CN1425911A - 快速消除生物分子荧光的拉曼测试法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种快速消除生物分子荧光的拉曼测试法，先将极少量的硝基苯掺入要测试的生物分子溶液，略加搅拌，放入离心试管里，再用离心机离心分层后将硝基苯去除。此方法能有效地猝灭荧光，迅速得到清晰稳定的拉曼光谱图，而且对生物分子本身的构象影响很小，有助于。
Description
技术领域
本发明涉及到一种在进行拉曼测试时快速消除生物分子荧光的方法，属于拉曼光谱测试的技术领域。
背景技术
目前，激光拉曼技术越来越经常地被用于探测蛋白质等生物大分子的分子结构，特别是它们在低浓度水溶液中的天然构象。但大多数蛋白质在激光照射下会出现荧光，而荧光只要出现，其强度总会超过拉曼信号，以至难以获得清晰可辨的拉曼图谱。长期以来，为了消除荧光，主要都采用大功率激光对测试样品进行较长时间照射的方法，使荧光强度退化到可接受的水平。这种照射，随着样品的不同，需要的时间也不同，有的仅需几十分钟，有的却长达数十小时还达不到理想的效果。即使经过激光照射消除荧光的预处理，在测试蛋白质等有较大荧光产率的生物样品激光拉曼光谱时，为防止荧光干扰和波动，必须扫描速度很慢，积分时间很长，如在常用的表征生物分子结构特征的扫描范围内，从500cm-1到1800cm-1，往往扫描一次需数小时甚至数十小时以上。
发明内容
本发明就是对现有方法的不足提出的一种快速消除生物分子荧光的拉曼测试法，此方法能有效地猝灭荧光，迅速得到清晰稳定的拉曼光谱图，而且对蛋白质等生物分子本身的构象影响很小。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：先将极少量的分析纯硝基苯掺入要测试的生物分子溶液，略加搅拌，放入离心试管里，再用离心机离心分层后将硝基苯去除。这样处理后荧光则基本被猝灭，可以迅速测试到带有硝基苯本底的生物分子的清晰稳定的激光拉曼谱。再以同样条件单独测试硝基苯的激光拉曼谱，以表示NO2的对称伸缩振动的1350cm-1为基准峰，用计算机进行光谱峰值的基线校正，扣除硝基苯拉曼光谱的本底，这样就能得到相当好的去除了荧光的该生物分子溶液拉曼光谱图。
具体实施方式
1.将核糖核酸酶结晶粉末溶解于二次蒸馏水中，配制成4％的核糖核酸酶溶液，加入占核糖核酸酶溶液总量1％的硝基苯，用搅拌器搅拌3分钟，放入离心试管里，经高速离心机离心15分钟后分层，取出上层清澈的核糖核酸酶溶液测试激光拉曼谱。
经上述处理后，蛋白质分子的荧光几乎全被猝灭。以200mW出射激光功率和2cm-1/sec扫描速度，所得的拉曼光谱图清晰稳定。一共扫描8遍，由于克服了荧光干扰，得到拉曼光谱图的速度大大加快，只要十余分钟就可以扫描一遍。再由计算机对采集信号作累加平均。以同样条件测试硝基苯的激光拉曼谱，以表示NO2的对称伸缩振动的1350cm-1为基准峰，用计算机进行光谱峰值的基线校正，扣除硝基苯拉曼光谱的本底，这样得到的为相当成功的核糖核酸酶溶液拉曼光谱图。该光谱图与国外已发表文献基本一致，并可以由此定性分析出核糖核酸酶的二级结构，原核糖核酸酶的构象并未受到影响。
2.将牛血清白蛋白粉末溶解于二次蒸馏水中，配制成5％的牛血清白蛋白溶液，加入占牛血清白蛋白溶液总量0.5％的硝基苯，用搅拌器搅拌2分钟，放入离心试管里，经高速离心机离心20分钟后分层，取出上层清澈的牛血清白蛋白溶液测试激光拉曼谱。
经上述处理后，牛血清白蛋白分子的荧光几乎全被猝灭。以200mW出射激光功率和1cm-1/sec扫描速度，所得的拉曼光谱图清晰稳定。一共扫描6遍，由于克服了荧光干扰，得到牛血清白蛋白拉曼光谱图的速度大大加快，只要二十余分钟就可以扫描一遍。再由计算机对采集的信号作累加平均。以同样条件测试硝基苯的激光拉曼谱，以表示NO2的对称伸缩振动的1350cm-1为基准峰，用计算机进行光谱峰值的基线校正，扣除硝基苯拉曼光谱的本底，这样就得到相当成功的牛血清白蛋白溶液拉曼光谱图。该光谱图与国外已发表文献基本一致，并可以由此定性分析出牛血清白蛋白的二级结构，原牛血清白蛋白的构象并未受到影响。可知该方法对生物分子的拉曼测试很有实际意义。
Claims (2)
1.一种快速消除生物分子荧光的拉曼测试法，其特征是先将占溶液总量0.1％-2％的硝基苯掺入要测试的生物样品溶液，搅拌1-10分钟，放入离心试管里，再用离心机离心15-30分钟分层后，取出上层清澈的生物样品溶液测试激光拉曼光谱。
2.根据权利要求1所述的一种快速消除生物分子荧光的拉曼测试法，其特征是以上述条件测试生物样品溶液激光拉曼光谱后，再以同样条件单独测试硝基苯的激光拉曼谱，以表示NO2的对称伸缩振动的1350cm-1为基准峰，用计算机进行光谱峰值的基线校正，扣除硝基苯拉曼光谱的本底。
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