CN1417336A

CN1417336A - 诸葛菜odreb2b基因在培育耐旱植物中的应用

Info

Publication number: CN1417336A
Application number: CN 02153275
Authority: CN
Inventors: 林忠平; 孙超; 倪挺; 胡鸢雷
Original assignee: 林忠平
Priority date: 2002-11-26
Filing date: 2002-11-26
Publication date: 2003-05-14

Abstract

本发明克隆了诸葛菜(Orychophragmusviolaceus，又称二月兰)的一个978bp的干旱相关转录因子的编码基因(ODREB2B)全序列。该基因编码产物为新的干旱诱导的DREB类转录因子，具有AP2 DNA结合区，能与一些干旱相关下游基因的启动子区域的干旱反应元件相结合，从而调控耐旱、耐寒相关基因的转录，是植物耐旱机制的上游开关。该基因与拟南芥中DREB2B基因的核酸序列相似性为69％，氨基酸序列相似性为46％。我们构建了该基因的植物表达载体，并将此耐旱基因导入各类植物中，以提高植物的耐旱耐寒性。

Description

诸葛菜ODREB2B基因在培育耐旱植物中的应用

本发明克隆了诸葛菜(Orychophragmus violaceus，又称二月兰)的一个978bp的干旱相关转录因子的编码基因(ODREB2B)全序列。该基因编码产物为新的干旱诱导的DREB类转录因子，具有AP2 DNA结合区，能与一些干旱相关下游基因的启动子区域的干旱反应元件相结合，从而调控耐旱、耐寒相关基因的转录，是植物耐旱机制的上游开关。该基因与拟南芥中DREB2B基因的核酸序列相似性为69％，氨基酸序列相似性为46％。我们构建了该基因的植物表达载体，并将此耐旱基因导入各类植物中，以提高植物的耐旱耐寒性。

本发明的主要创新之点在于(1)首次从诸葛菜中克隆了DREB2B基因；(2)构建了ODREB2B基因的适合于双子叶和单子叶植物的表达载体，通过基因枪和农杆菌介导的途径使植物表达该基因的编码蛋白，从而提高这些物种的耐旱耐寒性能；(3)利用在单子叶植物中组成型表达的Ubiquitin启动子驱动ODREB2B基因的表达，并且采用Ubiquitin启动子驱动bar基因作为选择标记。

植物在生长过程中受干旱和寒冷的影响很大，在此过程中，一系列的基因被诱导表达。已有许多实验证明在拟南芥中一类被成为DRE(dehydration-responsive element)的顺式作用元件在干旱诱导基因表达过程中起着重要作用。DREB是一类能与DRE顺式作用元件结合的转录因子，该类转录因子的AP2 Domain就是与DRE的结合部位。在拟南芥中这类转录因子共有5种，分别为DREB1A，DREB1B，DREB1C，DREB2A，DREB2B。其中DREB1类转录因子主要受冷诱导，DREB2类转录因子主要受干旱诱导。DRE这类顺式作用元件常在一些干旱和冷诱导表达基因的启动子区域发现，因此DREB这类基因的编码蛋白通过结合在DRE顺式作用元件上启动寒旱相关下游基因的表达，从而使植物表现对干旱和寒冷的抵抗力。

本项发明的技术要点之一是从诸葛菜中克隆ODREB2B基因。从已发表的拟南芥DREB2A和DREB2B基因序列的比较中，我们设计了包括DREB基因起始密码和终止密码的的一对简并引物，分别为P1和P2。利用SDS法提取诸葛菜的基因组DNA，通过PCR扩增得到980bp左右的特异片断，连接到pGEM-Teasy上并进行测序，表明该基因的完整编码区为978bp，编码325个氨基酸。将测序结果与拟南芥中DREB2B基因的序列进行相似性比较，发现诸葛菜中的DREB2B基因与拟南芥中相应基因有69％的同源性，翻译成氨基酸序列后进行相似性比较，两者的相似性亦有46％。将这个新的蛋白序列进行BLAST分析，显示该蛋白的16-169位氨基酸为含有能与DRE顺式作用元件结合的AP2 domain。以上分析说明该基因为诸葛菜中DREB类的新基因，命名为ODREB2B。

本项发明的要点之二是ODEB2B植物表达载体pAHC-ODREB2B的构建。将该基因连接到pGEM-Teasy载体上，并命名为pT-ODREB2B。Not I酶切pT-ODREB2B，回收约1kb的小片段，连接到pGEM-5Z上，得到中间载体p5Z-ODREB2B。将p5Z-ODREB2B用EcoR V和Sac I酶切，回收小片段，同时将pAHC25用Sma I和Sac I酶切，回收大片段，连接小片段和大片段，转化DH5α并进行PCR和酶切鉴定后得到pAHC-ODREB2B。

在本发明的一个实施方案中，我们设计了两条简并引物(P1、P2)，将诸葛菜中DREB2类型基因克隆出来。引物序列如下：P1：5′-GAAG G/AAGATGGC A/T GT T/A TATGA T/A CA-3′P2：5′-CCG N TTCAN CTCGAG N NANAN GAT-3′。

其中N指A、T、G、C四种碱基在同一位置上的简并碱基。

在本发明的一个实施方案中，ODREB2B基因置于单子叶植物组成型表达启动子Ubiquitin启动子的调控之下，得到植物表达载体pAHC-ODREB2B。其构建流程见图一、诸葛菜中ODREB2B基因植物表达载体pAHC-ODREB2B的构建流程图。

在本发明的一个实施方案中，pAHC-ODREB2B质粒大量提取后，用于基因枪转化草坪草等单子叶植物。转化过程包括种子或幼穗诱导愈伤组织、基因枪轰击、抗性愈伤筛选、苗的分化、植株鉴定。种子诱导愈伤的步骤：成熟种子用0.1％升汞消毒后，先接于MS基本培养基上，让其萌动3天，露出小芽时，将胚纵切后转接于诱导愈伤组织培养基上，形成愈伤(约30天左右)后，每次挑选色泽鲜、增殖快、质地硬的愈伤组织继代培养，继代愈伤可供基因枪转化；幼穗诱导愈伤的步骤：取长约0.2～1cm左右的幼穗，用70％乙醇表面消毒后，在超净台内剥出幼穗，接种于诱导诱导培养基上，形成愈伤后，每20天继代培养一次，供基因枪转化；基因枪的转化及苗的分化：质粒：提取的质粒浓度调整为1μg/μL。子弹配制：30mg金粉或钨粉加1mL100％乙醇旋涡洗涤15分钟，无菌水洗3次，加500μL 50％甘油备用。取上述钨或金粉悬液50μL，加5μL DNA，加50μL 2.5M CaCl2，加20μL 0.1M亚精胺，旋涡，冰上静置15分钟，离心数秒，70％乙醇142μL洗一次，离心数秒，100％ 140μL乙醇洗一次，离心数秒，加50μL 100％乙醇，供5枪用。供试基因枪：PDS-1000/He(美国伯乐公司)基因枪可裂膜用1350Psi可裂膜，真空度25InHg，6cm射击距离，每皿射击一枪。枪击前的愈伤组织在含0.4M甘露醇的继代培养基上培养4～8小时，枪击16小时后移入正常继代培养基。枪击后的愈伤组织一周后转至含除草剂2-5mg/L的继代筛选2～4轮，每轮20天。筛选后得到的抗性愈伤组织转入含50g糖的培养基中，光照培养20天，然后转入去掉2，4-D的分化培养基中分化成苗。小苗长至5～10cm大小时，移入蛭石∶松针土为1∶1的土中，塑料袋保温一周后，苗即成活。

此专利涉及的菌种已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，单位地址中国北京中关村，该微生物分类名称为大肠埃希氏菌(Ecoli.)，保藏代号为pT-ODREB2B，保藏编号为CGMCC NO.0839，保藏日期为2002年11月22日。

Claims

1、诸葛菜(Orychophragmus violaceus)中978bp的ODREB2B基因全序列。包括该基因的全部序列及部分序列均在权利要求之内。

2、根据权利要求1。使用此基因构建的植物表达载体，启动子为Ubiquitin、actin、CaMV35S或其它植物启动子，在本专利权利要求之内。

3、根据权利要求1。使用此基因构建的植物表达载体，标记基因为bar、hptII、NPT II等植物常用标记基因，在本专利权利要求之内。

4、根据权利要求1。将此基因作适当突变或偏爱密码子改造后的基因，亦在本专利权利要求之内。

5、根据权利要求1。将此基因通过基因枪或农杆菌介导的遗传转化得到耐旱耐寒植株的方法，亦在本专利权要求之内。