CN1421528A - 一种提高黄芪毛状根中黄芪多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属基因工程技术领域。本发明提供了一种提高黄芪毛状根中黄芪多糖的方法。应用本发明的方法能够增加黄芪多糖含量，有利于工业化生产，解决品质退化问题。

Description

一种提高黄芪毛状根中黄芪多糖的方法

技术领域

本发明属基因工程技术领域。具体涉及一种提高黄芪毛状根中黄芪多糖的方法。

背景技术

黄芪(Astragalus membranaceus(Fisch.)Bunge)是我国重要的中药材品种之一，其药用部位为根，具有补益固表、利尿排毒、生肌敛疮、利水消肿作用，是许多中药复方、成药和保健品的主要成分。随着人们日益增长的保健观念的强化，黄芪的需求量逐年增加。但黄芪的野生资源逐年减少，是我国的二级野生资源保护品种；栽培品种品质下降；面临农药污染及重金属残留问题的困扰等等一系列问题给临床的加工、出口带来一定的困难。因而应用生物技术方法提高黄芪的产量，改善其品质，探索工业化生产的可行途径对黄芪的生产具有重要的意义。黄芪多糖是黄芪的主要有效成分之一，现代药理学研究表明，它具有增强免疫力、改善心肌功能和延缓衰老的作用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于改进培养方法，提高黄芪毛状根中黄芪多糖含量。

本发明提供了一种提高黄芪毛状根中黄芪多糖的方法，该方法是通过基因工程方法发根农杆菌介导，将在强启动子和强终止子调控下的葡萄糖苷转移酶(又称ADP、UDP，葡萄糖苷转移酶)基因导入黄芪毛状根中。

PCR和Southern杂交表明此基因已经整合到毛状根基因组中并且以单拷贝的形式存在。转基因毛状根的生长量及葡萄糖苷转移酶酶活性均比对照显著提高，并且多糖产量亦得到显著提高(高于对照68.8％，其中最高幅度为127％)。

表1  转葡萄糖苷转移酶基因黄芪毛状根生长量、多糖含量、葡萄糖苷转移酶活性与多糖产量和对照组比较表组别        干重          多糖含量      GBSS活性        多糖产量

        (g)           (mg/g毛状根)  (U)             (mg)对照        1.08±0.22    19.38±0.92   1.60±0.04      20.87±3.16转基因毛状根1.66±0.18^** 21.29±4.38   37.01±16.20^** 35.22±7.06^**

注：对照为普通毛状根，即用发根农杆菌直接诱导未携带外源基因的毛状根

另附：PCR鉴定图和液体培养的转基因黄芪毛状根生长图

通过转基因(葡萄糖苷转移酶)方法可以显著提高黄芪毛状根中有效成分黄芪多糖的含量，从而为工业化生产提供了高产的原材料。

以发根农杆菌诱导生成的黄芪毛状根具有生长迅速、遗传稳定、易于扩大培养等优点，如果能够增加其中黄芪多糖的含量，将有利于工业化生产，解决品质退化问题。本技术应用基因工程方法，显著提高了黄芪毛状根中的黄芪多糖的含量。

附图说明

图1 转基因黄芪毛状根PCR鉴定结果

图中表明7株转基因黄芪毛状根中均扩增出2.0kb片段，而对照c，黄芪幼苗s中均无此片段

图2 250ml液体培养的转基因黄芪毛状根和对照生长图

左边为对照，右边为转基因毛状根

具体实施方式

实施例1

总RNA的提取(一步法)

反应试剂的配制：变性液(26mM柠檬酸钠pH4.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠，0.125M 2-巯基乙醇，4M异硫氰酸胍)；NaAc(2M，pH4.7)；酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)；70％乙醇。取1g新鲜植物组织置于陶瓷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉末，转移至含有12ml变性液的50ml离心管中混匀；加入1.2ml 2M NaAc(pH4.0)，反复颠倒混匀；再加入12ml酚∶氯仿∶异戊醇，混匀，冰浴15min；4℃，12000rpm，离心20min；上清转移至50ml离心管中，加等体积异丙醇，混匀后-20℃置30min；4℃，12000rpm，离心10min沉淀RNA；弃上清液，将RNA溶于5ml变性液中，65℃加热尽快溶解；加入等体积酚∶氯仿∶异戊醇，混合溶液重新抽提1次，即重复前步骤；离心后，弃上清液，加75％预冷乙醇10ml，漂洗沉淀，离心同上，弃上清；空气干燥后，加200ml去离子水溶解RNA，分光光度法和凝胶电泳检测浓度和纯度，余下部分-20℃保存备用。

实施例2

cDNA的合成

操作程序：

I.按照下表配制反应混合液

反应液                                  反应量

cDNA合成缓冲液^*                        4ul

dNTP(10mM)                              2ul

Olig(dT)(12.5uM)                        1ul

mRNA                                    0.2-2ug

AMV(20U/ul)                             1ul

ddH2O                                   --

Total                                   20ul

^*cDNA合成缓冲液(250mM Tris-HCl，40mM MgCl₂，150mMKCl，5mM DTT，pH8.5)

II.混匀后，55℃保温60min，65℃保温10min，灭活AMV，瞬间离心，将溶液集于离心管底部。

实施例3

一步法提取膜荚黄芪(Astragalus membranaceus Bge.)中的总RNA，经逆转录为cDNA第一链，用PCR方法克隆淀粉粒结合淀粉合成酶(葡萄糖苷转移酶，又称ADP(UGP)葡萄糖苷转移酶)表达框序列，使用引物序列如下：正向引物P1：5’-CCTCTAGATGTTGCTCCTTACTGCTCTCT C-3’，逆向引物P2：5’-CCGAGCTCTGTG GGCTACAAAATCCTTCTG-3’。PCR循环条件如下：94℃预变性5min；然后94℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸1.5min，共30个循环；最后72℃延伸7min结束反应。扩增出的片段约2.0kb，经0.8％凝胶电泳纯化后测序鉴定序列的正确性。然后载入载体质粒pBI121获得质粒pBI-葡萄糖苷转移酶，并转入大肠杆菌DH5α。重组后的葡萄糖苷转移酶基因获得强启动子CaMV和强终止子NOS-ter。

实施例4

将含质粒pBI-葡萄糖苷转移酶的大肠杆菌和大肠杆菌pRK2013及发根农杆菌LBA9402进行共培养(三亲杂交)筛选抗性农杆菌诱导黄芪幼苗，获得转基因黄芪毛状根。同时，用未转基因的农杆菌直接诱导黄芪幼苗，获得的毛状根作为对照。

实施例5

三亲杂交法

LBA9402、pRK2013和pBI-葡萄糖苷转移酶三种细菌分别在YMB(Rif)、LB、LB(Kan)培养基上培养，挑单菌落分别用相应的液体培养基振荡培养12小时，将其稀释至浓度相近，混合后滴于无菌滤片上，然后在YMB培养平板上培养18小时。用1mM MgSO4冲洗滤片，洗液在YMB(Rif，Kan)平板上涂布。三天后可见到菌落出现。挑单菌落进行分子鉴定。

实施例6

YMB培养基组成(g/L)

甘露醇           10

酵母提取物       0.4

NaCl             0.1

MgSO₄7H₂O     0.2

K₂HPO₄        0.5

调pH至7.2后高压灭菌

实施例7

LB培养基组成(g/L)

胰化蛋白胨       10

酵母提取物       5

NaCl             10

调pH至7.0后高压灭菌

实施例8

黄芪毛状根的继代培养

按照胡之璧等提供的方法诱导和培养膜荚黄芪毛状根，在250ml的三角瓶中加入100ml MS培养基，接种0.1g(鲜重)，25℃黑暗条件下摇床(80rpm)培养，共培养35天。

实施例9

生长量的测定

每5天取样一次，每次取样5瓶，冷冻干燥后称重，以干重表示毛状根的生长量。

实施例10

将不同株系的毛状根分别在MS液体培养基中扩大培养，选用的培养基参照标准配方，但其中的硝酸铵成分因为抑制毛状根的生长，因而用1％水解酪蛋白代替作为氮源。去除了其中的激素成分，采用3％的蔗糖作为碳源。暗培养14天后，分别测定生长量、多糖含量和葡萄糖苷转移酶酶活性。其中，以干重作为生长量指标；多糖的提取和测定参见Shan等；葡萄糖苷转移酶酶活性的测定参见Fujita等提供的方法。

实施例11

MS培养基组成(mg/L)

大量元素

KNO₃          1900

CaCl₂·2H₂0  440

MgSO₄·7H₂O  370

KH₂PO₄       170

微量元素

KI              0.83

H₃BO₃          6.2

MnSO₄.4H₂O     22.3

ZnSO₄.7H₂O     8.6

Na₂MoO₄.2H₂O  0.25

CuSO₄·5H₂O    0.025

CoCl₂·6H₂O    0.025

Fe盐

Na₂EDTA.2H₂O   37.3

FeSO₄.7H₂O     27.8

有机元素

肌醇              100

烟酸              0.5

盐酸吡哆醇        0.5

盐酸硫酸胺素      0.4

甘氨酸            2.0

实施例12

总DNA的提取

采用CTAB方法，取材料0.5g置于陶瓷研钵中，加入液氮快速研磨至细粉末状，加入500μl 2×CTAB(2％CTAB，0.1M Tris-HCl pH8.0，0.02M EDTA，1.4M NaCl，2％β-Mercaptoethanol)提取缓冲液，混匀，60℃水浴30min后，加500μl水饱和苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)反复混匀，10000rpm离心10min。吸取上清液至一新的Eppendorf管中，加入1/10体积的3M NaAc和等体积的异丙醇，混匀后于-20℃静置20min，10000rpm离心10min沉淀DNA，弃上清液，沉淀依次用70％乙醇和无水乙醇漂洗，自然干燥后溶于含RNase的ddH₂O中，分光光度法和凝胶电泳检测浓度和纯度，将每管DNA浓度调至50-100ng/μl，4℃保存备用。

实施例13

葡萄糖苷转移酶的提取

取5g毛状根材料，加1ml提取缓冲液(pH6.8，55mM Tris-HCl，2.3％SDS，5％2-mercaptoethanol，10％甘油)，冰上研磨，匀浆液过滤，混悬液13000g离心1min。沉淀经提取液洗涤3次后，重蒸水洗涤2次。再用丙酮洗涤2次，然后减压蒸干，保存于-20℃待用。

实施例14

葡萄糖苷转移酶活性测定

取提取的葡萄糖苷转移酶0.2-3mg，加入200μl反应缓冲液(100mM甘氨酰-NaOH，pH8.5，100mM KCl，2.5mM MgCl2，0.5mMEDTA，1mM ADP-葡萄糖)，混匀后35℃保温30min，4℃离心5min终止反应。取150μl，在以下缓冲液中反应，100mM甘氨酰-NaOH(pH8.5)，100mM KCl，2.5mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.2mM磷酸烯醇丙酮酸，0.1mM NADH，11.5IU丙酮酸激酶，2.5IU乳酸脱氢酶(总体积1ml)。加入乳酸脱氢酶后即开始测定340nm的光吸收的下降量。

实施例15

多糖的提取

取毛状根1g，加35ml水浸泡2小时，水煮3次，每次0.5小时。水煎液过滤，滤液定容至90ml，取50ml于半透膜袋中透析过夜。

实施例16

多糖含量测定

取多糖液2ml，然后分别加80％苯酚50ul，95％的浓硫酸5ml，反应2hr后测定485nm处光吸收。标准曲线按照如下方法绘制：配制100ug/ml的葡萄糖标准液，按照下表配制反应的标准液，然后分别加80％苯酚50ul，95％的浓硫酸5ml，反应2hr后测定487nm处光吸收，以此表为标准绘制标准曲线。标号        0    1    2    3    4    5    6    7    8    9    10葡萄糖(ml)  0.0  0.2  0.4  0.6  0.8  1.0  1.2  1.4  1.6  1.8  2.0水(ml)      2.0  1.8  1.6  1.4  1.2  1.0  0.8  0.6  0.4  0.2  0.0

Claims (1)

1.一种提高黄芪毛状根中黄芪多糖的方法，其特征在于该方法是通过基因工程方法发根农杆菌介导，将在强启动子和强终止子调控下的葡萄糖苷转移酶基因导入黄芪毛状根中。

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