次透析来复性。通过离心使蛋白质澄清，然后通过10kDa膜(Centricon，Millipore)进行超滤来将其浓缩至不超过10ml的体积。将蛋白质进样到尺寸排阻色谱柱(Superdex G200；柱26＊60 GE Healthcare)上并在10mM磷酸盐缓冲液(150mM NaCl，pH＝8.0)中以1ml/分钟的流量通过1ml级分洗脱。

将对头孢硝噻吩具有最高活性(VWR)且纯度最佳(SDS-PAGE)级分合并，并浓缩至约0.5mg/ml。通过BCA(Pierce)、280nm下的吸光度和在SDS-PAGE凝胶上验证来测量样品的蛋白质含量。图11示出了所得的经纯化蛋白质的结果。

对不同的抗生素测试经纯化的蛋白质：β-内酰胺类的头孢曲松(Roche)和氨基糖苷类的卡那霉素。在25ml的反应体积中在pH-STAT(Titrino 2.5，Metrohm)下在37℃和pH＝7.0下进行对头孢曲松的测定。在0.3mM Tris缓冲液(150mM NaCl)中以4g/l制备底物。β-内酰胺核心的酶水解释放酸并且导致pH下降。测定的原理是通过添加0.1N氢氧化钠来补偿酸化以维持在pH＝7.0。在这些条件下，1单位对应于每分钟添加1μmol氢氧化钠，即每分钟水解1μmolβ-内酰胺。

用乙酰-CoA(Sigma-Aldrich)作为乙酰基供体，用卡那霉素作为受体，并用Elleman试剂(DTNB，Sigma-Aldrich)滴定在酶反应期间释放的辅酶A还原(-SH)分子通过间接比色测定来测量乙酰转移酶的活性[参考]。在微量滴定板上用提高量的经纯化酶在200μl的终体积中并以500μM卡那霉素、500μM乙酰CoA和250μM DTNB的浓度进行反应。在这些试验条件下，TNB^2-离子在412nm下以ε_(λ＝412nm)表观19000M^-1.孔^-1(96孔板的孔填充有200μl)吸收，并且1单位对应于在37℃下每分钟释放1纳摩尔TNB^2-。

下表12总结了测量的每种蛋白质对三种底物的比活性(6次实验的平均值，即n＝6)。

表12.杂合蛋白AAC-H6-CTX-M16及其组成酶的比活性

这些结果表明，AAC-6’-lb-cr与CTX-M16之间的融合产生能够水解第三代头孢菌素类并且通过乙酰化使氨基糖苷失活的杂合蛋白。没有已知的天然酶能够使属于这两个类别的抗生素失活。

实施例6：由EreB和TEM36通过标签多聚组氨酸型接头的融合体组成的非糖基化杂合蛋白分子

编码TEM-36(SEQ ID1)和EreB(SEQ ID5)的序列在大肠杆菌的表达载体中通过基因合成而商购获得。然后，将基因片段NdeI/HindIII亚克隆在pET-26b(+)载体(Invitrogen)中。

根据图3描述的原理，我们通过重叠PCR产生了EreB-H6-TEM36杂合蛋白分子。通过使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)和构成性蛋白质接头(在该实施例中为6个组氨酸的标签)的部分互补引物的PCR(95℃30秒-25个循环的[95℃30秒-TM℃45秒-72℃1分钟]-72℃5分钟-4℃)来扩增TEM-36和EreB的核苷酸序列。在65℃的TM下使用EreB6HTEM36_coli_F和T7_R引物对来扩增TEM-36。在65℃的TM下使用EreB_coli_F和EreB6HTEM36_R引物对来扩增EreB。接头HHHHHH的组成序列在表13中以粗体示出并且加有下划线。

表13.用于构建和测序EreB-H6-TEM-36杂合蛋白的引物的列表

将由此获得的PCR片段在55℃的TM下杂交，并使用高保真DNA聚合酶(Pfu，Promega)在没有引物下在5个PCR循环(95℃30秒-55℃45秒-72℃2分15)内使其互补。在添加外部引物(EreB_coli_F+T7-R)之后在55℃的TM下再扩增编码杂合蛋白的全序列。

用NdeI和HindIII酶限制性位点将由此产生的EreB-H6-TEM36融合体克隆在pET26b+载体(在大肠杆菌中表达)中(图7)。

在两个方向上验证杂合构建体的序列。图12总结了用T7-F和T7-R引物对pET-TEM36、EreB和EreB-H6-TEM36系列获得的PCR片段。

在LB培养基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、NaCl 10g/l，pH＝7)上在维持50μg/ml卡那霉素(Euromedex)选择压力的同时在大肠杆菌DH10B中扩增表达TEM-36(SEQID1)、EreB(SEQ ID2)和融合体EreB-H6-TEM36的pET-26b(+)表达载体。通过热休克用表达载体转化表达菌株BL21(DE3)pLysS。将经转化的细胞涂布在包含50μg/ml卡那霉素的LB-琼脂培养基(酵母提取物5g/l、胰蛋白胨10g/l、NaCl 10g/l、琼脂15g/l，pH＝7)上。

通过测量表达菌株对不同β-内酰胺型抗生素(阿莫西林和augmentin)和大环内酯型抗生素(红霉素)的抗性来评价目的蛋白(TEM36、EreB和融合体EreB-H6-TEM36)在大肠杆菌中的功能性。

将经转化的细菌(表达TEM36、EreB或EreB-H6-TEM36)或空载菌株(BL21(DE3)pLysS)放入5ml LB+50μg/ml卡那霉素中的培养物中，当需要时在37℃下在以200rpm搅拌下，直到饱和。然后，将预接种物以1/40接种在5ml LB+50μg/ml卡那霉素培养基中，并当OD600nm的值达到0.6时(约2小时)，通过添加1mM最终IPTG来诱导蛋白质产生，并在37℃在以200rpm搅拌下继续进行1.5小时。

将细胞相对于10⁸cfu/ml归一化并级联稀释至10⁷cfu/ml、10⁶cfu/ml、10⁵cfu/ml、10⁴cfu/ml，并将5μl的每种悬浮液置于包含提高浓度的抗生素的LB-琼脂皿上(阿莫西林0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml、2048μg/ml；Augmenting 0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml；和红霉素0μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、8μg/ml、16μg/ml、32μg/ml、64μg/ml、128μg/ml、256μg/ml、512μg/ml、1024μg/ml)。

将皿在37℃下孵育过夜，并在第二天记录结果。MIC对应于最高接种物不再生长下的最低抗生素浓度。

数据在下表14中提供。

表14.β-内酰胺类和大环内酯类抗生素对表达EreB-H6-TEM36杂合蛋白分子及其组成酶的大肠杆菌菌株的MIC。

如实施例6所述的表达杂合蛋白分子的大肠杆菌细胞显示出针对氨基青霉素类(在例如克拉维酸的抑制剂存在或不存在下)和大环内酯类(例如红霉素)的多重抗药性表型。到目前为止，在文献中还没有描述有天然细菌菌株具有这样的由单蛋白质的表达产生的表型。

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Claims (22)

1.杂合蛋白分子，其包含抑制至少一种抗生素的活性的结合在一起的两种酶，所述酶中的一种为β-内酰胺酶并且所述酶中的另一种为选自以下的酶：β-内酰胺酶、抑制氨基糖苷类的酶、抑制氟喹诺酮类的酶、抑制大环内酯类的酶、抑制四环素类的酶或抑制林可酰胺类的酶。

2.根据权利要求1所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述杂合蛋白分子包含连接在一起的两种β-内酰胺酶。

3.根据权利要求1所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述抑制氨基糖苷类的酶为磷酸转移酶、核苷酸基转移酶或乙酰转移酶。

4.根据权利要求1所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述抑制氟喹诺酮类的酶为氨基糖苷N-乙酰转移酶。

5.根据权利要求1所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述抑制大环内酯类的酶为红霉素酯酶或红霉素磷酸转移酶。

6.根据权利要求1所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述抑制四环素类的酶为NADPH依赖性四环素氧化还原酶。

7.根据权利要求1所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述抑制林可酰胺类的酶为林可霉素核苷酸基转移酶。

8.根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶中至少一种的序列与SEQ ID1具有至少40％的序列同源性。

9.根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶中至少一种的序列与SEQ ID2具有至少40％的序列同源性。

10.根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶中至少一种的序列与SEQ ID3具有至少40％的序列同源性。

11.根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶中至少一种的序列与SEQ ID4具有至少40％的序列同源性。

12.根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶中至少一种的序列与SEQ ID5具有至少40％的序列同源性。

13.根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶中至少一种的序列与SEQ ID6具有至少40％的序列同源性。

14.根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶中至少一种的序列与SEQ ID7具有至少40％的序列同源性。

15.根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶融合成单链蛋白质。

16.根据权利要求1至14中任一项所述的杂合蛋白分子，其特征在于所述酶通过交联共价连接在一起。

17.包含根据前述权利要求中任一项所述的杂合蛋白分子的人用或兽用药物组合物，其用于防止肠菌群改变。

18.根据权利要求17所述的药物组合物，其用于防止医院内感染。

19.根据权利要求17或18所述的药物组合物，其用于预防与施用抗生素相关的腹泻。

20.根据权利要求17至19中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物为用于经口施用的剂型。

21.根据权利要求17至20中任一项所述的药物组合物，其特征在于所述药物组合物包含至少一种胃保护剂。

22.用于在非人活重组生物体中产生根据权利要求1至16中任一项所述杂合蛋白分子的方法。