CN1431310A

CN1431310A - 转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体

Info

Publication number: CN1431310A
Application number: CN03111725A
Authority: CN
Inventors: 孙汶生; 马春红; 刘素侠; 曹英林; 张利宁; 王晓燕; 高立芬
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2003-01-16
Filing date: 2003-01-16
Publication date: 2003-07-23

Abstract

转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体，属于乙肝病毒相关肝细胞肝癌基因技术领域。包括甲胎蛋白介导的外源DNA、配体寡肽、多聚阳离子多肽和内吞小体释放寡肽。配体寡肽是针对表皮生长因子受体的多肽，多聚阳离子多肽为多聚赖氨酸或多聚精氨酸，内吞小体释放寡肽是流感病毒血凝素HA氨基端的20肽，外源DNA为含肝癌特异性转录调控序列及HBV反义基因片段的真核型表达载体。本发明的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体的应用于体内外抑制肝癌生长。

Description

转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体

(一)技术领域

本发明涉及乙肝病毒相关肝细胞肝癌基因，具体涉及由表皮生长因子受体和肝癌特异性转录调控序列介导的可在转移、转录水平双重控制的肝癌靶向性基因转移载体。

(二)背景技术

基因治疗的关键在于如何在靶细胞内特异的表达目的基因，即靶向性问题。建立良好的基因转移载体是其关键。目前，基因治疗中常用的两类载体：病毒型载体和质粒型载体。这两类载体各有其特点。病毒型载体中常用的有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等，其中又以前两者在基因治疗中应用最广。逆转录病毒主要作用于分裂增殖细胞，因此对肝癌细胞具有相对靶向性，可整合于细胞染色体基因组而持续、稳定地表达，体内应用极少引起免疫反应，但难于制备高滴度的病毒，转染效率不高，而且有诱发插入性突变的可能。因体内应用肝癌细胞低表达，故不适合直接体内基因转导。腺病毒既可感染分裂细胞也可感染处于静止期的细胞，因此对肝癌细胞靶向性不强，可在非肿瘤组织中产生毒性反应，腺病毒不整合入宿主基因组，故不能长期稳定表达，但具安全性，并可制备出高滴度的病毒，转染效率较高，故应用最多。但是腺病毒载体存着不能长期稳定表达、转染靶细胞后产生免疫反应从而降低转染效率和限制重复应用及对肝细胞有损伤作用等缺点。与此相比，质粒型载体无病毒成分存在，具有更好的生物安全性。

质粒型载体进入受体细胞，必须借助有效的基因转移系统。自1987年首先利用偶联了脱唾液酸人血清类粘蛋白的多聚赖氨酸与质粒形成复合物将质粒特异性导入肝细胞表达。之后，以细胞受体介导的肝脏的靶向基因转移系统受到普遍关注。1998年，上海肿瘤研究所田培坤、顾健人教授等建立了一种新的细胞表面受体为靶向的高效基因导入系统，参见田培坤，顾建人等，一种新的以细胞表面受体为靶向的基因导入系统，中国科学C辑，28(6)：554-558。设计针对表皮生长因子受体(EGFR)的16肽GE7作为配体寡肽(Ligandoligopeptide，LOP)，建立受体介导的四元复合体，将β-gal基因特异性导入多种肿瘤细胞，显示了其在基因治疗中的优势和潜在应用价值。但是，必须考虑到受体的表达并非肿瘤专一。有些正常组织同样可有一定数量的某种在肿瘤细胞高表达的受体，如表皮生长因子受体EGFR即具有这种特性。田培坤等利用含针对EGFR的GE7配体寡肽的四元复合体导入β-gal基因时，发现β-gal虽然在心、肝、肾、肺、脾等重要脏器不表达，但可表达于皮肤表皮、胃及精细管上皮细胞。这些结果提示四元复合体介导的基因转染其靶向性受EGFR表达的非特异性而具有一定局限性。

(二)发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一类可在转录、转移水平双重控制的肝癌靶向性基因转移载体，此类载体是甲胎蛋白(AFP)介导的外源DNA-配体寡肽-多聚阳离子多肽-内吞小体释放寡肽组成的甲胎蛋白(AFP)增强型表皮生长因子受体(EGFR)介导的肝癌靶向性基因转移表达。本发明的另一个内容是提出甲胎蛋白(AFP)增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体在体内外对肝癌的抑制作用。

本发明的第一方面提供甲胎蛋白(AFP)增强型表皮生长因子受体(EGFR)介导的肝癌靶向性基因转移表达载体，包括甲胎蛋白(AFP)介导的外源DNA、配体寡肽、多聚阳离子多肽和内吞小体释放寡肽。

上述配体寡肽是针对表皮生长因子受体的多肽；多聚阳离子多肽为多聚赖氨酸或多聚精氨酸；内吞小体释放寡肽是流感病毒血凝素HA氨基端的20肽；外源DNA为含肝癌特异性转录调控序列及HBV反义基因片段的真核型表达载体。

上述的多聚赖氨酸或多聚精氨酸的分子量范围为：12万～80万。

AFP增强型外源DNA为含肝癌特异性转录调控序列及HBV反义基因的真核型表达载体，包括携带有肝癌特异性转录调控序列AFP启动子及增强子的腺病毒载体、腺相关病毒载体及其他以AFP启动子及增强子为顺式调控序列的真核表达载体；HBV反义基因包括HBV各亚型全基因及HBV各种不同片段的反义基因。配体寡肽是针对表皮生长因子受体的多肽；阳离子多肽为多聚赖氨酸或多聚精氨酸；内吞小体释放寡肽是流感病毒血凝素HA氨基端的20肽。本发明借助AFP启动子和表皮生长因子受体介导外源基因在AFP阳性表达的肝癌中特异性靶向表达，是一种新型的肝癌基因转移技术。

转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体的制备方法如下：

以美国ABI多肽合成仪合成针对表皮生长因子受体(EGFR)的16肽GE7、流感病毒血凝素功能域20肽HA20，按操作说明完成。通过混合配体寡肽GE7、多聚阳离子多肽和内吞小体释放寡肽HA20，实现共价连接，将GE7、HA20分别与-多聚赖氨酸连接形成共价连接物。将此共价连接物与肝癌特异性表达质粒pEBAF-as-preS2(AFP启动子控制的含HBV preS2反义基因的真核表达载体)混合，籍静电作用结合为pEBAF-as-preS2-配体寡肽-阳离子多肽-内吞小体释放寡肽的AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移载体。图1为此转移载体的1％琼脂糖凝胶电泳图。以此转移载体尾静脉注射，转染荷瘤鼠，3天后，抽提RNA，逆转录PCR证实HBpreS2反义RNA仅表达于肿瘤组织，在其它重要脏器，包括胃粘膜上皮细胞和精细管上皮细胞中没有表达。图2是荷瘤鼠组织逆转录PCR电泳结果图。

本发明的第二方面是甲胎蛋白(AFP)增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移表达载体应用于体内外抑制肝癌生长。

体外实验：将含有pre2反义RNA的AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移载体体外转染肝癌细胞，3天后，取上清，酶联免疫吸附法测定HBV表面抗原和核心抗原表达量；同时，荧光定量PCR测定HNV DNA量。结果表明：针对preS2的反义RNA可显著抑制HBV表面抗原和核心抗原表达，分别为33.4％和58.5％；对HBV DNA复制的抑制率为86％。

体内实验：1×10⁷肝癌细胞腋窝皮下注射，制备荷瘤动物模型，当瘤体直径＞＝0.5cm时，同上制备包裹反义RNA载体的AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移载体，瘤内皮下注射含0.2μg DNA的AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移表达系统，每周1次，共4次，注射完成1周后，瘤体直径0.995cm±0.35，显著低于生理盐水对照组。

优良效果：

转移载体尾静脉注射，转染荷瘤鼠，3天后，抽提RNA，逆转录PCR证实HBpreS2反义RNA仅表达于肿瘤组织，在其它重要脏器，包括胃粘膜上皮细胞和精细管上皮细胞中没有表达。

将含有pre2反义RNA的AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移载体体外转染肝癌细胞，3天后，取上清，酶联免疫吸附法测定HBV表面抗原和核心抗原表达量；同时，荧光定量PCR测定HNV DNA量。结果表明针对preS2的反义RNA对抗原的抑制作用最强，HBsAg、HBeAg分泌量分别降低了33.4％和58.5％。荧光定量PCR结果表明针对preS2的反义RNA对HBV DNA复制的抑制率为86％。

将含有pre2反义RNA的AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移载体对荷瘤鼠行瘤内皮下注射，4次注射后，裸鼠肿瘤直径为0.995cm±0.35，显著低于生理盐水对照组(2.125cm±0.25)，P＜0.05。

(四)附图说明

图1为本发明的基因转移载体的1％琼脂糖凝胶电泳图。其中，1、DNA分子量，从上至下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，125bp；2～7、分别为GE7、HA20-多聚赖氨酸共价连接物与肝癌特异性表达质粒pEBAF-as-preS2按1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5的比例混合。

图2是荷瘤鼠组织逆转录PCR电泳结果图。其中，8、输精管上皮中逆转录PCR产物9、胃组织中逆转录PCR产物，10、肝组织中逆转录PCR产物，11、脾组织中逆转录PCR产物，12、心组织中逆转录PCR产物，13、肿瘤组织中逆转录PCR产物，14、肿瘤组织中逆转录PCR产物，15、DNA分子量，从上至下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，125bp。

(五)具体实施方式

实施例1：PCR扩增preS2基因：

扩增、纯化pBR322-2HBV质粒DNA，以此为模板，PCR扩增preS2基因。25μL PCR反应体系中，分别含有质粒DNAlng、10×PCR buffer 2.5μL、Mg²⁺0.5mmol/L、dNTP 5nmol/L、Taq酶3U及上、下游引物10nmol/L。反应条件为：94℃预变性5min后，进行35轮循环(94℃变性40sec，50℃退火40sec，72℃延伸50sec)，最后72℃延伸7min。

实施例2：针对preS2反义RNA肝癌靶向性表达载体的构建：

preS2 PCR扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳后，切下含目的基因片段的凝胶，按DNA纯化回收试剂盒操作步骤回收扩增产物。Xbal分别酶切PCR产物和pEBAF质粒DNA，T4连接酶室温连接过夜。次日取连接产物10μl转化DH5α，获得重组阳性单克隆。

实施例3：AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移表达系统的制备

针对表皮生长因子受体(EGFR)的16肽GE7、流感病毒血凝素功能域20肽HA20在美国ABI多肽合成仪上，按操作说明完成。将GE7、HA20分别与多聚阳离子多肽。共价连接，制备为GE7-PL、HA20-PL共价连接物。将实施例2中制备的肝癌靶向性质粒DNA与共价连接物分别以不同比例均匀混合于10μl灭菌三蒸水中，25℃静置30min后，将10μl混合物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA阻滞情况，以DNA完全被阻滞在加样孔中的浓度比为最佳配比。按最佳配比，将质粒DNA缓慢滴加于GE7-PL、HA20-PL共价连接物中，边加边混匀，25℃静置30min。1％琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA阻滞情况后立即用于基因转染。实施例4：AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移表达系统体外基因导入试验

接种5×10⁴/孔的细胞于24孔板，24hr后，细胞长满至60％左右，用于转染。转染时同上制备AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移表达系统，去掉培养细胞的培养液，换上上述制备好的含有0.2μg AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移表达系统的完全培养基0.5ml，37℃，5％CO₂培养箱转染过夜，换为不含AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移表达系统的新鲜完全MEM培养基，继续37℃，5％CO₂培养箱培养，3天后收集上清测定HBV抗原。未转染的HepG2.2.15细胞为对照。实施例5：HBV抗原的检测

以酶联免疫吸附法测定上清中HBsAg、HBeAg含量。将微孔条固定于支架上，每孔加入50μl待测样品，设阴、阳性对照各2孔，50μl/孔，并设空白对照1孔。再每孔加酶标记物50μl(空白对照不加)，充分混匀，37℃孵育30min；弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置1min，倾去孔内液体，扣干。每孔加显色剂A、B各50μl，振荡混匀，置37℃孵育15min。阳性孔呈蓝色。每孔加入50μl终止液(2MH₂SO₄)，轻轻混匀，终止反应，用美国产EL312型酶标仪测定各孔OD值。检测波长495nm，参考波长为630nm。检测结果以P/N值表示，P/N＝标本A/阴性对照A。抗原抑制率＝(实验孔P/N-对照孔P/N)/(对照孔P/N-2.1)。P/N值＝实验孔A值/阴性对照A值。实施例6：荧光定量PCR检测HBV DNA(1)标本及对照标准品的处理

取转染细胞培养上清40μl，分别加等量DNA提取液混匀，沸水浴10min，转至4℃静置8-12hr以保证病毒颗粒充分裂解。10000rpm离心5min，取上清2μl作PCR反应。另取阳性对照标准品和阴性对照标准品各10μl同上处理。(2)PCR扩增及反应前荧光检测

取单管单人份PCR反应管一管，直接加入处理后样品或定量标准品2μl，6000rpm离心数秒，将各反应管放入PCR仪，按下列条件扩增：93℃ 2min预变性，然后按93℃ 45秒，55℃120秒，反应10个循环后置33℃保温，3min后迅速逐个将反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数A0，荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。最后按93℃ 45秒，55℃120秒，共做30个循环后，置33℃保温。(3)PCR反应后荧光检测

待各PCR管充分冷却置33℃后，迅速迅速逐个将反应管放入荧光检测仪，读取并记录读数A1，荧光激发波长为487nm，检测波长为525nm。(4)结果判定

计算Ax＝A1-A0，并以标准品计算值制作标准曲线，并由此查出待测值。最后计算单位为病毒粒子/ml。实施例7：荷瘤动物模型的制备

5-6周龄雄性裸鼠6只，1×10⁷/ml对数生长期HepG2.2.15细胞腋窝皮下注射0.1ml，3周后实体瘤长至0.5cm时用于实验。实施例8AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移表达系统体内抑瘤实验

同上制备AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移表达系统。取荷瘤裸鼠，瘤体大于等于0.5cm时，用药，0.2μg/鼠，每周1次，共4次。生理盐水注射组为对照，逐日观察，5周后处死裸鼠，分离瘤体，测量直径。

Claims

1.转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体，其特征在于，包括甲胎蛋白介导的外源DNA、配体寡肽、多聚阳离子多肽和内吞小体释放寡肽。

2.如权利要求1所述的转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体，其特征在于，所述配体寡肽是针对表皮生长因子受体的多肽。

3.如权利要求1所述的转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体，其特征在于，所述多聚阳离子多肽为多聚赖氨酸或多聚精氨酸。

4.如权利要求1所述的转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体，其特征在于，所述内吞小体释放寡肽是流感病毒血凝素HA氨基端的20肽。

5.如权利要求1所述的转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体，其特征在于，所述外源DNA为含肝癌特异性转录调控序列及HBV反义基因片段的真核型表达载体。

6.权利要求1所述的转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体的制备方法，以美国ABI多肽合成仪合成针对表皮生长因子受体的16肽GE7、流感病毒血凝素功能域20肽HA20，通过混合配体寡肽GE7、多聚阳离子多肽和内吞小体释放寡肽HA20，实现共价连接，将GE7、HA20分别与-多聚赖氨酸连接形成共价连接物，将此共价连接物与肝癌特异性表达质粒pEBAF-as-preS2混合，籍静电作用结合为pEBAF-as-preS2-配体寡肽-阳离子多肽-内吞小体释放寡肽的AFP增强型EGFR介导的肝癌靶向性基因转移载体。

7.权利要求1所述的转录、转移双重控制的甲胎蛋白增强型表皮生长因子受体介导的肝癌靶向性基因转移载体的应用，其特征在于，应用于体内外抑制肝癌生长。