CN1425134A - 检测妇科癌症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了检测或诊断患者中妇科癌症的方法。一种包括测定病人的血浆样品中溶血磷脂酸的存在的方法可用于检测卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌和腹膜癌。在一优选实施方案中，该方法包括：提供来自病人的血样样本；在使从血样样本的血小板释放到血浆中的溶血磷脂酸最少的条件下获得用于血样样本的血浆样品；从血浆中提取脂质；以及检测脂质中溶血磷脂酸的存在。另一种方法包括测定来自受检者的体液(优选血浆)中溶血磷脂酰肌醇的存在。另一种方法包括测定来自受检者的体液中升高水平的溶血磷脂酸和溶血磷脂酰肌醇的存在。

Description

检测妇科癌症的方法
                       发明背景
妇科癌症诸如卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌和腹膜癌在美国和欧洲是妇女癌症死亡的最常见原因。据估计，单单卵巢癌1996年在美国就导致14,800例死亡。这个沮丧的结果至少部分是由于不能在肿瘤发展的早期阶段检测卵巢癌。当在早期阶段诊断出卵巢癌时，治愈率可达到90％。相反，晚期疾病妇女的5年生存率不超过15％。因此，早期诊断是改善卵巢癌预后的最有效方式之一。
经阴道的超声检查是目前用于检测卵巢肿瘤最灵敏的技术。然而，经阴道的超声检查不具有特异性，也就是说，它既检测良性肿瘤也检测恶性肿瘤。因此，利用经阴道的超声检测卵巢肿瘤之后，还必须采用第二种诊断方法来区分良性肿瘤与恶性肿瘤。而且，经阴道的超声检查非常昂贵，从而不能用作大量病人的筛选方法。
典型的是，通过利用外科方法诸如包块的活组织检查或包块的抽吸术以及对通过手术从病人体内取出的细胞进行细胞学检查，可区分良性卵巢肿瘤和恶性卵巢肿瘤。然而，这些技术具有高度的创伤性并且昂贵，特别是在抽吸术中可导致癌细胞释放到腹膜内。
抗原决定性的CA 125(一种高分子量的类似粘蛋白的糖蛋白)，是目前可选择用于筛查卵巢癌的血清生物标志。然而，CA 125测定具有两大局限性。首先，它不是非常灵敏。例如，在不到50％的I期卵巢癌病人体内存在升高的血清CA 125水平(即在35U/ml分界点之上的水平)(Taylor，K.J.W.和Schwartz，P.E.，“早期卵巢癌的筛查”Radiology，192：1-10，1994)。此外，CA 125测定的特异性不是很高。例如，大约25％的良性妇科病病人也具有升高的CA 125血清水平。另外，肝病诸如肝硬变甚至在还没有腹水时，其血清CA 125水平就升高到35U/ml之上(Taylor，K.J.W.和Schwartz，P.E.，“早期卵巢癌的筛查”Radiology，192：1-10，1994)。
因此，需要一种新颖简便、无创或微创性的方法来检测妇科癌症(特别是卵巢癌)。尤其是需要这样一些方法：这些方法就灵敏度而言足以鉴定那些早期卵巢癌患者，就特异性而言足以区分良性与恶性妇科癌症。
                       发明概述
本发明提供了用于检测受检者中妇科癌症(特别是卵巢癌)的存在的新颖简便、微创性的方法。
一种方法包括测定血浆样品中溶血磷脂酸的存在。血浆样品中溶血磷脂酸的存在指示受检者体内存在妇科癌症。在一优选实施方案中，该方法包括：从受检者的血液样本制备基本上除去血小板的血浆样品，然后用该血浆样品制备脂质提取物；以及测定所述脂质提取物中溶血磷脂酸的存在。因为该方法就灵敏度而言足以检测早期卵巢癌受检者内的卵巢癌，就特异性而言足以区分良性妇科癌症与恶性妇科癌症并且创伤性小，所以该方法对于筛查卵巢癌病人特别有用。该方法还可检测受检者内子宫内膜癌、腹膜癌和宫颈癌的存在。因此，该方法可用于筛查一种以上的妇科癌症。
另一方法包括测定体液(优选的是来自受检者的血样)中溶血磷脂酰肌醇的存在。优选的是，测定体液中溶血磷脂酰肌醇的浓度。
                       附图简述
图1A是卵巢癌病人(图1A)与健康对照受检者(图1B)的溶血磷脂的代表性质谱。
图2是健康对照受检者与卵巢和子宫内膜癌病人的总血浆LPA、LPI和LPA+LPI水平的散点图。
                       发明详述
本发明提供了用于检测或诊断受检者或病人体内妇科癌症(特别是卵巢癌)的新颖简便的方法。一种方法包括测定病人的血浆样品中溶血磷脂酸的存在。优选的是，该血浆样品基本上不合有血小板。正如本文所述的，当含有少于95％的从病人体内得到的原始血液样本中所存在的血小板时，血浆样品基本上不含有血小板。在一优选实施方案中，该方法包括：提供来自病人的全血样本；由该全血样本获得基本上不含有血小板的血浆样品；从该血浆样品中提取脂质；以及测定该脂质提取物中溶血磷脂酸的存在。
优选的是，在使存在于全血样本中的血小板所释放出的溶血磷脂酸最少的条件下，获得血浆样品。这样的条件包括例如将来自受检者的全血样本收集到含有抗凝剂的管中。合适的抗凝剂包括例如肝素以及螯合剂。优选的是，在螯合剂例如乙二胺四乙酸(EDTA)或柠檬酸钠(更优选的是EDTA)的存在下收集全血样本，这是由于螯合剂既可减小样品中磷脂酶的活性，又可避免全血样本的凝结。
通过离心全血样本以便沉淀出全血样本中的血细胞并收集上清液，一般可获得血浆，其代表了全血样本中的大部分血浆。
然后，优选的是利用脂质提取法来提取血浆样品中的基本上所有的脂质(特别是磷脂)，该方法可从血浆样品中回收至少80％的溶血磷脂酸。更优选的是，该脂质提取法可回收至少85％的血浆样品中的LPA。优选的脂质提取法的一个实施例包括以下步骤：酸化血浆样品；使被酸化的血浆样品与一种有机溶剂混合，从而获得水相和有机相，其中磷脂优先分布在有机相中；回收有机相，从而获得含有超过80％的血浆样品中的溶血磷脂酸的脂质提取物。优选的是，利用盐酸来酸化血浆样品。被酸化的血浆样品中的最终酸浓度优选在大约0.2N-大约2.0N的范围内。
用于从酸化血浆样品中提取溶血磷脂酸的合适有机溶剂包括例如丁醇、异丙醇以及包括极性有机溶剂(例如甲醇)和非极性有机溶剂(例如氯仿)的混合有机溶剂。优选的是，该有机溶剂是甲醇和氯仿比例为2∶1的混合物。
然后，利用常规技术从有机相中的其它磷脂中分离出溶血磷脂酸(本文也称作“LPA”)。一种这样的技术涉及利用薄层色谱法进行分离，从而提供一条LPA区带。
然后，利用常规技术定量LPA带中的溶血磷脂酸的量。所用的定量技术取决于受检者所提供的血液样本的量。例如，如果血液样本的容量是2ml或更少，那么优选采用能够检测皮摩尔量的LPA的定量技术。用于检测皮摩尔量的LPA的适当技术包括例如水解分离的LPA部分，然后利用气相色谱法定量水解物中的每种脂肪酸的量。如果血液样本的容量为20ml或更多，那么能够检测纳摩尔量的LPA(例如LPA部分中总的亚磷的测定)的技术是适宜的。
另一方法包括测定受检者的体液中溶血磷脂酰肌醇的(LPI)的存在。优选该体液是血液，更优选该体液是血浆。一种测定体液中LPI的存在的方法包括从样品中提取脂质、利用薄层色谱法分离脂质并利用电喷射离子质谱法(ESI-MS)进行直接分析。该方法具有以下优点：i)软离子检测完整的分子种类并因此鉴定脂质分子的真实特点；ii)通过串联-MS(MS/MS)或液相色谱/串联质谱(LC/MS/MS)分析法可测定感兴趣的离子峰结构；iii)它同时检测许多分子种类，包括具有不同脂肪酸链的脂质；iv)它是高度灵敏的(典型的是在毫微微摩尔至低皮摩尔的范围内)以及v)该测定容易适用于自动取样器。
优选的是，该方法还包括测定所述体液中的LPI的水平或浓度。按照本发明，业已确定，卵巢癌妇女与健康受检者相比，其血浆中具有更高水平或浓度的LPI。优选的是，然后将体液中的LPI水平或浓度与标准值进行比较。该标准值是基于从一群健康受检者中获得的具有可比性的样品中发现的LPI水平。体液中的LPI的标准值是例如平均水平、中间水平或者优选的是“分界水平”。可如下获得分界值：测定大样本量的健康个体并采用统计模型例如用于选择阳性标准或接受者操作者特征曲线(receiver operator characteristic curve)的预测值方法，其中所述曲线限定最佳特异性(最高的真阴性率)和敏感性(最高的真阳性率)，(参见Knapp，R.G.and Miller，M.C.(1992)“临床流行病学和生物统计学”.William and Wilkins，HarualPublishing Co.Malvern，PA，该文献在此引入作为参考)。优选的是，体液中的LPA和LPI水平都被测定。按照本发明，业已确定，基于受检者血浆中的LPA和LPI浓度的综合测定值与单独基于LPA或LPI浓度的测定值相比，是更好的卵巢癌指示指标。将综合测定值与基于健康受检者血浆中发现的LPA和LPI浓度的综合标准值进行比较。
本文公开的方法可用于检测妇科癌症例如宫颈癌、子宫内膜癌、腹膜癌和卵巢癌(即上皮性卵巢癌)。上皮性卵巢癌包括浆液性肿瘤、粘液性肿瘤、子宫内膜样肿瘤、透明细胞肿瘤、未分化的癌症、混合上皮肿瘤以及未分类的上皮肿瘤。
本文公开的方法尤其可用于评估病人体内卵巢包块的恶性程度以及用于在病人疾病发展的早期外科手术阶段(即外科I期和外科II期)和疾病发展的后期阶段(即外科III期和外科IV期)检测卵巢癌。外科阶段表示疾病的严重程度，即第一期的严重程度最小，而第IV期最严重。根据国际妇科和产科学联合会建立的标准，I期卵巢癌局限于卵巢并且可以包括也可以不包括腹水。在第II期，癌症扩散到盆腔并且有可能扩散到子宫或输卵管。第III期卵巢癌的特征在于腹部转移。在第IV期，在腹膜腔外有癌症的远处转移。
本文公开的方法简便、具有微创性并且只需要受检者的血液样本。于是，这样的方法还可用于筛查以前没有诊断为患癌症的病人，尤其是具有妇科癌症(特别是卵巢癌)危险的病人。这些病人包括鉴于家族病史而危险性增大的妇女、具有不排卵周期的绝经前妇女，以及绝经后妇女。
本发明还可用下面的实施例进一步描述。然而，这些实施例并不构成对本发明精髓或范围的任何限制。
实施例1
从84位女性受检者提供的血液样本中获得血浆样品。将来自每个受检者的大约2ml的全血样本收集到含有7.2mg的BDTA的5ml真空管内。从全血样本中获得血浆样品
使全血样本在580xg的条件下离心5分钟，从而获得血细胞和血小板的沉淀物以及上清液。将上清液转移到硅烷化微离心管中并在8000xg的条件下离心5分钟，从而获得第二沉淀物和血浆上清液。血浆上清液或者立即处理，或者贮藏在-70℃。从血浆样品中提取LPA
在0-4℃下从血浆样品中提取脂质(尤其是LPA)。每1mL的血浆样品通过加入0.2ml的12N HCl来酸化，从而获得最终HCl浓度大约2.0N的血浆样品。混合之后，将4mL包括2∶1比例的甲醇/氯仿的混合有机溶剂加入到酸化血浆中，然后使混合物涡流1分钟并在冰上温育10分钟。将1mL氯仿和1.25mL的H2O加入混合物中。彻底混合之后，在4℃下使混合物在1000xg的条件下离心10分钟。将下面的有机层转移到新的玻璃管中并在氮气下于40℃进行干燥，从而获得磷脂提取物。
通过将10nmol的合成油酰-LPA加入到三个缺乏内源性油酰-LPA的平行样品中，可检查该提取方法的总回收率和重复性。利用本发明的方法提取样品并定量每一样品中的油酰-LPA的量。该分析显示，利用本提取方法获得的LPA平均回收率为92.7％，标准误差为±5.6％。脂质提取物中的LPA的分离
将每份脂质提取物溶解到50μl 2∶1的甲醇/氯仿混合物中并加载到从EM Science，Darmstadt，Germany获得的预先包被的硅胶60TLC板(20×20cm，层厚250mm)的单个泳道上。将含有10-50μg的从Avanti Polar-Lipids，Inc.获得的油酰-LPA的50μl的2∶1甲醇/氯仿混合物加载到板的一个外侧泳道上，而将含有10-50μg的从Sigma Chemical公司获得的溶血磷脂酰胆碱的50μl氯仿加载到板另一侧的外泳道上。油酰-LPA和溶血磷脂酰胆碱用作迁移参照，以便在板上定位LPA部分。用氯仿-甲醇-氢氧化铵(65∶35∶5.5)混合物在室温下将脂质展开大约3小时。然后，用0.1％的8-苯胺基-1-萘-磺酸喷涂含有油酰LPA和溶血磷脂酰胆碱标准品的外侧泳道，并在紫外灯下进行观察。
将加载了来自血浆样品的脂质提取物的泳道中的每一分离的LPA部分从板上刮到单独的15mL一次性玻璃离心管(来自Kimble，Vineland，New Jersey)中。LPA部分包括在板上迁移一段距离的所有脂质，该距离对应于油酰-LPA标准品的Rf，并扩展至但尚未达到溶血磷脂酰标准品的Rf处。测定从每一样品中分离出的LPA的量
将2mL的1M乙醇化KOH加入到含有分离的LPA部分的每个管中。然后在60℃下使这些管温育1小时，以便水解管中存在的LPA。冷却之后，将5μl含有甲基山嵛酸盐的内标液(1.5mg/ml的氯仿溶液)、1mL的6N HC、5mL的H2O和5mL的乙醚加入到水解物中。使混合物涡流30秒并在1000xg的条件下离心10分钟。然后，将上层转移到新的玻璃管内并在氮气下于40℃进行干燥。将含有从LPA中释放出的脂肪酸的残余物溶解到0.6mL的石油醚中，然后通过将1mL的BCl3-甲醇试剂加入到每个管中并在100℃下温育10分钟，而将溶解的脂肪酸转甲基化。从Supelco Inc.，Bellefonte，PA获得BCl3甲醇。用1ml的石油醚提取脂肪酸甲酯。使混合物涡流10秒钟并在1000xg的条件下离心5分钟。将顶层转移到3.7mL的螺旋塞Supelco样品瓶内并在氮气下于40℃进行干燥。然后将残余物溶解到25μl的氯仿中并利用5-15μl的氯仿溶液进行气相色谱分析。对通过水解从LPA中释放由来的脂肪酸进行GC分析
利用Hewlett-Packard Model 5710A气相色谱仪(装备熔融硅胶柱(25m×0.2mm)，在来自Supelco Inc.的100/200ChromosorbWAW上，包被3％SP-2310，2％SP-2300)来测定每一样品中的每种脂肪酸的量。以下列出了气相色谱的条件：炉的起始温度为185℃；2分钟以后，温度以2℃/分钟的速度升高到230℃，并且保持4分钟；注射器的温度为200℃；检测器的温度为300℃；氮气是载气，在50PSI下的流速为30ml/分钟；空气在24PSI下的流速为240ml/分钟；氢气在15Psi下的流速为30ml/分钟。利用火焰离子检测器来检测脂肪酸甲酯。利用从Nu Check Prep.Inc.，Elysian，MN获得的两种脂肪酸甲酯标准混合物得到两条标准曲线。这两种标准混合物包括棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯、花生四烯酸甲酯和山嵛酸甲酯的不同组合。保留时间：对于棕榈酸甲酯为3.8分钟；对于硬脂酸甲酯为6.7分钟；对于油酸甲酯为7.3分钟；对于亚油酸甲酯为8.3分钟；对于花生四烯酸甲酯为14.0分钟；对于山嵛酸甲酯(内标)为15.3分钟。
计算每一样品中的每种脂肪酸的浓度并使其相加，从而获得每一血浆样品中的总LPA浓度。表1列出了每一LPA样本的浓度(μM)和每一样品中的总LPA浓度(μM)。
每一女性受检者还接受一种或多种常规诊断措施，以确定她是健康的还是具有活动性疾病。这些诊断措施(适当时)包括临床检查、临床化学以及所检测的任何包块的外科评估。在这些常规诊断措施的基础上，病人被诊断为健康或具有表1所列的那些疾病中的一种活动性形式。
                                     表1
                     实施例的受检者血浆中的LPA水平(μM)
诊断 LPA(P) LPA(S) LPA(O) LPA(L) LPA(A) LPA(D) TOTAL(总)LPA
 1.卵巢癌I期
 #1 9.97  12.84  4.39  2.83  2.29  B.D. 32.32
 #2 10.78  10.28  1.84  B.D.  B.D.  B.D. 22.9
 #3 1.39  0.40  0.87  2.01  B.D.  B.D. 4.67
 2.卵巢癌II期
 #1 0.78  2.17  0.68  0.98  0.41  B.D. 5.02
 3.卵巢癌III期
 #1 8.87  9.15  3.98  4.17  3.32  B.D. 29.49
 #2 7.90  6.97  3.46  8.97  6.45  B.D. 33.75
 #3 9.59  6.96  1.59  1.64  2.56  B.D 22.34
 #4 11.09  7.62  5.72  11.78  6.85  B.D. 43.06
 #5 5.64  4.14  B.D.  B.D.  B.D.  B.D. 9.78
 #6 3.10  4.62  1.58  3.18  1.59  B.D. 14.07
 #7 2.13  1.80  0.39  0.91  B.D.  B.D. 5.23
 #8 0.81  1.56  0.77  B.D.  B.D.  B.D. 3.14
 #9 3.30  6.22  2.28  5.40  5.17  B.D. 22.37
 #10 2.37  4.33  1.56  0.77  0.92  B.D. 9.95
 #11 5.34  8.32  2.68  1.85  2.39  B.D. 20.58
 #12 8.97  10.23  11.39  13.50  8.96  3.12 56.17
诊断 LPA(P) LPA(S) LPA(O) LPA(L) LPA(A) LPA(D) TOTAL(总)LPA
#13  1.08  0.89  0.31  0.25  B.D.  B.D. 2.53
#14  B.D.  1.82  0.43  2.42  2.42  B.D. 5.84
4.卵巢癌IV期
#1  3.61  4.91  2.09  1.16  B.D.  B.D. 11.77
5.腹膜癌
#1  14.22  9.93  3.08  3.79  1.94  B.D. 32.96
#2  3.19  6.29  0.68  6.25  B.D.  B.D. 16.41
#3  2.65  2.29  0.13  B.D.  B.D.  B.D. 5.07
#4  12.81  11.45  12.50  14.92  9.19  2.34 63.21
#5  0.70  1.17  B.D.  B.D.  B.D.  B.D. 1.87
#6  B.D.  B.D.  B.D.  B.D.  B.D.  B.D. B.D.
#7  3.89  4.01  3.94  4.51  2.84  B.D. 19.19
#8  3.11  3.15  1.72  2.40  1.70  B.D. 12.08
#9  1.16  B.D.  B.D.  B.D.  0.28  B.D. 1.44
6.子宫内膜癌
#1  8.46  9.45  3.55  4.83  2.23  B.D. 28.82
#2  11.01  11.31  2.33  1.03  B.D.  B.D. 25.68
#3  6.84  15.84  12.62  18.88  9.05  B.D. 63.23
#4  7.68  7.27  3.53  5.67  7.24  B.D. 31.39
#5  1.71  1.65  0.59  B.D.  B.D.  B.D. 3.95
#6  6.19  7.65  2.59  5.27  2.89  B.D. 24.59
#7  21.15  5.16  16.41  20.98  B.D.  B.D. 54.56
7.宫颈癌
#1  5.94  5.60  2.99  1.19  2.10  B.D. 17.82
#2  12.45  11.18  6.72  10.44  6.53  B.D. 47.32
#3  0.86  1.14  B.D.  B.D.  B.D.  B D. 2.00
#4  15.29  12.98  8.27  5.68  8.97  B.D. B.D.
诊断 LPA(P) LPA(S) LPA(O) LPA(L) LPA(A) LPA(D) TOTAL(总)LPA
8.健康
#1  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#2  B.D. B.D. 0.42 B.D. B.D. B.D. 0.42
#3  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#4  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#5  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#6  B.D. 1.94 0.21 B.D. B.D. B.D. 2.15
#7  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#8  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#9  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#10  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#11  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#12  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#13  B.D. B.D. 0.42 B.D. B.D. B.D. 0.42
#14  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#15  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#16  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#17  0.48 0.69 B.D. B.D. B.D. B.D. 1.17
#19  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#19  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#20  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#21  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#22  4.93 B.D. B.D. D.D. B.D. B.D. 4.93
#23  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
9.良性GYN病
#1  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#2  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#3  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
10.肉瘤
#1  B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
诊断 LPA(P) LPA(S) LPA(O) LPA(L) LPA(A) LPA(D)   TOTAL(总)LPA
#2   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#3   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#4   B.D. 2.08   0.99   1.43   3.48   B.D.   7.97
11.乳腺癌
#1   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#2   B.D. B.D.   0.42   B.D.   B.D.   B.D.   0.42
#3   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#4   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#5   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#6   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#7   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#8   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#9 B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D. B.D.
#10   B.D. D.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#11   B.D. B.D.   B.D.   D.D.   B.D.   B.D.   B.D.
12.白血病
#1   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#2   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   D.D.   B.D.   B.D.
#3   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
#4   B.D. B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.   B.D.
LPA(P)：棕榈酰-LPA
LPA(S)：硬脂酰-LPA
LPA(O)：油酰-LPA
LPA(L)：亚油酰-LPA
LPA(A)：花生酰-LPA
LPA(D)：二十二碳六烯酰-LPA
B.D.：检测限以下
N.A.：未获得
表II列出了被诊断为有妇科癌症的病人血浆中的每一种LPA的平均浓度±SE和被诊断为没有妇科癌症的病人血浆中的每一种LPA的平均浓度±SE。表III列出了有妇科癌症的病人血浆中的总LPA的平均浓度±SE和没有妇科癌症的病人血浆中的总LPA的平均浓度±SE。利用Wilcoxon Rank Sum统计试验(如W.J.Conover在PracticalNonparametric中所述)来进行统计乘方计算。当LPA水平在检测限以下时，在计算中使用0.1μM。
                                      表II
                来自实施例的受检者血浆中的个体LPA种类的平均浓度
诊断   N   LPA   平均值   SE   SD   中间值   最小值   最大值
健康 23 LPA(P) 0.33 0.21 1.01 0.10 0.10 4.93
  LPA(S)   0.21   0.08   0.40   0.10   0.10   1.94
  LPA(O)   0.10   0.00   0.02   0.10   0.10   0.21
  LPA(L)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(A)   0.10   0.00   000   0.10   0.10   0.10
  LPA(D)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
卵巢癌   19   LPA(P)   5.10   0.88   3.85   3.61   0.10   11.09
  LPA(S)   5.54   0.83   3.61   4.91   0.40   12.84
  LPA(O)   2.43   0.61   2.66   1.59   0.10   11.39
  LPA(L)   3.27   0.91   3.96   1.85   0.10   13.50
  LPA(A)   2.32   0.62   2.70   1.59   0.10   8.96
  LPA(D)   0.26   0.16   0.69   0.10   0.10   3.12
腹膜癌   9   LPA(P)   4.65   1.73   5.19   3.11   0.10   14.22
  LPA(S)   4.28   1.38   4.14   3.15   0.10   11.45
  LPA(O)   2.48   1.34   4.02   0.68   0.10   12.50
  LPA(L)   3.59   1.61   4.83   2.40   0.10   14.92
  LPA(A)   1.82   0.98   2.95   0.28   0.10   9.19
  LPA(D)   0.35   0.25   0.75   0.10   0.10   2.34
子宫内膜癌   7   LPA(P)   9.01   2.29   6.05   7.68   1.71   21.15
  LPA(S)   8.33   1.71   4.52   7.65   1.65   15.84
  LPA(O)   5.99   2.27   6.02   3.53   0.59   16.41
  LPA(L)   8.11   3.16   8.37   5.27   0.10   20.98
诊断   N   LPA   平均值   SE   SD   中间值   最小值   最大值
  LPA(A)   3.10   1.38   3.66   2.23   0.10   9.05
  LPA(D)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
宫颈癌   4   LPA(P)   8.64   3.25   6.50   9.20   0.86   15.29
  LPA(S)   7.73   2.70   5.40   8.39   1.14   12.98
  LPA(O)   4.52   1.84   3.69   4.86   0.10   8.27
  LPA(L)   4.35   2.36   4.72   3.44   0.10   10.44
  LPA(A)   4.43   2.02   4.05   4.32   0.10   8.97
  LPA(D)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
良性妇科病   3   LPA(P)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(S)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(O)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(L)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(A)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(D)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
肉瘤   4   LPA(P)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(S)   0.60   0.50   0.99   0.10   0.10   2.08
LPA(O) 0.32 0.22 0.45 0.10 0.10 0.99
  LPA(L)   0.43   0.33   0.67   0.10   0.10   1.43
  LPA(A)   0.95   0.85   1.69   0.10   0.10   3.48
  LPA(D)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
乳腺癌   11   LPA(P)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(S)   0.10   0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
  LPA(O)   0.18   0.03   0.10   0.10   0.10   0.43
诊断 N  LPA 平均值  SE  SD  中间值  最小值  最大值
 LPA(L) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  010
 LPA(A) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
白血病 4  LPA(P) 0.10  0.00  0.00  010  0.10  010
 LPA(S) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(O) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(L) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(A) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
 LPA(D) 0.10  0.00  0.00  0.10  0.10  0.10
LPA(P)：棕榈酰-LPA
LPA(S)：硬脂酰-LPA
LPA(O)：油酰-LPA
LPA(L)：亚油酰-LPA
LPA(A)：花生酰-LPA
LPA(D)：二十二碳六烯酰-LPA
B.D.：检测限以F
N.A.：未获得
                                 表III
                    病人血浆中的总LPA(μM)的平均浓度
诊断 N 平均值  SE   SD   中间值   最小值   最大值
健康 23 0.45  0.23   1.09   0.10   0.10   4.93
卵巢癌 19 18.68  3.43   14.97   14.07   2.53   56.17
腹膜癌 9 1693 6.79 20.37 12.08 0.10 63.21
子宫内膜癌 7 33.17  7.51   19.86   3.95   63.23
宫颈癌 4 29.58  11.83   23.67   32.57   2.00   51.19
良性妇科病 3 0.10  0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
肉瘤 4 4.83  1.05   5.04   3.62   0.10   19.92
乳腺癌 11 0.13  0.03   0.10   0.10   0.10   0.43
白血病 4 0.10  0.00   0.00   0.10   0.10   0.10
LPA(P)：棕榈酰-LPA
LPA(S)：硬脂酰-LPA
LPA(O)：油酰-LPA
LPA(L)：亚油酰-LPA
LPA(A)：花生酰-LPA
LPA(D)：二十二碳六烯酰-LPA
B.D.：检测限以下
N.A.：未获得
如表I所示，在I期、II期、III期或IV期卵巢癌的每一病人体内发现了检测水平的总LPA。于是，每一个诊断为有早期卵巢癌或晚期卵巢癌的病人血浆中都具有检测水平的LPA。在任何卵巢癌病人中都没有观察到假阴性。I期和II期卵巢癌受检者的总LPA浓度在4.67-32.32μM的范围内。III期和IV期卵巢癌受检者的总LPA浓度在2.53-56.17μM的范围内。而且，在所有卵巢癌病人体内发现了检测水平的硬脂酰-LPA，而在19位卵巢癌病人中的18人体内发现了检测水平的LPA种类棕榈酰-LPA和油酰-LPA。
相反，23位健康受检者中的19人的血浆中没有检测水平的LPA。其余的4个健康病人的血浆中具有低浓度的LPA(0.42-4.93μM)。不知道这些值是否代表假阳性或这些个体是否具有用于诊断病人的其它常规方法没有检测出来的妇科癌症。而且，被诊断为卵巢癌的病人血浆中的总LPA和每一种LPA的平均浓度都显著高于健康病人血浆中的总LPA和每一种LPA的平均浓度。这些结果表明，本发明的方法是非常灵敏的并因此可用于鉴定那些具有卵巢癌这种妇科癌症的病人(包括那些卵巢癌还处于发展的早期阶段的病人)。这些结果还提示，检测病人血浆中的棕榈酰-LPA或硬脂酰-LPA或油酰-LPA或其组合的存在的方法也可用于检测卵巢癌。
还可在被诊断为宫颈癌和子宫内膜癌的每位受检者中的血浆中以及在被诊断为腹膜癌的9位病人中的8人血浆中检测到LPA。在其血浆中没有检测水平的LPA的一个病人体内已经全部去除了腹膜癌。该结果暗示，在通过外科手术完全去除癌症的病人血浆中不存在LPA。因此，本发明的方法可用于对已经做过癌症切除手术的病人进行妇科癌症复发的监测。有宫颈癌和子宫癌的受检者血浆中的LPA浓度在2.00-63.23μM的范围内。
相反，在被诊断为具有妇科癌之外的癌症(即乳腺癌、白血病和子宫肉瘤)的17位病人中的15人体内不存在检测水平的LPA。而且，在具有子宫肌瘤，一种良性妇科疾病的任何受检者内不存在检测水平的的LPA。由于来自患有妇科肉瘤(由结缔组织衍生)的4位病人中的3人和良性子宫肌瘤病人的血浆都不具有检测水平的总LPA，因此相信，相应妇科器官的恶性上皮细胞是患有卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌和腹膜癌的病人血浆中的LPA的来源。
本发明的方法由于具有灵敏简便和低成本的优点，因此可用于对病人进行妇科癌症的筛查。因为用于本发明方法和用于CA125的血液样本都可以同时从病人身上抽取，所以利用本发明的方法对病人进行妇科癌症筛查时也可进行CA125测试。或者可以单独使用本发明的方法检测妇科癌症。
因为在有良性妇科疾病的病人血浆中不存在LPA，所以本发明的方法还可用于区分具有妇科包块的病人患的是良性妇科疾病还是恶性妇科疾病。利用该方法来区分恶性和良性卵巢包块，应该可以减少需要接受更昂贵技术(例如经阴道的超声检查)或更大创伤性技术(例如目前用来诊断卵巢肿瘤恶性的肿瘤活组织检查或肿瘤抽吸术)的病人数。
实施例2从病人和健康对照组中收集样品
在1998年2月-1998年4月之间从克利夫兰临床基金会的妇科与产科中看到的9位病人体内收集样品。从8位卵巢癌病人(平均年龄65.0岁；范围在44-72岁之间)、1位子宫内膜癌病人(年龄为44岁)和10位健康对照(平均年龄45.5岁，范围在28-48岁之间)获得全血样本。征得了所有参加者的同意。
当抽血样时所有癌症病人都已经被诊断为患有癌症。根据妇科与产科联合会(FIGO)的标准来确定临床分期并根据WHO的分类来评估组织学亚型(参见以下的表IV)。为了抑制血小板活化和磷脂酶活性，将样品收集到含有EDTA的管中。在2,500g使全血离心15分钟。血浆既可立即处理也可在脂质提取之前贮藏在-80℃下。表IV表IV：临床数据受检者              健康状况#         年龄1         41        健康2         37        健康3         45        健康4         46        健康5         32        健康6         48        健康7         28        健康8         47        健康9         45        子宫肌瘤10        44        子宫肌瘤
                期        级    亚型            CA12511        55        IIC       2     子宫内膜样的    3712        67        IV        3     浆液性的        20113        64        III       3     子宫内膜样的    128414        46        III       3     浆液性的        4615        66        IIIC      3     浆液性的        109116        66        IV        3     浆液性的        90917        72        III       3     浆液性的        1118        61        III       3     浆液性的        44719        44        III受检者#11-18是卵巢癌病人，受检者#19是子宫内膜癌病人。试剂和标准品
LPA和其它溶血磷脂除了16：0-LPI之外，都从Avanti PolarLipids(Birmingham，AL)购买。LPI制剂(从大豆中提取并含有62％的16：0-LPI；cat.#L-7635，1ot#46H8390)来自于Sigma(St.Louis，MO)。从EM Science(Gibbstown，NJ)获得预先包被的硅胶60TLC板。从Sigma(St.Louis，MO)或Fish3er Scientific Co.(Pittsburgh，PA)购得HPLC梯度甲醇(MeOH)、氯仿、氢氧化铵(AmOH)、盐酸(HCl)。
LPA-17：0从Abanti购得(氯仿形式)。将已知量的脂质以已知量进行等分，并在40℃于氮气下蒸发氯仿。将脂质重新悬浮到甲醇中并在脂质提取之前将500皮摩尔加入到每一样品中。LPAs-16：0、18：0和18：1以及LPI(18：0)从Avanti获得并且在甲醇中制备标准溶液。为了得到标准曲线，不同量(5-300皮摩尔)的标准LPAs或18：0-LPI与相同量(50皮摩尔)的内标LPA-17：0混合。样品的制备
在4℃下使血样以2,500g离心15分钟。将血浆转移到硅烷化微量离心管中并在-80℃下冷冻或者立即使用。所有的提取过程都是在15ml的一次性玻璃离心管(Supelco/Sigma，St.Louis，MO)中实施的。对于每个1ml的血样，加入0.2ml的6N HCl和4ml的甲醇/氯仿(2∶1)。将样品涡流1分钟并在冰上孵化10分钟。然后加入1ml的氯仿和1.25ml的H2O，以便分离这些相。将样品涡流0.5分钟并在冰上孵化0.5分钟。离心(2000g，10分钟)之后，将下层相转移到一个新玻璃管内并在React-Therm(Pierce，Rockford，IL)中于40℃在氮气下蒸发溶剂。将干燥的脂质重现悬浮到50μl的溶剂(甲醇∶氯仿2∶1)中，然后涡流并加到TLC板上。
利用溶剂系统(氯仿∶甲醇∶AMOH＝65∶35∶5.5)预先展开硅胶60TLC板，以便除去污染物，然后进行干燥。将样品作为一个区带加到TLC板上并在相同的溶剂系统内展开。每一TLC板有两个标记：总是应用标准的油酰-LPA(18：1)来帮助鉴定“LPA带”。 “LPA带”中的脂质用2ml的甲醇∶氯仿(2∶1)洗脱两次，然后于40℃在氮气下进行干燥并重现悬浮到100μl的100％甲醇中。该样品直接用于ESI-MS(每次注射20μl)。验证
进行ESI-MS和ESI-串联MS(MS-MS)来证实感兴趣的离子峰的结构和鉴定特征。利用从商业上得到的标准品开发定量方法。由于在血样中在423m/z范围内缺乏离子样本和17：0-LPA不是天然生成的LPA种类，所以选择内标17：0-LPA。ESI-MS的条件
在配备有ESI源的Micromass Quattro II Triple QuadrupoleMass Spectrometer(Micromass Inc.Beverley，MA)上进行ESI-MS和串联质谱法(MS/MS)。通过125μm的PEEK管利用具有注射阀(20μL的注射环)的LC系统(HP1100)将样品传送到ESI源内。所有试验中所用的流动相是MeOH∶H2O(1∶1；v∶v)，流速是50μL/分钟。
仪器设置如下：用10L/小时的氮气雾化流使离子喷射界面保持在70℃。ESI干燥气体(N2)是250L/小时。对于具有阴性或阳性检测的产物(79)或(184)扫描模式，氩气(作为碰撞气体)在10×10-6帕或1×10-5帕的压力下；离子喷射电压为-3,500V或3,500V；反电极电势为-500V或500V；样品锥形电势为-50V或20V；碰撞能量为70或50eV；分液器电压为-1.0或2.0V。具有阴离子检测的产物(79)扫描模式用于所有的标准品和样品分析。
血浆样品的“LPA带”中的LPA和其它相关lyso-PLs的检测
在m/z400-7000的范围内检测离子种类。该范围包括溶血磷脂的所有主要种类，但不包括“LPA带”中缺乏的2-或3-plysphate-1PIs(＞700)。
图1显示卵巢或腹膜癌病人(图1A)或健康对照组(图1B)的代表性质谱。这些主要离子及其鉴定特征是409(16：0-LPA)、433-437(18：2，18：1和18：0-LPAs)、457、481-482、571(16：0-LPI)、599(18：0-LPI)和619(20：4-LPI)。卵巢或腹膜癌病人与健康对照组相比，具有较高水平的LPA和LPI。
通过以下三个步骤实现这些离子种类的鉴定：i)离子种类的m/z；ii)偶磷基(Phosphorocyl group)的存在(在产物(79)扫描模式中检测的)；以及iii)以阴性检测模式对这些种类的子离子进行MS-MS分析。对于16：0-LPA，主要产物是磷酰基PO3-离子(在m/z790处)、PO4H2-离子(在m/z97处)、甘油磷酰基C3H6O2PO3-离子(在m/z153处)、O-甘油磷酰基C3H6O3PO4H2-离子(在m/z171处)、棕榈酸(C16H31O2-，在m/z255处)(图5A)。LPI(18：0)主要显示出PO3-、PO4H2-、甘油磷酸盐C3H6O2PO3-、磷酸肌醇C6H10O6PO2-离子(在m/z241处)和硬脂酸(C18H35O2-，在m/z283处)离子。LPS主要显示出PO3、PH4H2-、甘油磷酸盐C3H6O2PO3-、O-甘油磷酰基C3H6O2PO4H2-、油酸(C18H33O2-，在m/z281处)和18：1-LPA(缺少丝氨酸，在m/z435处)。在435、437、571和619处的离子种类还显示出预期的子离子。
测试同时检测血样中的LPAs和LPIs的最佳离子化条件。虽然0.5mM的NH4OH不影响LPAs的离子化效率，但是其稍稍降低LPI的离子化效率。加入5mM的醋酸铵可将LPAs的离子化效率减小到大约40％，但是却将LPI的离子化效率增大到大约30％。为了平衡LPAs和LPIs的同时检测效率，我们选择使用MeOH，而无需任何添加剂。
我们检查一系列血浆样品稀释液(0.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8和1ml)中的LPAs和LPIs的水平并发现，LPAs和LPIs的检测水平在该范围内呈线性，因此在我们的后续研究中使用0.5ml的血浆样品。血样中的LPAs和LPIs的定量分析
为了实施LPA和LPI水平的定量分析，我们用不同量(5-300皮摩尔)的标准14：0-LPA、16：0-LPA、18：0-LPA、18：1-LPA、16：0-LPI(Sigma)以及18：0-LPI的组合相对于固定量(50皮摩尔)的内标17：0-LPA(Avanti)的若干比例建立标准曲线。由色谱法获得每一离子种类的面积。为了确定不同的LPI种类是否具有不同的离子化效率，我们使用从大豆中分离出来的天然LPI，正如由Sigma利用基于GC分析法(cat.#L-7635，1ot#46H8390)所分析的，该物质含有62％的16：0-LPI。在所测试的浓度范围内所有的LPAs和LPIs都展示出线性曲线。不同LPA种类的标准曲线的斜率是不同的。令人惊奇的是，我们发现具有较长脂肪酸侧链的LPA与具有较短脂肪酸侧链的LPA相比，具有较高的离子化效率。这由其较高的斜率反映出。18：0-LPA和18：1-LPA的斜率非常相似，这提示，双键不会显著影响离子化效率。描绘14：0-LPA、16：0-LPA和18：0-LPA斜率相对于其侧链长度的曲线图，可获得一个线性关系。通过延伸该曲线，我们得到20：4-LPA(2.12)和22：6-LPA(2.50)的理论斜率。在图9所示的总LPA水平的计算中用到这些值。另外，18：1-LPA的斜率(1.73)被用于18：2-LPA的计算。在LPI系列中可观察到类似的趋势。因此，可推导出20：4-LPI的理论斜率(1.21)并用于计算。
我们将所建立的方法应用到9位患卵巢癌(8)或腹膜癌(1)的病人以及8位健康女性对照者和两位患良性妇科疾病(子宫肌瘤)妇女的血浆样品分析中。图2示出了来自这些受检者的总血浆LPA、LPI和LPA+LPI水平。病人组清楚地显示出具有较高水平的LPA和LPI，并且与单独的LPA或LPI相比，总的LPA和LPI水平在病人与对照组之间明显分离得较好。
虽然已经就许多优选实施方案对本发明进行了描述，并且这些优选实施方案是迄今发明人所知的完成本发明的最好方式，但是应该理解，本领域内的普通技术人员所显而易见的不同变型和改进都不脱离本文所附的权利要求书所限定的本发明的范围。

Claims (10)

1.一种诊断受检者中卵巢癌的方法，该方法包括：分析来自受检者的体液中溶血磷脂酰肌醇的存在；其中所述体液中溶血磷脂肌醇的存在指示所述受检者患有卵巢癌。
2.权利要求1的方法，其中所述体液是血液。
3.权利要求1的方法，其中所述体液是血浆。
4.权利要求1的方法，其中所述体液是腹水。
5.权利要求1的方法，进一步包括这样一个步骤：测定所述体液中溶血磷脂酰肌醇的水平以便提供一个测定值，并将该测定值与标准值进行比较，其中超过标准值的测定值指示患有卵巢癌。
6.权利要求1的方法，进一步包括这样一个步骤：测定所述体液中溶血磷脂酸的水平以便提供一个综合测定值，其中该综合测定值是基于所述体液中溶血磷脂酸的水平和溶血磷脂酰肌醇的水平；以及将该综合测定值与综合标准值进行比较，其中超过综合标准值的综合测定值指示患有卵巢癌。
7.权利要求6的方法，其中所述体液是血液。
8.权利要求6的方法，其中所述体液是血浆。
9.权利要求6的方法，其中所述体液是腹水。
10.权利要求6的方法，进一步包括这样一个步骤：测定所述体液中溶血磷脂酰肌醇和溶血磷脂酸的水平，以便提供一个测定值并将该测定值与标准值进行比较，其中超过标准值的测定值指示患有卵巢癌。
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