CN1426309A - 佐剂化的基因疫苗 - Google Patents

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Abstract

描述用于核酸免疫技术的试剂。更具体的，描述了佐剂化的基因疫苗组合物，以及利用这些组合物来诱导增强的抵抗所选抗原的免疫应答的方法。

Description

佐剂化的基因疫苗
技术领域
本发明涉及分子生物学和免疫学的基本领域，以及通常涉及用于核酸免疫技术的试剂。更具体的，本发明涉及疫苗组合物以及利用这些疫苗组合物来诱导增强的免疫应答抵抗所选抗原的方法。
发明背景
以前已描述注射DNA和mRNA到哺乳动物组织中来免疫抵抗表达产物的技术。参见，例如，欧洲专利EP 0 500 799和U.S.No.5,589,466。在此称为“核酸免疫”的技术，已被表明引发体液的和细胞介导的免疫应答。例如，来自用编码外壳糖蛋白，gp 160，的DNA构建体免疫小鼠的血清，在免疫测定显示出与重组160反应，且来自被注射小鼠的淋巴细胞在对重组gp120的应答中显示出了增殖。Wang等(1993)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：4156-4160。相似的，用人生长激素(hGH)基因免疫的小鼠论证了基于抗体的免疫应答。Tang等(1992)自然(Nature)356：152-154。由哺乳动物启动子引发编码流感核蛋白的DNA的肌内注射显示出引发CD8+溶细胞性的T淋巴细胞(CTL)应答，其可保护小鼠抵抗随后的致命的病毒攻击。Ulmer等(1993)科学(Science)259：1745-1749。注射位点的免疫组织化学的研究显示DNA被成髓细胞吸收，且病毒蛋白的细胞质生产被证明持续至少6个月。
因此这些所谓的“基因疫苗”被证明在被治疗的动物中引发免疫应答，其与在施用活减毒疫苗后观察到的免疫应答类似，减毒疫苗是目前所用疫苗的最有效的形式。基于核酸的疫苗的理论有效性来源于疫苗组合物引发重新生产正确折叠的蛋白抗原的能力，该蛋白抗原可导致识别复合的三维表位的抗体应答。此外，这些抗原在特定抗原呈递细胞中的体内产生导致加工的肽片段由MHC I类分子呈递，导致抗原特异性溶细胞性的T淋巴细胞(CTLs)的激活。
迄今为止，最有效的核酸免疫技术包括通过颗粒介导，胞内的递送(delivery)将DNA疫苗组合物递送到表皮。参见，例如，欧洲专利No.0 500 799。此技术避免了胞外递送的缺陷(例如，通过针或注射器递送到皮肤或肌肉)，因为人们确信大多数的此种胞外递送的DNA是快速降解的，因此需要接种超量DNA仅仅来达到充分水平的抗原表达。颗粒介导的DNA递送到表皮，在一方面，直接地递送质粒DNA的胞内沉淀到表皮细胞中，包括表皮朗格罕氏细胞(Langerhans cells)。因为此直接的胞内递送，DNA避免了被胞外核酸酶作用且仅非常少量的DNA需要被递送。事实上，通常单独施周之后，用纳克级量的所给质粒DNA进行的颗粒介导的免疫可导致引发非常强烈的体液和CTL应答。
疟疾是一种普遍和重要的人类疾病，尤其在一些热带国家。疾病由蚊子携带的寄生虫恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)和间日疟原虫(Plasmodium vivax)引起的。然而疟疾疫苗研究还需安全，实用，和有效的预防性疫苗产物的发展。尽管大量实例的显著免疫应答已经在动物模型和人自愿受试者中通过使用许多种的试验疫苗被引发，由此种接种赋予的在人临床试验中实际上的保护却令人非常失望的低。增加的对疟疾寄生虫生活周期的理解以及来自不同寄生虫生活阶段的重要抗原的鉴定使得制备来引发保护性抗体以及细胞效应细胞，例如CTLs，的各种疫苗策略得到了发展。
疟疾的疾病周期开始于蚊子的咬伤，其注射传染性的疟疾子孢子到血液中。因此子孢子特异性抗体是预防或显著限制肝细胞在此阶段感染的有效方式看起来是很合理的。在肝细胞被感染后，然而寄生虫在肝细胞的胞内发育且可能避开循环抗体(circulating antibody)。在此阶段，在裂体性孢子或血液阶段的裂体性孢子释放之前在感染的肝细胞表面子孢子特异抗原的呈递提供了疟疾特异的CTLs的有吸引力的靶。此效应器能够在成熟血液裂体性孢子的第一次释放之前除去感染的肝细胞或引发破坏胞内寄生虫。
发明概述
本发明的主要目的是提供新的组合物来用于核酸(基因)接种方法。这些组合物结合含有编码目的抗原序列的核酸分子和佐剂，其中的佐剂以不同于DNA的形式存在于组合物中，且用于直接的胞内递送组合物-编码抗原的序列以及非DNA佐剂。因此，本发明组合物显著地有别于以前的DNA疫苗组合物，其可以结合编码抗原的序列和编码佐剂的序列。此外，有目的递送非DNA佐剂到靶细胞上是非直觉的，因为已知佐剂在胞外基础上行使功能，例如通过形成一个胞外储存，并且当这些元件存在于胞外区域时，免疫感受态细胞可以和佐剂相互作用来产生所期望的佐剂效果。这些新组合物的佐剂成分可以以大量的不同的形式被提供，例如，但不限于，以蛋白质，脂类，非蛋白的激素或其类似物，维生素或其类似物，来自细菌培养物的纯化的蛋白(例如卡介苗(BacillusCalmette guerin))，分支杆菌细胞壁骨架物质，皂草苷或其衍生物，或类似物等的形式来提供。
因此，本发明提供了一种组合物其含有(a)含有编码目的抗原的序列的核酸分子；以及(b)一种佐剂，当其在接种个体的细胞中表达时其有效地增强至少一种免疫应答的成分直接抵抗抗原，其中的佐剂以不同于DNA的形式存在于组合物中。在一个具体的实施方案中，核酸分子被提供在载体构建体中，优选为质粒。组合物也优选包被在核心载体颗粒上，例如包被在金或钨冲击载体颗粒上。所选抗原可被获得或来源于任意的被期望引发免疫应答抵抗的因子，且因此可来自感染的或寄生虫疾病因子，肿瘤特异的或“自体”抗原，变态反应原，等等。在一个具体的实施方案中，抗原是病毒抗原，例如来自肝炎B病毒(HBV)，人体免疫缺陷病毒(HIV)或流感病毒的抗原。在另一个实施方案中，抗原来自寄生虫，例如疟疾寄生虫。所选佐剂可以为任意合适的佐剂组合物。在一个具体的实施方案中，佐剂至少部分溶于乙醇中。优选的佐剂包括单磷酰基脂A(MPL)，以及皂草苷例如Quil-A。其它优选的佐剂为在本文所描述的所谓免疫改变佐剂(immune shift adjuvant)。所有的这些佐剂可被用在药剂的生产中来用于核酸免疫技术。
本发明也提供了利用上述的组合物来引发免疫应答抵抗接种的个体中所选的抗原。这些方法需要直接递送充分量的组合物到个体靶位点的细胞来产生所期望的免疫应答。在特定的实施方案中，组合物首先被包被到核心载体颗粒(例如金或钨冲击颗粒)上并通过穿越皮肤的接种(transdermal)递送技术给药，例如颗粒介导的递送技术。优选的靶组织因此为表皮组织。
本发明的主要目的也是为了提供新的组合物来用于核酸(遗传)接种方法其中组合物由含有编码目的抗原的序列的核酸分子和免疫改变佐剂结合形成，该免疫遗传改变佐剂有效地增强引发抵抗接种个体中的抗原的免疫应答的Th1成分。这里免疫改变佐剂也是以不同于DNA的形式存在于组合物中，且组合物用于直接的胞内递送。在特定的实施方案中，抗原来自传染性或寄生虫疾病因子和/或免疫改变佐剂是单磷酰基脂A。组合物可被包被在核心载体颗粒上来提供药理制剂。
本发明的另一个进一步的目的是提供一种方法来引发免疫应答抵抗个体(例如，接种抵抗一种传染性疾病因子)中的所选抗原，其包括步骤递送在抗原的个体细胞中在充分的水平引起表达的基因构建体到细胞中来产生抗原特应性免疫应答；以及邻近在递送遗传构建体时共同给药(coadminister)个体有效量的免疫改变佐剂来充分的引起在没有免疫改变佐剂的应答的接种个体中被引发的Th1和Th2型免疫应答平衡的改变。本发明因此通过利用改变或重新引导个体对基因疫苗的免疫学应答的免疫改变佐剂推动了基因疫苗的应用。
因此，本发明提供了一种产生免疫应答的方法，包括：(a)递送基因疫苗组合物到受验者的靶位点的细胞中，其中的疫苗组合物含有编码抗原的核酸；以及(b)共同给药一种佐剂，其中佐剂组合物可被给药于与疫苗组合物相同或不同的位点。佐剂组合物可以在疫苗组合物之前或之后或同时被递送。佐剂和疫苗组合物可以单一的组合物或分开的组合物被给药。在一个特定的实施方案中，佐剂组合物以微粒的形式并通过皮肤递送技术被递送，优选利用无针注射粉末注射装置。在一个相关的实施方案中，佐剂通过颗粒介导的递送技术被给药。对于这两个实施方案来说，优选的靶位点为表皮组织。在另一个实施方案中，佐剂被局部给药于靶位点。
本发明的另一个进一步的目的是提供一种用于疟疾的有效的基因疫苗。组合物包括一种编码在一或多个疟疾抗原，例如，CS抗原，在个体中表达的基因构建体；以及充分改变在接种的个体中引发的免疫应答有利于从显著的Th2应答到Th1应答的特性的有效量的免疫改变佐剂。
本发明的优点为基因疫苗组合物的效力可以被增强。另一个优点是所述的方法和组合物可被用于特定适应或改变使用基因疫苗组合物产生的免疫应答的特性。
本发明的这些或其它的目的，实施方案以及优点对于本领域的普通技术人员来说参考本文的内容将很容易地想起。
附图简述
附图1是表示实验1结果的矩形图。
优选实施方案详述
在具体描述本发明之前，可以理解本发明不限于特定的疫苗制剂或方法参数因为这些，当然，会改变的。也可以理解本文所用的术语仅仅是为了描述本发明的特定的实施方案的目的且并非用于来限制。
必须说明，在此说明书和所附的权利要求书中，单数形式的“a““an”和“the”包括复数含义除非内容在其它方面清楚地表明。因此，例如，“一颗粒”包括两或更多的颗粒，“一种抗原”或“一种佐剂”包括两或更多因子的混合物或组合。“一种赋形剂”包括两种或更多赋形剂的混合物或组合物。等等。
A.定义
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语与本发明所涉及领域的普通人员普遍理解的意思相同。尽管大量的与本文所描述的相似或等同的方法可被用于到本发明的实施中，在此描述优选的材料和方法。
在本发明的描述中，应用下面的术语，且被定义如下。
本文所用的术语“穿越皮肤的(transdermal)”递送意指进入皮肤内的(例如，进入真皮或表皮层之内)，穿越皮肤的(例如，”经由皮肤的”)例如，通过因子递送到或通过至少皮肤的表层。参见，例如TransdermalDrug Delivery：Developmental Issues and ResearchInitiatives，Hadgraft和Guy(eds.)，Marcel Dekker，Inc.，(1989)；Controlled Drug Delivery：Fundamentals and Applications，Robinson和Lee(eds.)，Marcel Dekker Inc.，(1987)；以及TransdermalDelivery of Drugs，Vols.1-3，Kydonieus和Berner(eds.)，CRC出版社，(1987)。
“抗原”是指任意的免疫原性元件或因子，通常为大分子，其可以引发个体的免疫学应答。此术语可被用于指单独的大分子或抗原大分子的同源或异源群体。本文所用的术语“抗原”包括变态反应原。因此，术语“抗原”广泛地包含，包括蛋白质，多肽，抗原蛋白片段，寡糖，聚多糖，有机的或无机的化学制剂或组合物，等等元件。此外，抗原可来源于或获得自任意的病毒，细菌，寄生虫，原生动物，或真菌，且可以为完整的生物体。此术语也包括肿瘤抗原或所谓的涉及自身免疫病的“自体”抗原。类似的，表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸，例如在核酸免疫应用中的，也包括在此定义中。合成抗原也被包括在内，如多聚抗原表位、侧翼抗原表位和其它的重组或合成来源的抗原(Bergmann等(1993)欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol).23：2777-2781；Bergmann等(1996)免疫学杂志(J.Immunol).157：3242-3249；Suhrbier，A.(1997)免疫学和细胞生物学(Immunol.and Cell Biol)75：402-408；Gardner等(1998)第12届世界AIDS研讨会(12th World AIDSConference)，日内瓦，瑞士，6月28日-7月3日，1998)。
术语“核酸分子”和“多聚核苷酸”可互换使用，是指任何长度核苷酸的多聚体形式，核苷酸是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或它们的类似物。多聚核苷酸的非限制的例子包括基因，基因片段，外显子，内含子，信使RNA(mRNA)，转运RNA，核糖体RNA，核酶，cDNA，重组多聚核苷酸，分枝的多聚核苷酸，质粒，载体，任何序列的分离DNA，任何序列的分离RNA，核酸探针和引物。
本发明上下文中的“基因”是指核酸分子(染色体，质粒等)遗传功能相关的核苷酸的序列。基因是一个例如生物体的遗传单位，包括一个多核苷酸序列(例如，一个哺乳动物的DNA序列)，其在生物体的基因组中占有特异性的物理区域(“基因座位”或“遗传座位”)。基因可以编码表达产物，例如多肽或多核苷酸(例如，tRNA)。可选择的，基因可以限定基因定位来用于特定的事件/功能，例如蛋白和/或核酸的结合(例如，噬菌体吸附位点)，其中的基因不编码表达的产物。典型地，基因包括编码序列，例如多肽编码序列，和非编码序列，例如启动子序列，多腺苷化序列，转录调控序列(例如增强子序列)。许多真核基因具有被“内含子”(非编码序列)隔开的“外显子”(编码序列)。在某些情况下，基因与另一个基因具有共同的序列(例如，重叠基因)。
“编码序列”或“编码”选择多肽的序列是一个核酸分子，当其放置在适当的调控序列(或“控制元件”)控制下的时候，在体内被转录(在DNA的情况下)并且翻译(在RNA的情况下)成多肽。术语包含基因。编码序列的界线是由5′(氨基)末端的一个起始密码子和3′(羧基)末端的一个翻译终止密码子确定的。编码序列可包括，但不限于，来自病毒的cDNA，原核生物或真核生物的mRNA，来自病毒的基因组DNA序列或原核生物的DNA，甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3′一端。编码序列的转录和翻译通常被“控制元件”调控，包括，但不限于，转录启动子，转录增强子元件，转录终止信号，多聚腺苷酸序列(位于翻译终止密码子的3′一端)，优化翻译起始的序列(位于编码序列的5′一端)，和翻译终止序列。
“载体”是任意的能够递送核酸分子(例如多核苷酸或基因序列)到靶细胞(例如，病毒载体，非病毒载体，颗粒载体，和脂质体)的元件。典型的，“载体构建体”，“表达载体”，和“基因递送载体”，指任意的能够引导目的基因表达的核酸构建体且其能够递送基因序列到靶细胞。因此，术语包括克隆和表达载体，以及病毒载体。
“可操作地连接”是指元件的排列，其中所述的元件被装配以便行使其通常的功能。因此，一个给定的可操作地连接到一个编码序列(例如，编码目的抗原)的启动子，当存在适合的酶的时候，是能够影响编码序列的表达的。启动子或其它的控制元件不需要邻近编码序列，只要它们发挥指导其表达的功能。如，插入性非翻译但仍然转录的序列可以存在于启动子序列和编码序列之间并且启动子序列仍能被认为是“可操作地连接”到编码序列的。
本文使用的描述一个核酸分子的“重组的”意指一个基因组的、cDNA的、半合成的或合成来源的多聚核苷酸，合成来源是根据其来源或操作而言的：(1)不与同它在自然状态下一起关联的全部或部分多聚核苷酸关联；和/或(2)连接到不同于它在自然状态下连接的多聚核苷酸。术语“重组的”涉及蛋白质或多聚核苷酸时意指通过重组多聚核苷酸的表达而产生的多肽。
确定核酸和氨基酸的“序列一致性”的技术也是本领域公知的。典型地，这样的技术包括确定基因的mRNA的核苷酸序列和/或确定由此编码的氨基酸序列，以及将这些序列和另一核苷酸或氨基酸序列进行比较。通常，“一致性(identity)”是指两个多聚核苷酸或多肽序列的精确的核苷酸对核苷酸或氨基酸对氨基酸的各自的对应。两个或多个序列(多聚核苷酸或氨基酸)能够藉由确定它们的“百分比一致性”来比较。两个序列的百分比一致性，无论核酸或氨基酸序列，是一个由两个比对(aligned)的序列之间的精确匹配个数除以较短序列的长度，再乘以100后得来的数字。核酸序列的近似比对是由Smith和Waterman的局部同源算法(local homology algorithm)提供的，Advances in AppliedMathematics 2：482-489(1981)。此算法通过使用由Dayhoff开发的划线矩阵，Atlas of Protein Sequences and StructureM.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3：353-358，National Biomedical Research Foundation，华盛顿，D.C.，USA，且被Gribskov标准化(1986)Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763，可被应用于氨基酸序列。这一算法的一个示范性的运行是确定由Genetics Computer Group(Madison，WI)在“BestFit”这一应用软件中提供的序列百分比一致性的确定。这个方法的默认参数在威斯康辛序列分析软件包(Wisconsin Sequence Analysis PackageProgram Manual)的程序手册第8版(1995)(可以从Genetics ComputerGroup，Madison，WI得到)中有描述。本发明上下文中确定百分比一致性的方法优选使用爱丁堡大学的MPSRCH软件包，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)分发。从这一软件包套件，可以进行Smith-Waterman算法，使用默认参数用于得分表(scoring table)(如，gap open penalty of 12，gapextension penalty of one，and a gap of six)。从这一数据产生的“匹配”值反映“序列一致性”。用于计算序列之间的百分比一致性或类似性的其它合适的程序通常是本领域熟知的，如另外的一个比对程序是BLAST，按默认的参数使用。如，BLASTN和BLASTP可使用如下的默认参数：genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swissprotein+Spupdate+PIR。这些程序的细节能在下列各项英特网地址找到：http：//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
可选择的，同源性可以由多聚核苷酸杂交来确定，杂交的条件是在同源区域之间形成稳定的双链体形式，随后用单链特异的核酸酶消化并进行被消化片段的大小确定。如同使用上面的方法确定的那样，两个DNA或两个多肽序列，当它们的序列在一个分子整个的定义长度下，呈现至少约80％-85％，优选至少约90％，和最优选至少约95％-98％序列一致性的时候，就说它们是彼此“大体上同源”。如本文使用的，大体上同源也是指序列与指定的DNA或多肽序列表现完全的一致性。大体上同源的DNA序列能由在如特定的系统所定义的严格条件下进行的Southern杂交实验来确定。例如，严格的杂交条件可以包括50％甲酰胺、5x Denhardt氏溶液、5×SSC、0.1％SDS和100μg/ml变性的鲑精DNA，而且洗涤条件可以包括37℃，2×SSC，0.1％SDS，随后68℃ 1×SSC，0.1％SDS。定义适当的杂交条件在本领域的技能之内。参见，例如，Sambrook等，supra；DNACloning，supra；Nucleic Acid Hybridization，supra。
术语“疫苗组合物”是指任意的含有抗原的药物组合物(特定的，本文所用术语是指包含含有编码抗原的序列的核酸分子的组合物)，其中组合物可被用于预防或治疗受试者的疾病或身体不适。疫苗组合物也可含有一或多种佐剂。典型的，疫苗被用于病原菌引起的疾病的预防，然而，本发明的疫苗组合物也可被用于治疗。
抵抗所选因子，抗原或目的组合物的“免疫学应答”或“免疫应答”是对存在于药剂或目的组合物中的分子(例如抗原)，个体中体液和/或细胞免疫应答的扩展。对应于本发明的目的，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是一种T-淋巴细胞和/或其它白血球介导。
哺乳动物的免疫应答被认为涉及一或两个显著应答策略后的免疫级联，其通过引发级联的T辅助细胞来表征。因此，对特异性抗原的免疫应答可被表征为T辅助细胞1(Th1)-型或T辅助细胞2(Th2)-型应答，依据抗原呈递后，从抗原特异性T淋巴细胞释放的细胞因子的类型。Th1免疫应答通常通过从抗原刺激的T辅助细胞中的释放炎症性的细胞因子例如IL-2，γ干扰素(IFN-γ)，以及α肿瘤坏死因子(TNF-α)来表征。Th1应答也与强烈的细胞免疫性(例如，CTLs)以及具有受调理素作用和补体固定活性的IgG抗体亚组例如IgG2a的产生相关联，在通常所用的小鼠模型中。在另一方面，Th2免疫应答是在抗原特异的T辅助细胞刺激后，通过非炎症性细胞因子，例如IL-4和IL-10的释放来表征的。Th2应答通常没有最大的CTL活性，但与强烈的抗体应答相关联，呈递IgG亚组例如小鼠中的IgGI，缺少受调理素作用和补体固定活性的抗体。通常，与Th2应答相关联的抗体水平被认为比与Th1应答相关联的抗体水平更强烈。
术语“佐剂”是指任意的能够特异性或非特异性改变，增强，引导，重新引导，加强或引发抗原特异性免疫应答的物质或组合物。因此，佐剂和抗原(例如，疫苗组合物)的共同给药可在给药抗原的受试者中获得期望的免疫应答所必需的低剂量的或较低剂量的抗原。在本发明的特定实施方案中，佐剂与编码抗原的核酸共同给药可重新引导免疫应答抵抗抗原，例如，其中的免疫应答被从Th2-型重引导为Th1-免疫应答，反之亦然。佐剂的效力可被检测通过给药含有佐剂的疫苗组合物以及疫苗组合物对照于动物并比较抗体的滴度和/或细胞介导的免疫抵抗此二者，通过利用本领域公知的例如放射免疫测定，ELISAs，CTL实验，等标准的方法。典型的，在疫苗组合物中，佐剂是来自抗原的单独的元件，尽管可具有佐剂和抗原的特性(例如，霍乱毒素)。为达到本发明的目的，佐剂被用来增强对特异性抗原的免疫应答，例如，当佐剂与疫苗组合物一起给药时，产生的免疫应答强烈于由相同量的疫苗组合物而没有佐剂给药引发的免疫应答，或者佐剂被用于重新引导免疫应答的特性。此外，为实现本发明的目的，“有效量的”佐剂应为增强对疫苗组合物中的共同给药的抗原的免疫应答的量，使得较低或较少剂量的抗原被需求来产生有效的免疫应答，或“有效量的”佐剂应为充分的引起对于单独抗原的免疫应答相关的免疫应答的改变或重新引导的量。“佐剂组合物”指任意的含有佐剂的药物组合物。
“免疫改变佐剂”是一种有效的改变或引导(重引导)抵抗含有(receiving)抗原和免疫改变佐剂的所选抗原的免疫应答特性的佐剂。改变或重引导是相关于直接抵抗没有免疫改变佐剂的抗原的免疫应答的特性。因此，此佐剂在此被用于改变抵抗所选抗原(由存在于疫苗组合物中的核酸序列编码的抗原)的免疫应答的特性来使得利于Th1型应答代替Th2型应答，或利于Th2型应答代替Th1型应答。大量已知的可被用作免疫改变佐剂的佐剂包括，但不限于单磷酰脂A(MPL)佐剂。佐剂充当免疫改变佐剂的能力可以被检测，通过测定疫苗组合物单独给药，疫苗组合物和佐剂一起给药产生的免疫应答的特性。此测定包括在主体中抗原呈递后，从抗原特应性T淋巴细胞释放的细胞因子的类型的表征或鉴定和/或相对于单独抗原，抗原/佐剂组合物引发的主要的IgG亚组的表征和鉴定。本领域的普通技术人员通过本说明书指导，能较好地理解所有的这些特性或特征。
本文所述的术语“共同给药”，例如当一种佐剂被与编码抗原的核酸(例如，一种疫苗组合物)“共同给药”时，是指佐剂和抗原的同时或协作给药，例如，当二者存在于相同的组合物中或在几乎相同的时间但在不同的位点分别给药。以及单独组合物中的佐剂和抗原的递送在不同的时间的递送。例如，佐剂组合物可在相同或不同位点的抗原的递送之前或其后被递送。佐剂和抗原递送之间的时间选择可为从大约几分钟的间隔到几小时间隔，到几天的时间间隔的范围。
本文的术语“治疗”包括下面的任意一种：感染或再感染的预防；症状的减轻或去除；以及病原体的减少或完全去除。治疗可以是预防性的作用(在感染前)。
术语“个体”(individual)和“受试者”(subject)在此被交互使用，其是指任意cordata亚门(subphylum cordata)的一员，包括但不限于，人和其它的灵长类动物(包括非人类灵长类例如黑猩猩和其它的猿类和以及猴子)；农业动物例如牛，绵羊，猪，山羊和马；驯养的哺乳动物例如狗和猫；实验室动物包括啮齿动物例如小鼠，大鼠和豚鼠；鸟(包括家养的，野生的和野味鸟例如小鸡，火鸡和其它的鹑鸡类鸟，鸭子，鹅)；鱼，等等。此术语不表示特定的年龄。因此，成年的和新出生的个体均被包括。本文所述的方法可被用于上述脊椎动物种类的任意种类，因为所有这些脊椎动物的免疫系统的运作是相似的。
B.常规的方法
本发明的基本前提是发现非DNA佐剂可被合并到基于核酸的疫苗组合物(例如，DNA或基因疫苗组合物)中并用于改变，增强，引导到或重新引导在治疗个体中对抗原的免疫应答特性。组合物，其含有包含编码目的抗原的序列的核酸分子组合物以及以不同于DNA的形式的佐剂，被直接给药于需治疗的个体的靶组织的细胞中。优选的，但不是必要的，组合物被包被在核心载体颗粒上其大大地促进了新组合物的直接的胞内递送。组合物的佐剂成分为有效地增强被引发抵抗相应抗原的免疫应答的至少一个方面。在本发明的一个方面，选择佐剂来改变或重新引导相对于在缺乏共同给药的佐剂时产生的抗原特异的免疫应答的特性。在本发明的另一个方面，选择佐剂来增强抗原特异的免疫应答的T辅助细胞1(Th1)组分。
在本发明的一个特定的方面，人们已发现加入合适的免疫应答改变佐剂到DNA疫苗中具有刺激和改变由疫苗引发的抗原特异的免疫应答来利于Th1应答替换Th2应答。一种特定的已被发现具有这种作用的是单磷酰脂A(MPL)，尽管其它的类似作用的佐剂已被鉴定。此种DNA疫苗中的免疫应答的改变增加了DNA疫苗对各种感染性疾病例如疟疾的效力。
抗原
用于本发明组合物的基因疫苗的核酸分子不需要复杂制备技术。最关键的制备步骤哪么，非常明显，是编码目的抗原的合适的序列的选择。抗原被选择使得免疫应答，当被引发时，将提供一些对预防接种的个体的特定水平的治疗效果，例如特定水平的抵抗疾病因子的有效保护。在这些实施方案中，其中来自DNA疫苗的免疫应答可被变更(modified)来增强免疫应答的Th1特性。疫苗中由DNA编码的抗原将基于此影响来筛选。
因此，通常，抗原将通过特定的递送方法，靶组织，以及相应的佐剂被筛选。例如，小鼠用编码流感病毒核蛋白抗原(NP)，人癌变胚胎抗原(CEA)，或P.falciparum CS抗原的载体进行的颗粒介导的免疫可预测地导致Th2应答的抗体应答。在另一方面，小鼠用编码HIV蛋白的载体免疫最初产生Th1类的应答，伴随另外的免疫可被转变为Th2应答。此外，用编码肝炎B病毒(HBV)表面和核心抗原的载体免疫产生一种可被分类为Th0的应答，其由于两种主要IgG亚组在抗原特异性免疫应答中的等表示(equal representation)。因此，对于特定的感染性或由寄生虫引起的疾病来说，可能DNA免疫后的免疫学结果将适当地提供最佳的保护，而对于其它的疾病，免疫学结果的变更或重新引导对于获得高于未使用佐剂所观察到的有效水平的保护是必要的。例如，有可能对于特定的感染性或由寄生虫引起的疾病来说，免疫应答，当在强度上显著，可能不会适当地提供最佳治疗效果，例如，保护。换句话说，免疫应答可能是在量上是充分的，但在质上不充分。此种可为疟疾的情况，其中的较早的疫苗数据显示Th1应答可能是重要的，但当使用编码CS的质粒载体时，其中的Th2应答通过表皮的DNA接种被引发。因此，预想的佐剂的效果可能不增强免疫应答的量的水平，但反而仅是重新引导免疫应答来增强应答的Th1组分。
因此，对于本发明组合物的核酸成分而言，合适的启动子系统将被可操作的连接于编码目的抗原的序列。目的抗原将优选的与病原体例如病毒，细菌或寄生虫病原体相结合，或抗原可为肿瘤特异性抗原，自身抗原或变态反应原。抗原可以为全长蛋白。可选择的，抗原主要仅含有抗原的B-细胞表位或T-细胞表位。
肿瘤特异性抗原包括，但不限于，任意的不同的MAGEs(黑素瘤E相关抗原E)，包括MAGE 1，MAGE 2，MAGE 3(HLA-A1肽)，MAGE 4，等等；任意不同的酪氨酸酶(HLA-A2肽)；突变体ras；突变体p53；以及p97黑素瘤抗原。其它的肿瘤特异性抗原包括与早期癌症相关联的Ras肽和p53肽，与子宫癌相关的HPV 16/18和E6/E7抗原，与乳房癌相关的MUC1-KLH抗原，与结肠癌相关的CEA(癌初期抗原)，与黑素瘤相关的gp100和MART1抗原，以及与前列腺癌相关的PSA抗原。p53基因序列是已知的(参见，例如Harris等(1986)Mol.Cell.Biol.6：4650-4656)并被保藏且GenBank登录号No.M14694。
合适的病毒抗原包括，但不限于，获得和来源于肝炎病毒家族的抗原，包括肝炎A病毒(HAV)，肝炎B病毒(HBV)，肝炎C病毒(HCV)，δ肝炎病毒(HDV)，肝炎E病毒(HEV)以及肝炎G病毒(HGV)。通过实施例的方式，HBV的病毒基因组序列是已知的，同样其编码抗原的序列的获得的方法也是已知的。参见，例如，Ganem等(1987)Annu.Rev.Biochem.56：651-693；Hollinger，F.B.(1990)Heatitis B virus，vol.II，pp.2171-2235，Fields等(eds)，Virology，2nd ed，Raven出版社，NewYork，NY；以及Valenzuela等.(1 980)肝炎B病毒基因组的核苷酸序列和主要病毒基因的鉴定(The nucleotide Sequence of the HepatitisB viral Genome and the Identification of the Major Viral Genes)，pp.57-70，Fields等.(eds)，动物病毒遗传学，学院出版社(AcademicPres s)，纽约，NY)。HBV基因组编码一些病毒蛋白，包括大的，中等的，主要的表面抗原多肽，X-基因多肽，以及核心多肽。参见，例如Yokosuka等(1986)N.Engl.j.Med.315：1187-1192；Imazeki等(1987)肝脏病学(Hepatology)7：753-757；Kaneko等(1988)J.Virol.62：3979-3984；以及Ou等(1990)J.Virol.64：4578-4581。同样地，HCV的病毒基因组序列以及其获得的方法是已知的。参见，例如国际公布WO 89/04 669；WO 90/11089；以及WO 90/14436。HCV基因组编码一些病毒蛋白，包括E1和E2。参见，例如，Houghton等(1991)肝脏病学(Hepatology)14：381-388。编码这些HBV和HCV蛋白的序列，以及其抗原的片段，将被用于本发明的方法中。类似的，来自HDV的δ抗原的编码序列是已知的(参见，例如，U.S.专利5,378,814)。
同样的，编码来自肝炎病毒家族的大量不同蛋白抗原的序列可被用于本发明中，其包括获自或来源于1和2型单纯疱疹病毒(HSV)，例如HSV-1和HSV-2糖蛋白gB，gD和gH的抗原；来自痘疱疹病毒(VZV)，Epstein-Barr病毒(EBV)以及巨细胞病毒(CMV)包括CMV gB和gH的抗原；以及来自其它人疱疹病毒例如HHV6和HHV7的抗原。(参见，例如Chee等(1990)巨细胞病毒(Cytomegaloviruses)(J.K.McDougall，ed.，Springer Verlag，pp.125-169；McGeoch等(1988)J.Gen.Virol.69：1531-1574；美国专利5,171,568；Baer等(1984)Nature 310：207-211；以及Davison等(1986)J.Gen.Virol.67：1759-1816.)。
HIV抗原，例如大多数的HIV-1和HIV-2分离株的gp120序列，包括不同HIV遗传亚型的成员是已知的并被报道(参见，例如，Myers等，LosAlamos Database，Los Alamos National Laboratory，Los Alamos，新墨西哥(1992)；以及Modrow等(1987)J.Virol.61：570-578)并且获自任意这些分离株的抗原将被用在本方法中。此外，发明同样适用于其它获自任意的不同分离株的免疫原性元件中，包括任意的不同的外壳蛋白例如gp160和gp41，gag抗原例如p24gag和p55gag，以及得自HIV的pol，env，tat，vif，rev，nef，vpr，vpu和LTR区域的蛋白。
从其它病毒来源或获得的抗原也将会用于本文，例如没有限制地，来自小RNA病毒家族(Picornaviridae)家族成员(例如脊髓灰质炎病毒等)的抗原；杯状病毒；披膜病毒(例如，风疹病毒，登革热病毒等)；黄病毒；冠状病毒；呼肠孤病毒；Birnaviridae病毒；弹状病毒(例如，狂犬病病毒等)；线状病毒；副粘病毒(例如，流行性腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒等)；布尼亚病毒；沙粒病毒；逆转录病毒(例如，HTLV-I；HTLV-II；HIV-1(也以HTLV-III，LAV，ARV，hTLR等闻名))包括但不限于来自分离株HIVIIIb，HIVSF2，HIVLAV，HIVLAI，HIVMN的抗原)；HIV-1CM235，HIV-1US4；HIV-2，在其它的之中；参见，如病毒学，第三版(W.K.Jokliked.1988)；基础病毒学(Fundamental Virology)，第二版(B.N.Fields和D.M.Knipe，eds.1991)，得到这些和其它病毒的描述。
编码合适的细菌和寄生虫抗原的序列被得自获获自已知的引起疾病的病因，例如白喉，百日咳，破伤风，肺结核，细菌或真菌肺炎，霍乱，伤寒，鼠疫，志贺氏菌病或沙门氏菌病，军团病，莱姆病，麻疯病，疟疾，钩虫病，盘尾丝虫病，血吸虫病，锥虫病，Lesmaniasis，贾第虫病，阿米巴病，丝虫病，Borelia，以及旋毛虫病。另一种抗原可被获得或来源于非常规的病毒或类病毒因子例如库鲁病、克罗伊茨费尔特-雅各布综合症(CJD)，瘙痒病，可传染的水貂脑病和慢性消耗性疾病的病原体因子，或获自与疯牛病相关的朊蛋白的传染性颗粒例如朊病毒。
编码合适的变态反应原的序列可被用于本发明中，其包括但不限于，来自花粉，动物皮屑，草，霉菌，粉尘，抗生素，螫咬昆虫的毒液，以及不同的环境，药物和食物变态反应原。普通的树木变态反应原包括来自三角叶杨，popular，桉树，桦树，枫木，橡树，榆树，山核桃树，和美洲山核桃树的花粉；通常的植物变态反应原包括来自黑麦，豚草，长叶车前草，酸尾草(sorreldock)和藜草的变态反应原；植物接触变态反应原包括这些来自有毒橡树，有毒常春藤和荨麻的；普通的草变态反应原包括梯牧草，Johnson，百慕大草，羊矛草和六月禾变态反应原；普通的变态反应原也可获自霉菌或真菌例如链格孢属，镰刀菌属，单孢枝霉属，曲霉属，小多孢属，白霉属和嗜热放线菌；青霉素和四环素是普通的抗生素变态反应原；表皮的变态反应原可被获自居住环境的或有机粉尘(典型的真菌来源的)，来自昆虫例如家螨(dermatphagoidespterosinyssis)，或来自动物来源的例如羽毛，以及猫和狗皮屑；通常的食物包括奶和干酪(日用的)，蛋，小麦，坚果(例如，花生)，海鲜(例如贝壳类)，豌豆，黄豆和麸质变态反应原；通常的药物变态反应原包括局部麻醉药和水杨酸盐变态反应原；抗生素变态反应原包括青霉素和磺胺类变态反应原；通常的昆虫变态反应原包括蜜蜂，黄蜂，和蚂蚁毒液，以及蟑螂萼(cockroach calyx)变态反应原。特定恰当特性的变态反应原包括但不限于，Der p I变态反应原的主要和隐蔽的表位(Hoyne等(1994)免疫学83190-195)，蜜蜂毒液磷脂酶A2(PLA)(Akdis等(1996)J.Clin.Invest.98：1676-168 3)，桦树花粉变态反应原Bet v 1(Bauer等(1997)Clin.Exp.Immunol.107：536-541)，以及多表位重组草变态反应原rKBG8.3(Cao等(1997)免疫学90：46-51)。这些和其它合适的变态反应原可通过商业获得和/或可通过下面的技术被较容易地制备。
通过已知的技术目的抗原的编码序列可被获得和/或制备。例如，大体上纯的抗原制剂可通过利用标准的分子生物学工具获得。也即，编码这些上述抗原的多核苷酸序列可通过利用重组技术获得，例如通过从表达基因的细胞中筛选cDNA和基因组文库，或通过来自包括相同基因的载体获得基因。此外，所期望的序列可被直接从含有其的细胞和组织分离，通过常规的技术，例如，苯酚萃取以及cDNA或基因组DNA的PCR.参见，例如，Sambrook等，supra，来描述用于获得和分离DNA的标准技术。除了克隆，多核苷酸序列也可通过合成来产生。
另一个传统的用于分离特异性核酸分子的方法是通过聚合酶链式反应(PCR).Mullis等(1987)Methods Enzymol.155：335-350。此技术利用DNA聚合酶，通常为耐热的DNA聚合酶，来复制DNA的目的区域。将被复制的DNA区域通过互补于目的DNA的相对末端和相对链的特定序列的寡核苷酸引发复制反应被鉴定。复制第一轮的产物其本身是随后复制的模板，因此复制的反复连续的循环产生通过所用引物碱基界定的DNA片段的几何级数的扩增。
一旦获得特定的目的编码序列，其可通过标准的克隆或分子生物学技术被可操作的连接于合适的调控元件来提供可表达的核酸分子。参见，例如，Edge(1981)Nature 292：756；Nambair等(1984)Science 223：1299；以及Jay等(1984)J.Biol.Chem.259：6311。然后核酸分子本身被使用或仅被插入到合适的载体例如表达质粒或病毒载体构建体中。
因此，本发明的核酸分子典型的含有同源或异源的启动子序列以及其它合适的调控序列。这些其它的调控序列可包含终止和/或翻译起始序列(例如GCCACCATGG或GCCCCCATGG)和/或翻译终止密码子(例如TAA，TAG或TGA)和/或多(聚)腺苷酸信号和/或RNA休止位点。此外，可以存在天然或异源启动子序列的增强子序列。一旦被构建，核酸分子可通过常规的基因递送方法被给药。基因递送的方法是本领域公知的。参见，例如，U.S专利5399346，5580859，5589466。基因可被直接递送给受试者或，可选择的，体外递送到受试者的细胞中且细胞重植入到受试者中。
佐剂
本发明的新化合物的第二组分是佐剂成分其可含有任意合适的佐剂或佐剂组合物。例如，合适的佐剂包括，但不限于，由铝盐形成的佐剂(alum)，例如氢氧化铝，磷酸铝，硫酸铝等等；水包油和油包水乳剂，例如完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；无机物凝胶；嵌段共聚物；AvridineTM脂类-胺；SEAM62；由细菌细胞壁形成的佐剂包括例如脂多糖类(例如脂A或单磷酰脂A(MPL)，Imoto等(1985)Tet.Lett.26：1545-1548)，海藻糖二霉菌酸酯(TDM)，以及细胞壁骨架(CWS)；热激蛋白或其衍生物；来自ADP核糖基化毒素的佐剂，包括白喉毒素(DT)，百日咳毒素(PT)，霍乱毒素(CT)，E.coli热不稳定性毒素(LT1和LT2)，假单胞菌内毒素A，假单胞菌属内毒素S，仙人掌(B.cereus)胞外酶，B.sphaericus毒素，C.肉毒梭菌(botulinum)C2和C3毒素，C.limosum胞外酶，以及来自产气荚膜梭菌、spiriforma梭菌、差异(difficile)梭菌金黄色葡萄球菌EDIN的毒素，以及ADP核糖基化细菌毒素突变体例如CRM197，非毒素白喉毒素突变体(参见，例如，Bixler等(1989)Adv.Exp.Med.Biol.251：175；以及Constantino等(1992)Vaccine)；皂甙佐剂例如Quil A(US专利5,057,540)，或来自皂甙的颗粒例如ISCOMs(免疫刺激复合物)；趋化因子和细胞因子，例如白介素(例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，等等)，干扰素(例如γ干扰素)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，防卫素1或2，RANTES，MIP1-a和MIP-2，等等；胞壁酰肽例如N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(正-MDP)，N-乙酰胞壁酰L-丙氨酰-D-异谷氨二酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′二棕榈酰-sn-甘油-3 huydroxyphosphoryloxy)-乙胺(MTP-PE)等等；获自CpG分子家族，CpG二核苷酸和合成的含有CpG元件的寡核苷酸的佐剂(参见，例如，Krieg等Nature(1995)374：546，Medzhitov等(1997)Curr.Opin.Immunol.9：4-9，以及Davis等J Immune(1998)160：870-876)例如TCCATGACGTTCCTGATGCT和ATC C.limosum胞外酶GACTCTCGAGCGTTCTC；以及合成的佐剂例如PCPP聚-二(苯氧基羧酸酯)膦腈(poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene](Payne等Vaccines(1998)16：92-98)。此佐剂可购自大量的销售商例如AccurateChemicals；Ribi Immunechemicals，Hamilton，MT；GIBCO；Sigma，St.Louis，MO。
用于本发明组合物的优选的佐剂为这些在乙醇中至少部分溶解的。本文特定优选使用的一类佐剂为被归为“皂甙”的佐剂，也即，来自皂树，肥皂草，或丝石竹属的皂甙产生植物的佐剂。皂甙为糖甙天然植物的产物，包括一个环结构(糖苷配基)其上连接一或多个糖链。糖苷配基可以为紫菀属的，三萜系化合物或甾醇[固醇]载体蛋白，且连接到糖甙键上的糖的数目可显著的变化。大多数普通的被用作药物佐剂的皂甙为提取自南美树Quillaja saponaria的三萜烯糖甙且如Quil A所描述的(参见，例如US专利5,688,772；5,057,540；和4,432,969；以及国际公布No.WO 88/09336，公开于1988.12.1)，其活性成分被称为QS-21。另一种优选的佐剂为称作″GMTP-N-DPG″的胞壁酰二肽类似物(N-acetylglucosaminyl-N-乙酰胞壁酰--L-丙氨酰-D-isoglutamyl-L-丙氨酰-dipalmitoylpropylamide)。参见Fast等(1997)Vaccine 15：l748-1752。
许多佐剂优选在本发明中被用作免疫改变佐剂。此种佐剂的关键特征是相对于编码抗原的DNA单独使用时其以理想的方向重引导引发的免疫应答。如果佐剂具有引导或改变免疫应答有利于Th1而不同于Th2应答的特性则是特别理想的。因为所有对抗原的免疫应答是复杂的，且很多如果并非所有的免疫应答涉及Th1及Th2应答的元件，去寻找所有应答的重新引导是不实际的。反之，所设想的是免疫应答类型的相对的改变。例如，其中已被发现特定的抗原产生占优势的Th2应答，且Th1应答是更理想的结果，Th1的引导上的改变将显示出来自疫苗较大的临床效果。本文所述的免疫改变佐剂可能或不导致个体中的所有免疫应答的总量的增加。反之，免疫改变佐剂意指改变或重新引导免疫应答的特性或质量而不是大小或数量。
免疫改变佐剂的有利于Th1应答的一个实施例是单磷酰脂A，或获自Ribi Immunochemical Research，Inc的MPL。免疫改变佐剂的有利于Th2应答的一个实施例是1，25二羟基维生素D3。其它可能的免疫改变佐剂包括PPD，卡介苗(BCG)的纯化的蛋白衍生物，海藻糖二霉菌酸酯，以及分支杆菌细胞壁骨架材料。
佐剂可以单独存在于暂时的组合物中或存在于两种或多种佐剂组合中。在这点上，结合的佐剂可能具有在引发或改变免疫应答上的累加的或协同的作用。协同的作用是其中的通过结合两或多种佐剂作用得到的结果大于每一种佐剂分别给药产生仅仅相加获得的结果。
不幸的是，已知大部分的上述佐剂是高度有毒的，且因此通常考虑对于人用而言有太多的毒性。因此目前允许用于人用途的唯一佐剂为明矾，一种铝盐组合物。虽然如此，大量的上述佐剂通常被用于动物且因此适于大多数的受试者，并且其中的一些正进行临床前和临床研究来用于人类用途。然而，人们发现通过被考虑对人用毒性太高的佐剂可通过粉末注射技术给药(例如优选在此使用颗粒介导的递送技术)而没有伴随的毒性问题。没有被特定的理论所限制，少量的佐剂递送到皮肤使得与皮肤皮层的表皮朗格罕氏细胞和鼠突状细胞作用。这些细胞在免疫应答的引发和维持中是很重要的。因此，增强的佐剂作用效果可以被获得，通过靶向递送到此细胞中或其附近。此外，佐剂在本发明实施中的皮肤递送避免了毒性问题因为(1)皮肤的表层基本不形成血管，佐剂进入到系统循环中的量被减少从而降低了毒效；(2)皮肤细胞时常脱落，因此残留的佐剂被除去而不是被吸收；以及(3)实质上较少的佐剂可被给药来产生合适的佐剂作用(与通过传统技术例如肌内注射的递送佐剂相比)。
一旦选择，一或多种佐剂可以合适用于非肠道递送的药物形式被提供，此形式的制备时本领域的普通技术技能之内。参见，例如Remington′sPharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Company，Easton，Penn.，第18版。可选择的，佐剂可如下面详述被制备成特定的形式。佐剂以有效量存在于药物形式中来带来理想的效力，也就是说，增强抵抗共同给药的目的抗原的粘膜的应答，和/或引导抵抗目的抗原的粘膜应答。通常大约0.1μg到1000μg的佐剂，更优选的大约1μg到500μg的佐剂，且更优选的大约5μg到300μg的佐剂将有效的增强所给抗原的免疫应答。因此，例如对于Quil A，大约0.5到50μg，优选大约1到25μg，且更优选大约5到20μg范围的剂量，用于本发明的方法中。对于MPL，大约1到250μg，优选大约20到150μg，且更优选大约40到75μg范围的剂量，用于本发明的方法中。
其它佐剂的剂量可很容易地被本领域的技术人员通过常规的方法来检测。给药的量依赖于许多因子包括共同给药的抗原，以及佐剂充当免疫应答的刺激器或充当免疫改变佐剂的能力。
组合物的制备
一旦被获得，编码目的抗原的核酸分子和，在大多数的实施方案中，所选的佐剂可被配制在一起作为单一的药物制剂。在其它的实施方案中，佐剂可被制备以药学上可接受的形式，例如液体溶液或悬浮液的形式(适于注射或局部给药)或作为乳膏，乳液，软膏剂，凝胶或其它合适的局部药物的形式。例如，抗原编码序列和/或佐剂可被结合于一或多个药学上可接受的赋形剂或载体来提供疫苗，佐剂或佐剂化(adjuvanted)的基因疫苗组合物。辅助的物质，例如加湿剂或乳化剂，pH缓冲物质，等等，可存在于赋形剂和载体中。这些赋形剂，载体，和辅助物质是其本身在接受组合物的个体中不诱导免疫应答的药物因子，且其可被给药而没有过度的毒性。药学上可接受的赋形剂包括但不限于液体例如水，盐水，  聚乙二醇，透明质酸，甘油和乙醇。药学上可接受的盐可被包括在此，例如无机酸盐例如盐酸盐，氢溴化物，磷酸酯，硫酸盐，等等；以及有机酸的盐例如醋酸盐，丙酸盐，丙二酸盐，苯甲酸盐，等等。可被考虑但不是必需的是，组合物可含有充当稳定剂的药学上可接受的载体，特别是对于核酸和/或肽，蛋白或其它的佐剂。可作为核酸和肽的稳定剂的合适载体的实施例包括但不限于，药物级的葡萄糖，蔗糖，乳糖，海藻糖，甘露醇，山梨醇，肌醇，右旋糖酐等等。其他合适的载体包括但不限于淀粉，纤维素，磷酸钠或钙，柠檬酸，酒石酸，甘氨酸，高分子量聚乙烯乙二醇(PEGs)，及其组合。药学上可接受的赋形剂，载体，稳定剂和其它的辅助物质的详细讨论可得自REMINGTON′S PHARMACEUTICALSCIENCES(Mack Pub.Co.，N.J.1991)，引入本文作为参考。
由于本发明疫苗组合物计划被直接递送到位于靶位点的细胞中，颗粒介导的递送是本发明的实施中优选的来给药组合物的方法。相应的，核酸分子和/或佐剂可包被在适于胞内运输的核心载体颗粒上，例如，金或钨。颗粒介导的用于递送此疫苗制剂的方法是本领域公知的。更具体的，一旦被制备和适当地纯化，编码抗原的核酸和/或佐剂可被包被在载体颗粒上(例如冲击(ballistic)核心载体)通过各种本领域公知的技术。载体颗粒被选自具有合适在典型的用于基因枪装置的胞内递送的颗粒大小范围中的密度的材料。最佳的载体颗粒大小将，当然，依赖于靶细胞的直径。
优选利用颗粒介导技术的递送因多个原因。一个重要的原因是迄今为止此基因递送到哺乳动物的技术已显示在所有实验的哺乳动物的系统中具有相同效力的水平。此事实的重要意义在于动物模型的数据比其他的技术更直接的适用于和可转移到人类的治疗上，例如肌内的基因递送在啮齿动物中已显示出较大不同的效力。颗粒介导递送装置通常加速遗传物质到动物中通过使用合适的推动的外力，电火花放电或压缩气体的排出，因此使得很容易的选择将核酸疫苗组合物导入的靶组织成为可能。
与确定的颗粒介导递送技术相一致，被导入的遗传物质可在水性溶液中制备且然后沉淀到小的生物学惰性的核心载体颗粒上。任意合适的载体颗粒可被使用，例如由聚合物和金属形成的颗粒(例如钨，金，铂和铱)；然而钨和金载体颗粒是优选的。钨颗粒很容易的获得平均直径在0.5到2.0μm的大小。尽管此颗粒具有最佳的密度来用于颗粒介导的递送方法，且允许非常高效的DNA包被，钨可能对某些细胞类型潜在地有毒。金颗粒或微晶金(例如金粉末A1570，获自Engelhard Corp.，EastNewark，NJ)也被用于本发明的方法中。金颗粒提供了均一的大小(获自Alpha Chemicals且颗粒大小为1-3μm，或获自Degussa，SouthPlainfield，NJ，颗粒大小的范围包括0.95μm)以及降低的毒性。微晶的金提供了不同大小的颗粒分布，典型的在0.5-5μm的范围内。然而，微晶金的不规则的表面区域提供了高度有效的核酸，抗原和佐剂的包被。本文所用的颗粒具有0.1μm-10μm的表称尺寸。
大量的方法是已知的且被用于描述包被或沉淀DNA或RNA到金或钨颗粒上。此方法通常用质粒DNA，CaCl2和亚精胺结合已预测量的金或钨。产生的溶液在包被过程中不停地涡旋来确保反应混合物的均一性。在核酸沉淀之后，包被的颗粒可被转到合适的膜上并在使用之前进行干燥，包被在简单组件，药筒或盒的表面，或装入运输盒中来用于颗粒介导的递送装置(例如，基因枪仪器)。
肽佐剂可被吸附到相同或不同的核心载体颗粒上通过简单混合两种组分以依据经验确定的比率，通过硫酸铵沉淀或其它本领域技术人员熟悉的的溶剂沉淀方法，或通过化学耦合肽到载体颗粒上。L-半胱氨酸残基到金上的耦合以前已被描述(Brown等(1980)Chemical SocietyReviews9：271-311)。其它的方法包括，例如，在纯乙醇，水，或乙醇/水混合物中溶解肽，将一定量的载体颗粒加到溶液中，且然后当涡流时在空气或氮气的气流中干燥混合物。可选择的，肽可通过在真空中离心被干燥到载体颗粒上。一旦被干燥，被包被的颗粒可被重悬浮在合适的溶剂中(例如，乙基醋酸盐或丙酮)并研碎(例如通过超声波)来提供大体上均一的悬浮液。
在一个实施方案中，本发明在基因疫苗组合物中使用了MPL佐剂，MPL是一种复合的脂类分子。某些复合物在被包被到载体颗粒上之前可被简单的混入到水性核酸(例如DNA)制剂中，且此在为MPL的情况下起作用，MPL或其它的乙醇可溶解的化合物可被简单加入到典型用于悬浮DNA包被的金颗粒的乙醇溶液中。即使乙醇最后被从DNA包被的金颗粒蒸发干燥，在蒸发后仍保留充分佐剂(例如，MPL其是不挥发的)。这些相同的常规技术可在颗粒介导的基因递送方法中与其它种类的生物材料一起使用，例如由非蛋白激素，维生素，或其类似物形成的佐剂。
尽管用在载体颗粒上的DNA预包装佐剂是很方便的，人们也发现即使从遗传材料单独的递送佐剂可以是有效的。例如，通过颗粒介导技术的表皮递送，佐剂可很容易的被用于用基因疫苗治疗的区域。目前尚不知是否颗粒携带佐剂到基因表达的位点或是否佐剂仅因为其在基因递送位点扩散而有效。对于颗粒介导的基因递送来说，区别是不重要的。佐剂可与基因一起递送或单独被局部应用，例如通过擦洗。
颗粒介导技术使得疫苗组合物被直接递送到体内的任意靶组织类型或种类。然而，最方便的是递送携带DNA的载体颗粒到表皮中。方便地，表皮被证明是DNA疫苗递送的特别理想的场所。人们也已经证明与其它可能的靶组织相比基因疫苗在表皮中可引发较大量的免疫应答。基因递送到表皮引起的强烈的免疫应答可能取决于免疫细胞，例如朗格罕氏细胞或其它的抗原呈递细胞，其经常融合到皮肤的表皮层来寻战抗原目标。
因此，在形成以后，用抗原或/和佐剂制剂包被的载体颗粒被递送到靶皮肤位点，通过颗粒介导的递送技术。适于颗粒介导递送的不同颗粒加速装置是本领域公知，且均适于本发明实践中的应用。目前的装置设计利用了爆炸的，电动的或气体释放来推动包被的载体颗粒到靶细胞。包被的载体颗粒本身可被释放吸附到活动的载体薄片上，或可活动的吸附到气流经过的表面，从表面移动颗粒且加速推动其到靶细胞。气体交换的实施例被描述于美国专利5,204,253。爆炸装置被描述于美国专利4,945,050。氦交换型颗粒加速装置的一个实施例为PowderJectsXR仪器(PowderJect Vaccines，Inc.，Madison)，WI，此装置被描述于美国专利5,120,657。适于此应用的电动交换装置被描述于美国专利5,149,655。所有的这些公开引入本文作为参考。
单一剂量的包被载体颗粒可被提供在合适的容器中，例如提供在含有包括包被在其内表面的颗粒的管道节段的药筒中。制备此容器的方法被描述在共同拥有的美国专利5,733,600和5,780,100中，其内容引入本文作为参考。
颗粒组合物或包被的颗粒通过与配药制剂相适合的方式被给药于个体，且其用量对于发明的目的是有效的。将被递送的组合物的量(例如大约0.01μg到10mg，更优选的1到50μg的抗原序列)，依赖于被试验的个体以及被给药的特定抗原或变态反应原。必要的精确的量将依据年龄和被治疗的个体的基本条件而变化，且本领域的技术人员通过阅读说明书可很容易地测定合适的有效的量。
给药和剂量安排
疫苗组合物(含有编码抗原的序列和/或佐剂)以与适合配药药剂的相容的方式被给药于受试者，且以有效量来产生期望的粘膜免疫应答。每次给药的抗原的量为，在为编码抗原的核酸分子的情况下，通常为大约从0.001μg到10mg的范围，优选大约0.01到5000μg的核酸分子每剂量(通常为大约0.5μg/kg到100μg/kg的核酸分子每剂量)。精确的量，当然，依据受试者及其治疗或预防的条件二者。更具体的，所需的精确的量将依据年龄和个体的基本情况，和所选的特定抗原和佐剂以及其它的因素而变化。适当的有效量可被本领域的技术人员阅读本说明书后很容易的测定和/或通过常规的实验被检测。
剂量疗法可以是单剂量进程或多剂量进程的，对疫苗组合物来说，多剂量进程的安排是一个基本的可为1-10个单独剂量的接种过程，然后在其后的时间间隔给与其它的剂量，被选择来维持和/或加强免疫应答。例如在1-4月进行第二次给药，且如果必要，其后的给药在几个月后。剂量可控制，至少部分决定于受试者的需要以及决定于医师的分析判断。此外，如果疾病的预防是理想的，组合物通常在目的病原体的初步感染之前给药。如果治疗是理想的，例如，症状的减轻或复发的减少，组合物通常在最初的感染之后被给药。
C.实施例
下面是用来实施本发明的具体实施方案的实施例。实施例仅仅是用来阐述发明的目的，且并不是以任何方式来限定本发明的范围。
我们已经努力来确保所用数字的精确度(例如，量，温度，等等)，但一些实验错误和误差将，当然，被允许。
                     实施例1
   利用颗粒介导的递送技术来重新引导对CEA的免疫应答
为了证明MPL佐剂对裸DNA疫苗免疫应答的影响，进行下面的研究。佐剂和含有编码目的抗原的序列的核酸分子被通过颗粒介导的递送利用基因枪共同给药。此实施例所用的特定的抗原为人癌初期抗原(″CEA″)，人肿瘤抗原被广泛的用于癌治疗研究的实验中。以前的工作揭示了当一个编码CEA的基因通过颗粒介导的递送被递送到小鼠中时，Th2型的免疫应答为优势的，其通过IgG1在动物的血清抗体的滴度优势被显示。没有佐剂时，Th2型CEA特异性抗体(IgG1)在大于Balb/c小鼠的Th1型CEA特异性抗体(IgG2a)20倍的水平被检测。在此进行的工作被用于论证Th2免疫应答能够被改变为Th1应答通过使用免疫改变佐剂。
为达到此方案的目的，含有CEA抗原的在巨细胞病毒启动子和编码区域之间带有CMV内含子的立即早期启动子的调控下的编码区的质粒构建体被使用。为了形成组合物，在120μL水中的64μg的被称为WRG7083的质粒被加到Eppendorf管中的32毫克的0.9微米金珠中，例如2μg DNA/mg金。然后，13.5μL的醋酸铵溶液和135μL的异丙醇被加入，且试管被简单地涡旋。混合物在-20℃温育15分钟来沉淀DNA到金上。DNA包被的珠被沉淀下来通过10分钟旋转并除去上清液。金/DNA颗粒通过在1mL乙醇中涡旋洗涤四次，微量离心(microfuging)10秒钟，并除去上清。在最后洗涤后，DNA包被的金载体颗粒被重悬浮在1.14mL乙醇中，使得每250μ的乙醇悬浮液含有7mg的金载体颗粒，其中每毫克金带有2μg的DNA。
分别的，乙醇中1mg/mL MPL的溶液被制备并被用作MPL贮存液。然后制备下列的各种溶液：
(0MPL)-250μL载体颗粒悬浮液，750μL额外的乙醇，以及0μL MPL贮存液。
(0.05mg/mL MPL)-250μL载体颗粒悬浮液，750μL额外的乙醇，以及50μL MPL贮存液。
(0.2mg/mL MPL)-250μL载体颗粒悬浮液，750μL额外的乙醇，以及200MPL贮存液。
(0.5mg/mL MPL)-250μL载体颗粒悬浮液，750μL额外的乙醇，以及500MPL贮存液。
(1mg/mL MPL)-250μL载体颗粒悬浮液，通过离心除去乙醇并用MOL贮存液替换。
每一种制剂在水浴超声仪中超声作用10秒钟以在乙醇中产生均一的金载体颗粒悬浮液。
这里所述的颗粒介导的递送利用通过压缩气推动的基因递送装置实施。此设备获自Agracetus，Inc.且被称为ACCELL装置，大体上相同的设备目前可获自PowderJect Vaccines，Inc.且被称为PowderJectTMXR装置。此装置的基本样式，描述于PCT专利申请PCT/US95/00780和美国专利5,865,796及5,584,807，这些公开引入本文作为参考，构建以便DNA包被的载体颗粒被放置，或包被其本身到圆柱形的颗粒载体的内部。对于这一载体，TefzelTM管的圆柱形部分被利用。利用带有为此目的制备的装置接头的注射器，上述每一种悬浮液被注入到30英寸长的TefzelTM管中，1毫升(7mg DNA包被的金颗粒)的每一悬浮液灌注到7英寸长的管中，每英寸的管产生极小分散的1mg的含有或不含有MPL的DNA-包被的金载体颗粒。管被转到使管保持线性水平状态的固定装置中。在载体颗粒被允许片刻的明显沉淀后，过量的乙醇被从管的一端排出且管被旋转三十秒来更平均地分散颗粒包围在圆柱形管的内部。残留的乙醇然后用氮气通过管30分钟被除去。管被分割成很多部分，每一部分为1/2英寸长。每一部分管被用作一份药剂用于加速装置，其释放喷射的压缩氦气通过管部分内部来从管获取载体颗粒并携带其用于实验的受试者。
模型动物为6到8周龄的Balb/c小鼠(Harlan/Sprague/Dawley，Indianapolis Indiana)，其已被麻醉且除去腹部毛发。在每一动物腹部的两个相邻位置的每一处，单剂量的DNA包被的载体颗粒被递送到表皮中通过具有400psi压力的氮气交换。因此每一位点接收到1μg的在0.5mg含有不同量MPL的金载体颗粒上的DNA，且每一动物具有两个位置。
在平行实验中，MPL贮存液在基因递送之前通过擦拭被直接用于动物的治疗位点的皮肤。通过用浸入过MPL贮存液溶液的棉花涂药器在动物腹部的擦拭，其后在递送相应剂量的DNA包被的载体颗粒之前乙醇被允许蒸发10分钟。
在处理4周后，血清样从免疫的动物获得并利用得自SouthernBiotech的ELISA试剂盒定量测定CEA特异性抗体(IgG和IgG2a)。通过与已知浓度的标准免疫球蛋白同种型比较，CEA-特异性免疫球蛋白的定量测定得以进行。
研究的结果描述于附图1。如所显示的，受试于基因疫苗的佐剂和佐剂的每一剂量水平的三个小鼠在图表中用单个的棒条表示。在图表的左端，三个棒条表示接受不含MPL的药剂的动物，这些动物的免疫应答，如所看到的，为显著的Th2-类，IgG1类型抗体与IgG2a抗体的比平均为27.5倍。在治疗动物中免疫应答的性质变化最大的为0.2mg/mL MPL的比率，其中IgG1与IgG2a的比降低为4.5。当MPL被擦拭于动物时，如附图1的最右边所显示的，结果可比较于0.2mg/mL基因枪递送方法，IgG1与IgG2a的比约为4.0。其它的MPL剂量显示了免疫应答的重新引导的水平的变化，但是全部清楚显示了比没有佐剂的基因疫苗所获得的更强烈的IgG2a应答。这些结果证明MPL佐剂的应用通过改变应答中Th1型抗体的产生的确改变了针对基因疫苗的免疫应答的性质。
下面描述的实施例2-5的研究，被进行来评价不同编码抗原的序列和Quil A佐剂的胞内共同给药所提供的佐剂的效果。在每一研究中含有编码病毒抗原的序列的DNA分子被与Quil A佐剂结合并包被在金颗粒上来提供与本发明相符的示范的组合物。包被的颗粒给药于动物受试者，且组合物引发抗原特异性Th的能力，CTL和抗体应答的能力与Quil A佐剂在DNA递送之前的直接胞外皮内给药或皮下给药比较。在每一研究中，使用下面的常规方法。
包被核心载体颗粒：称重合适重量的金颗粒直接加到1.5mLEppendorf管中。然后加入400-500μL的0.05M亚精胺，金/亚精胺溶液的凝块通过使用水浴超声波3-5秒打碎。DNA贮存液，含有相应的DNA质粒分子，被加入到金/亚精胺溶液中来产生2.0μg DNA/mg Au的装载率的珠子，且管被盖盖并倒置混合，然后短暂涡旋。在调低涡旋速度后，且当轻轻地涡旋时，10％CaCl2被滴加加入到等于加到干燥金颗粒上的亚精胺的体积。一旦全部的CaCl2被加入，产生的溶液被高速涡旋5秒钟。溶液然后被允许在室温下沉淀至少10分钟。同时，聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)/乙醇贮存液以0.03mg PVP/mL EtOH的浓度被形成。在10分钟的沉淀后，管被短暂离心(10-15秒)来沉淀所有的金。上清液被抽出，且管被“倾斜”穿过Eppendorf支架来分散金颗粒。800μL的EtOH被加入，且管被倒置几次来洗涤DNA-包被的金。此步骤被重复两次。在此管被再次离心和抽去上清后，洗涤的DNA包被的金颗粒家道PVP贮存液，加50μg的Quil A到PVP-DNA包被的金颗粒溶液中，超声波处理3秒。产生用DNA+Quil A疫苗组合物包被的颗粒，其然后装载到TefzelTM管的如实施例1所述的节段。
鼠ELISPOT分析：材料和试剂如下。包被的载体包括大鼠(Rat)抗鼠IFN-γAb，大鼠抗鼠IL-4 AB或大鼠抗鼠IL-5 Ab(Pharmigen)；检测抗体包括生物素标记的大鼠抗鼠IFN-γ，生物素标记大鼠抗鼠IL-4或生物素标记大鼠抗鼠IL-5(Pharmingen)；无菌过滤的碳酸盐缓冲液pH9.6(Pierce)，96孔ELISPOT板(Millipore)，无菌1X磷酸盐缓冲液盐水(PBS，Gibco)，链霉抗生物素碱性磷酸酶耦合物(Mabtech)；碱性磷酸酶底物试剂盒(BioRad)，以及RPMI-10％FCS细胞培养基(Sigma)。细胞刺激按如下进行。对T辅助细胞因子释放(T-Helper Cell Cytokine Release)而言，来自接种动物的脾细胞被培养在6×106细胞/mL的补充了丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI 10％FCS中。1mL的细胞被转到24孔板的每一孔中，对于每一个受试者，1孔＝仅培养基(用于本底对照)，以及1孔＝所选的抗原或所选的II型肽。板然后被温育在组织培养恒温箱3天。为了CTL前体IFN-γ释放(CTL Precursor IFN-γRelease)，来自接种动物的脾细胞被培养在6×106细胞/mL的补充了丙酮酸钠和非必需氨基酸的RPMI-10％FCS中。1mL的细胞被转到24孔板的每一孔中，板被温育两天。其后加入CTL肽到肽孔中后，对于每一个受试者，1孔＝仅培养基(用于本底对照)，1孔＝10-5M的CTL肽，以及1孔＝不相关的CTL肽。板在加入肽之后且放置细胞到ELISPOT板之前被温育。
ELISPOT板的包被和阻断被进行如下。ELISPOT板在放置细胞之前利用50μL每孔的15μg/mL包被抗体在pH9.6的无菌碳酸盐缓冲液中包被一天。包被的板在其被用100μL PBS洗涤6次除去未结合的包被Ab之前4℃温育过夜，然后轻轻地涂布。每一孔被用200μL RPMI-10％FCS阻断1-2个小时，室温下在组织培养箱中。所有的阻断介质在细胞被放置之前除去。细胞被放置如下，在3天后，每孔的细胞和上清液被收集并转到15mL圆锥形管中。细胞被旋转离心来收集上清，然后-80℃保存直至被用于细胞因子ELISA分析。沉淀的细胞被重悬浮在2-5mL介质中，然后使之达到终浓度为1×107/mL。细胞被加至ELISPOT孔中浓度为1×106/孔。
ELISPOT板被显色(developed)如下。细胞被轻轻拂出且通过喷瓶用PBS洗涤两次板。孔被用DI水洗涤(将水留在孔中几分钟来溶解残留的细胞)，板被洗涤两次或更多次。检测抗体在无菌PBS中被稀释到1μg/mL且然后被加至50μL/孔并室温下温育2小时。板用PBS洗涤5次并加入50μL链霉抗生物素碱性磷酸酶偶合物(在PBS中稀释1∶1000)，且板在室温下被温育2小时。板然后用PBS洗涤5次，且50μL的产色碱性磷酸酶底物被加入，且板被允许在室温下温育直至暗斑点出现(大约2小时)。颜色反应通过用200μL的自来水洗涤三次被终止，板允许被干燥，并在解剖显微镜(40x)下计算点数。
小鼠肽-脉冲CTL分析：材料和试剂如下。RPMI-10培养基(500mL RPMI 1640含有L-谷酰胺和羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes)，55mL热失活的胎牛血清(FBS)，0.5mL庆大霉素，5.5mL抗生素(抗真菌溶液)；致敏培养基(Sensitization Media)(″SM″)不含IL-2(500mL RPMI-10，5.0mL 100mM丙酮酸钠，5.0mL 100X非必需氨基酸)；以及含有IL-2的SM(SM含有终浓度为20U/mL的重组鼠IL-2)；CTL表位肽(肽被溶解在组织培养级的DMSO中到10-2M的备用浓度)；ACK溶解缓冲液(BioWhittaker)；重组鼠IL-2(Collaborative)；丝裂霉素CC(Aldrich溶解在无菌PBS中来获得500μLg/mL的贮存液；50mL圆锥形管(Falcon)，尼龙网过滤器cupinserts(Falcon)；51Cr和Lumaplates(Packard)。
为了进行肽-脉冲刺激，通过收集脾脏和通过在两片高压磨砂玻片之间压榨研磨来破碎液囊以提供年幼同源的(syngeneic)脾脏(approx.1.2x刺激物/小鼠)并释放细胞到小陪替氏培养皿中。细胞块通过用3mL的吸移管上下吸吹被破坏，且产生的细胞悬浮物被通过70μm尼龙细胞滤过器过滤到50mL圆锥形管中使用5-10mL RPMI-10培养基来洗涤细胞。通过回收的脾细胞1500rpm旋转5分钟来沉淀，且弃去上清液。RBCs通过重悬浮脾细胞在5mL ACK溶解缓冲液中1-2分钟被溶解，然后在细胞用20mL未补充的RPMI洗涤两次和RPMI-10洗涤一次。细胞然后被重悬浮大约1×107细胞/mL。刺激物用丝裂霉素C(对于每10mL细胞，500μL的0.5mg/mL的丝裂霉素C被加入)处理，且细胞与丝裂霉素C一起37℃，5％CO2下温育25-45分钟。在处理后，细胞用未补充的RPMI洗涤两次以及用RPMI-10洗涤一次。洗涤后的细胞在含有20U/mL大鼠IL-2的SM中重悬浮到2×106细胞/mL，且储存的CTL表位肽被加入。刺激物细胞被以3/1响应物(responder)/刺激物分散到24孔板中并37℃，5％CO2温育过夜。
如下进行响应器细胞的体内刺激。脾脏从接种的和对照小鼠中收集，响应器脾细胞通过如上所述研磨脾脏被分离。RBCs被用5mL ACK溶解缓冲液溶解2-3分钟，细胞被用20mL的未补充的RPMI洗涤两次以及用RPMI-10洗涤一次。脾细胞然后重悬浮在没有IL-2的SM中到6×106细胞/mL的浓度。对于每一个小鼠，1mL的脾细胞分散到含有1mL的2×106细胞/mL如上述含有IL-2的SM中的肽脉冲刺激器细胞的24孔板的每一孔中(IL-2的终浓度为10U/mL)，板37℃，5％CO2温育5-7天。
CTL  51 Cr释放试验：对于肽特异性溶解来说，利用下面的技术。对数期同源的靶细胞被沉淀于96孔板中，大约30,000靶(细胞)/孔。合适量的靶细胞沉淀(pellet)圆锥形管中并在20μL的热失活FBS中重悬浮。每一沉淀物中加100-200μL的51Cr(铬酸钠)。混合小孔。然后在37℃温育1小时。细胞然后以每沉淀6-10mL RPMI-10洗涤，然后悬浮在3×105细胞/mL RPMI-10中。为了肽-脉冲靶，适当量的贮存Ctl表位肽被加入来达到最佳的终浓度(大约10-5M)。靶细胞在用效应器细胞涂板(plating)之前被允许用肽脉冲至少30分钟(37℃)。
在体外刺激5-7天后，从24孔板中收集效应器脾细胞且来自各小鼠的细胞在15mL圆锥管中凝聚(pool)，然后重悬浮为1.5×107细胞/mL。为了涂板，来自各小鼠的脾细胞以50，17，5.6和1.9效应器/靶的比率被涂板。在稀释后，100μL的51Cr-标记的靶被加至各小孔中。短暂旋转板后温育在37℃4-6小时。测定抵抗各小鼠肽脉冲和未脉冲对照的靶的溶解。
对非特异性溶解来说，相同的方法如下除了100μL的未脉冲的靶(细胞)也被涂板。在4-6小时温育后，旋转板来沉淀细胞和溶解。25μL的上清液被转到Lumaplates中并允许2小时或过夜干燥。密封板并通过标准方法进行51Cr-固体计数。为了计算溶解的百分率，(试验的cpm-spont.cpm)除以(最大cpm-spont.cpm)并乘以100。为获得％特异性溶解，从％溶解的肽脉冲靶细胞中减去％溶解的未脉冲靶细胞。
ELSA：抗体对不同疫苗组合物的应答被通过标准的ELISA方法测定。更具体的，培养基结合板(Costar)用含有1μg/mL抗原贮存液溶液(在PBS中)以100μL/孔包被并于4℃温育过夜。抗原溶液被抽吸且板用5％奶粉(dry milk)/PBS室温下阻断至少1小时。板用洗涤缓冲液(10mM TBS/0.1％Brij-35)洗涤三次，且100μL的样品血清被加入并室温下温育两个小时(稀释缓冲液：2％奶粉/PBS/0.05％Tween-20)。板被洗涤三次且用生物素标记的对鼠免疫球蛋白IgG特异或对IgG亚组特异的的山羊抗体室温下温育1小时。洗涤三次后，ELISA板用链霉抗生物素-辣根过氧化物酶偶合物室温下温育1小时。最终，板被洗涤并用TMB底物显影(试剂盒来自Bio-Rad，Richmond，CA)并允许显影30分钟。反应用1N H2SO4终止，且板在A450处读数。平均的背景吸光度通过接受除测试血清外所有试剂的小孔来被检测。
                     实施例2
         Quil A与金珠上的DNA胞内共同给药
           来增强流感NP-特异的免疫应答
为了检测是否含有编码流感NP抗原的DNA疫苗载体的组合物和QuilA佐剂直接进入细胞的共同给药能够增强抗原特异的免疫应答，进行下面的研究。设立如下Balb/c小鼠的实验组：(组1)3个通过PowderJectTMXR颗粒介导的递送装置接受包被不相关DNA的金珠的对照小鼠；(组2)3个通过PowderJectTMXR装置接受仅包被NP DNA载体的金珠的小鼠；(组3)4个通过PowderJectTMXR装置接受仅包被NP DNA载体的金珠并在DNA给药之前以海藻糖或生理盐水接种的小鼠；(组4)3个接受包被NP DNA载体的金珠和Quil A佐剂的小鼠；(组5)3个在Quil A的皮内注射后立即接受包被NP DNA载体的金颗粒的共同给药的小鼠；以及(组6)3个在Quil A的皮下注射后立即接受包被NP DNA载体的金颗粒的共同给药的小鼠。
包含编码流感NP抗原(来自PR8菌株)的序列的NP DNA载体被描述在Pertmer等(1995)Vaccine 13：1427-1430。所有的金颗粒如上所述以0.5mg Au/靶的珠装载率和2.0μg/mg Au的DNA装载率被装载。用PowderJectTMXR装置在两个靶位点以400psi的运作压力给药，且是一个仅为初次免疫(prime-only)的实验。在一个月后，小鼠被处死且收集血液和脾脏样本用于上面所述的分析。对于ELISPOT分析而言，被用于刺激CTL前体的肽为TYQRTRALV(10-8M)且溶解的5μg/mL的流感PR8病毒被用于Th刺激。为了进行铬分析，用于刺激响应器的肽为TYQRTRALV(10-8M)；且用于脉冲靶的肽为TYQRTRALV(10-5.5M)。为进行ELISA，捕获的抗原为1mg/mL的PR8 NP抗原(Sprafas)。
研究的结果描述在表1中，如所看到的，Quil A与DNA载体(组4)的联合给药增强了抗原特异的T辅助细胞应答，CTL和抗体应答，且优于在DNA递送之前立即进行Quil A来产生CTL和抗体应答的细胞外皮内(组5)或皮下(组6)的共同给药。
                             表1
  组#   平均CTLpSFC/106细胞   平均％溶解(40∶1E/T)   Th1应答(INF-γ)   Th2应答(IL-4)    IgG(滴度)
    1     0     0     0     0     ＜100
    2     18     12.6     15     3     14,642
    3     nd     17.5     nd     nd     5.171
    4     52     43.0     53     14     40,637
    5     6     5.7     55     28     5,283
    6     4     19.7     nd     nd     25,600
                    实施例3
          Quil A与金珠上的DNA胞内共同给药
            来增强流感NP-特异的免疫应答
为了辅助证实上述实施例2的结果，进行下面的研究。设立如下Balb/c小鼠的实验组：(组1)4个通过PowderJectTMXR颗粒介导的递送装置接受包被不相关DNA的金珠的对照小鼠；(组2)4个通过PowderJectTMXR装置接受包被非相关DNA的金珠和Quil A佐剂共同给药的小鼠；(组3)4个通过PowderJectTMXR装置接受仅包被NP DNA载体的金珠的小鼠；以及(组4)4个接受包被NP DNA载体的金珠和Quil A佐剂的小鼠。
再一次的，包含编码流感NP抗原(来自PR8菌株)的序列的NP DNA载体被描述在Pertmer等(1995)Vaccine 13：1427-1430。所有的金珠如上所述以0.5mg Au/靶的珠装载率和2.0μg/mg Au的DNA装载率被装载。用PowderJectTMXR装置在两个靶位点以400psi的运作压力给药，且是一个仅为初次免疫的实验。仅接种一次，在一个月后，小鼠被处死且收集血液和脾脏样本用于上面所述的分析。对于ELISPOT分析而言，被用于刺激CTL前体的肽为TYQRTRALV(10-8M)且溶解的5μg/mL的流感PR8病毒被用于Th刺激。为了进行铬分析，被用于刺激响应器的肽为TYQRTRALV(10-8M)；且用于脉冲靶的肽为TYQRTRALV(10-5.5M)。为进行ELISA，捕获抗原为1mg/mL的PR8 NP抗原(Sprafas)。
研究的结果被描述在表2中。如所显示的，Quil A与DNA载体(组4)的联合胞内给药提供了增强的抗原特异的T辅助细胞应答，CTL应答，和抗体应答。
                            表2
  组#     平均CTLpSFC/106细胞     平均％溶解(50∶1 E/T)    IgG(滴度)
    1     6.5     0.3     ＜100
    2     0.5     0     ＜100
    3     14.5     17.0     16.846
    4     25.0     28.8     62,706
                    实施例4
           Quil A与金珠上的DNA胞内共同给药
           来增强HIVgp120-特异的CTL免疫应答
为了检测是否含有编码人免疫缺陷病毒(HIV)gp120抗原的DNA疫苗载体的组合物和Quil A佐剂直接在细胞中的共同给药能够增强抗原特异的免疫应答，进行下面的研究。设立如下Balb/c小鼠的实验组：(组1)4个通过PowderJectTMXR颗粒介导的递送装置接受包被不相关DNA载体的金珠的对照小鼠；(组2)4个通过PowderJectTMXR装置接受包被不相关DNA的金珠和Quil A的小鼠；(组3)3个通过PowderJectTMXR装置接受包被HIVgp120 DNA育的金珠的小鼠，初次免疫1次，并加强3次；(组4)3个通过PowderJectTMXR装置接受包被HIVgp120 DNA载体的金珠的小鼠，初次免疫1次，并加强1次；(组5)3个通过PowderJectTMXR颗粒介导的递送装置接受包被HIVgp120 DNA载体的金珠和Quil A佐剂共同给药的小鼠，初次免疫1次，并加强3次；以及(组6)3个通过PowderJectTMXR颗粒介导的递送装置接受包被HIVgp120 DNA载体的金珠和Quil A佐剂共同给药的小鼠，初次免疫1次，并加强1次。
HIV gp120 DNA载体含有编码HIV gp120抗原(来自LAI菌株)的序列且被描述于Heydenburg等(1994)AIDS Res.and Hum，Retroviruses10：1433-1441。所有的金颗粒如上所述以0.5mg Au/靶的珠装载率和2.0μg/mg Au的DNA装载率被装载。用PowderJectTMXR装置在两个靶位点以400psi的运作压力给药。进行不同数目的接种(一些加强免疫1次，另一些加强3次)，每四周进行一次接种给药。在研究的第14周处死小鼠，并收集脾脏样本用于上述的分析。对ELISPOT分析来说，用于刺激CTL前体的肽为RGPGRAFVTI(10-7M)。对于铬实验来说，用于刺激CTL响应器和脉冲靶的肽为RGPGRAFVTI(10-7M)。
研究的结果被描述在表3中。如所显示的，结果证明了上面流感抗原的在初次免疫1次，并加强1次后，胞内Quil A和DNA共同给药中增强了HIV gp120-特异性CTL应答的数据，当小鼠被加强免疫三次时没有显著的区别。
                   表3
  组#     平均的％溶解(50∶1 E/T)
    1     3.2
    2     3.5
    3     36.7
    4     14.7
    5     32.7
    6     35.4
                  实施例5
        Quil A与金珠上的DNA胞内共同给药
         来增强HBs Ag-特异的CTL免疫应答
为了检测是否含有编码肝炎B病毒表面抗原(HBsAg)的DNA疫苗载体的组合物和Quil A佐剂直接在细胞中的共同给药能够增强抗原特异的免疫应答，进行下面的研究。设立如下Balb/c小鼠的实验组：(组1)4个通过PowderJectTMXR颗粒介导的递送装置接受包被不相关DNA的金珠的对照小鼠；(组2)4个接受包被HbsAg DNA载体的金珠并通过PowderJectTMXR颗粒介导的递送装置给药的小鼠；以及(组3)4个通过PowderJectTMXR装置接受包被HbsAg DNA载体的金珠和QuilA佐剂的小鼠。实验通过利用完全相同的试验组重复多次。
含有编码HBV表面抗原的序列的HbsAg DNA载体被称为pWRG7128。质粒pWRG7128除了合适调控元件外，含有在巨细胞病毒(CMV)启动子的转录调控下编码肝炎B表面抗原(HbsSAg)的序列，其被转染到大多数的细胞类型中后，显示产生HbsAg颗粒。pWRG7128质粒构建如下。克隆载体pWRG7077(Schmaljohn等(1997)J.Virol.71：9563-9569)被制备来接受HbsAg编码序列通过用BamH1来完全消化载体，然后，用Hind3部分消化。通过用Klenow片段和脱氧核苷酸平截5′端的突出部份之后，4.3kB的载体片段被分离。1.35kB HbsAg插入片段(含有非翻译的pre-S2序列，adw菌株的226个氨基酸HbsAg编码序列，以及HBV增强子元件)通过用BamHl消化被从质粒pAM6(ATCC，Rockford，MD)上切除。在通过用Klenow片段和脱氧核糖核苷酸处理平末端后，片段被分离并结合到4.3kB的上述载体片段上。产生的重组体筛选正确的插入方向且正确的分离子被鉴定并被称为中间体质粒(pWRG7074)。为了去除X蛋白的密码子的启动点(start)(存在于pAM6 1.35kB插入子的3′末端)，一个4.86kB的载体片段被分离自WRG7074质粒通过用Bg12消化，用Klenow片段和脱氧核糖核苷酸处理平末端，然后用BstX1消化。接着，754bp的插入片段被分离自pWRG7074构建体通过用Ncol消化，用绿豆核酶处理，以及用BstX1消化。产生的载体和插入片段然后被结合在一些来形成临床质粒pWRG7128。所有的金珠如上所述以0.5mg Au/靶的珠装载率和2.0μg/mgAu的DNA装载率被装载。用PowderJectTMXR装置在两个靶位点以400psi的运作压力给药。仅接种一次，在一个月后，小鼠被处死并收集脾脏样本并如上所述用于铬释放(特异性溶解)分析。对于ELISPOT分析，用于刺激CTL前体的肽为IPQSLDSWWTSL(10-6M)。对于铬分析，使用表达HBV表面抗原的P815细胞系代替肽用于刺激响应器(40,000/孔)和用于效应器(30,000/孔)。
研究的结果被描述在表4中。如所显示的，结果证明了上面流感抗原和HIV抗原在胞内的Quil A和DNA共同给药中增强了HBsAg-特异性CTL应答的数据。
                            表4
  ％特异性溶解在效应器∶靶的比率   组2动物，第一次试验   组3动物，第一次试验   组2动物，第二次试验   组3动物，第二次试验
    17∶1     26.9     44.2     53.4     78.6
    5.6∶1     16.5     36.3     34.7     70.9
    1.9∶1     7.4     18.0     22.3     41.9
相应的，公开了新的诱导免疫应答的疫苗组合物和方法。虽然描述了主题发明优选实施方案的一些细节，应当理解可以进行不离开由附加权利要求所定义的本发明精神和范围的明显的变化。

Claims (47)

1.一种组合物含有：
一种包含编码抗原的序列的核酸分子；以及一种佐剂，其有效地增强至少一种引发抵抗抗原的免疫应答的组分，其中的佐剂以非DNA的形式存在于组合物中。
2.如权利要求1所述的组合物，其中的核酸分子存在于载体构建体中。
3.如权利要求1所述的组合物，其中的核酸分子和佐剂被包被在核心载体颗粒上。
4.如权利要求3所述的组合物，其中的核心载体颗粒是金颗粒。
5.如权利要求1所述的组合物，其中的核酸分子和佐剂被包被在标称大小约0.1到10μm大小的核心载体颗粒上。
6.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂以蛋白的形式存在于组合物中。
7.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂以脂的形式存在于组合物中。
8.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂以非蛋白激素或其类似物的形式存在于组合物中。
9.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂以维生素或其类似物的形式存在于组合物中。
10.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂包括来自卡介苗(BCG)的纯化蛋白。
11.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂包括分支杆菌细胞壁骨架物质。
12.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂是单磷酰脂A。
13.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂是皂草苷或其衍生物。
14.权利要求13的组合物，其中的佐剂是Quil-A。
15.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂至少部分溶于乙醇。
16.如权利要求1所述的组合物，其中的佐剂是免疫改变佐剂。
17.如权利要求1所述的组合物，其中的抗原是来自传染性的或寄生虫疾病的因子。
18.如权利要求1所述的组合物，其中的抗原来自病毒。
19.权利要求18的组合物，其中的病毒选自由肝炎B病毒(HBV)，人免疫缺陷病毒(HIV)以及流感病毒组成的组。
20.如权利要求1所述的组合物，其中的抗原来自寄生虫病因子。
21.如权利要求20所述的组合物，其中的抗原是来自疟疾寄生虫的环子孢子(CS)抗原。
22.适用于颗粒介导的核酸免疫的包被颗粒，其中的颗粒包括用含有佐剂和包含编码抗原的编码序列的核酸分子的组合物包被的核心载体颗粒，其中佐剂以非DNA的形式存在于组合物中。
23.如权利要求22所述的包被颗粒，其中所述的颗粒为钨或金颗粒。
24.如权利要求22所述的包被颗粒，其中所述的抗原为病毒，细菌，寄生虫或真菌病原体抗原。
25.如权利要求22所述的包被颗粒，其中所述的抗原是肿瘤特异性抗原或与自身免疫病相关的抗原。
26.一种适于颗粒介导的核酸免疫的颗粒加速装置，其中的装置用权利要求22的包被颗粒装载。
27.权利要求1的组合物在用于核酸免疫的药物生产中的应用。
28.权利要求3的组合物在用于核酸免疫的药物生产中的应用。
29.一种用于在个体中引发抵抗所选抗原的免疫应答的方法，所述的方法包括递送权利要求1的组合物直接到存在于个体靶位点的细胞中以充分的量来产生所述的免疫应答。
30.权利要求29的方法，其中的核酸分子和佐剂被包被到核心载体颗粒上。
31.权利要求30的方法，其中的组合物通过颗粒介导的递送技术被递送。
32.权利要求29的方法，其中的靶位点是表皮组织。
33.一种组合物，其含有一种包含编码抗原的序列的核酸分子；以及一种免疫改变佐剂，其在接受所述组合物的个体中有效地增强引发抵抗抗原免疫应答的T辅助细胞1(Th1)组分，其中的免疫改变佐剂以非DNA的形式存在于所述组合物中。
34.如权利要求33所述的组合物，其中的抗原是来自传染性的或寄生虫疾病的因子。
35.如权利要求33所述的组合物，其中的免疫改变佐剂是单磷酰脂A。
36.一种含有用权利要求33的组合物包被的核心载体颗粒的药物制剂。
37.一种用于在个体中引发抵抗所选抗原的免疫应答的方法，所述的方法包括：
(a)递送核酸分子到存在于个体的靶位点的细胞中，其中所述的核酸分子含有一个序列，其在所述细胞中表达在充分的水平上产生所选抗原来引发个体中的抗原特异的免疫应答；和
(b)给药免疫改变佐剂到靶位点，其中的佐剂被给药以充分的量来改变抗原特应的免疫应答有利于T辅助细胞1(Th1)型或T辅助细胞2(Th2)型应答。
38.如权利要求37所述的方法，其中的抗原来自传染性的或寄生虫疾病的因子。
39.如权利要求37所述的方法，其中的核酸分子存在于载体构建体中。
40.如权利要求37所述的方法，其中的核酸分子通过颗粒介导的递送技术被递送。
41.如权利要求37所述的方法，其中的免疫改变佐剂被局部给药于靶位点。
42.如权利要求37所述的方法，其中的免疫改变佐剂通过颗粒介导的递送技术给药于靶位点。
43.如权利要求37所述的方法，其中的免疫改变佐剂是单磷酰脂A。
44.如权利要求37所述的方法，其中的核酸分子含有编码来的自疟疾寄生虫的环子孢子(CS)抗原的序列。
45.如权利要求37所述的方法，其中的靶位点是表皮组织。
46.如权利要求37所述的方法，其中的核酸分子和佐剂被同时给药。
47.如权利要求37所述的方法，其中的核酸分子和佐剂被结合来提供一种单一的组合物。
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