CN1398982A

CN1398982A - 结核菌双相快速培养基及其制备方法

Info

Publication number: CN1398982A
Application number: CN 01114377
Authority: CN
Inventors: 申建维; 袁玮; 李增煌; 余新华; 李娉
Original assignee: Wuhan Iron and Steel Group Corp
Current assignee: Wuhan Iron and Steel Group Corp
Priority date: 2001-07-25
Filing date: 2001-07-25
Publication date: 2003-02-26
Anticipated expiration: 2021-07-25
Also published as: CN1162549C

Abstract

本发明公开了一种结核菌双相培养基及其制备方法，它由平菇液相培养基、平菇固相培养基构成。在平菇固相培养基中加入平菇液相培养基和琼脂粉，高压灭菌，冷却，加入灭活小牛血清，混匀装于细胞培养瓶内，将培养瓶平放，凝固后加入平菇液相培养基，装好后经灭菌试管置冰箱保存。本发明方法易行，操作方便，检测快速，准确可靠，尤其适用于基层医院。

Description

结核菌双相快速培养基及其制备方法

本发明涉及一种结核菌双相快速培养基，还涉及一种培养基的制备方法。

目前我国普遍使用一种被称之为“改良罗氏培养基”的固体结核菌培养基来对结核菌进行体外人工分离培养，其成分为：“天门冬酰胺0.72克、磷酸二氢钾0.96克、枸椽酸镁0.12克、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.048克、中性甘油2.4毫升、水120毫升、马铃薯粉6克、新鲜鸡蛋6-8只、1％孔雀绿水溶液8毫升”；其制法为：“将天门冬酰胺、磷酸二氢钾、枸橼酸镁及甘油加水后，置于沸水浴中加热溶解。再加入马铃薯粉，继续在沸水浴中加热30分钟，时加搅拌，使成均匀糊状。待冷至65℃时，加入新鲜鸡蛋液200毫升及1％孔雀绿8毫升，充分搅匀后用双层纱布过滤，然后分装于大试管中，每管10毫升，用橡皮塞紧，置成长斜面。用85℃、150分钟流动蒸气菌即成”。这些记载在福州部队总医院编、朱忠勇、陈之航主编、上海科学技术出版社1978年4月出版的《临床医学检验》第454页上。由于现有的固体结核菌培养基均是靠各医院去配制而无现成产品可购，这就需要院方单独为此添置一套相应的生产设备，既加大了医院的设备开支，又相应增加了配制工作量。经检索中国专利，专利申请号98110068其技术方案是：由基础物质、能量物质、植物生长刺激物质混合配制而成，基础物质中有磷酸二氢钾、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、枸橼酸镁、柠檬酸铁铵、天门冬酰胺、中性甘油、马铃薯粉、新鲜鸡蛋液、2％孔雀绿水溶液、水、动物血清，能量物质中有辅酶A、三磷酸腺苷、细胞色素丙，植物生长刺激物质中有α-萘乙酸，每1000克结核菌快速培养基中各组分的含量为：磷酸二氢钾 1.36-1.4克新鲜鸡蛋液 560-600克硫酸镁 0.136-0.14克 2％孔雀绿水溶液 11-13克枸橼酸镁 0.3-0.4克水 300-340克柠檬酸铁铵 0.028-0.03克动物血清 56-60克天门冬酰胺 2.06-2.1克辅酶A 0.4-0.8克中性甘油 6-8克三磷酸腺苷 0.04-0.08克马铃薯粉 17-17.5克细胞色素丙 0.045-0.075克α-萘乙酸 0.05-0.1毫克。

其步骤是：

A、制糊：

将17-17.5克的马铃薯粉加150-170克水后，置于沸水浴中加热，时加搅拌，使成均匀糊状，自然降至室温后备用；

B、混合调配：

将1.36-1.4克的磷酸二氢钾、0.136-0.14克的硫酸镁、0.3-0.4克的枸橼酸镁、0.028-0.03克的柠檬酸铁铵、2.06-2.1克的天门冬酰胺、6-8克的中性甘油加150-170克水后，置于沸水浴中加热溶解，待冷至50℃以下时，加入560-600克的新鲜鸡蛋液、56-60克的动物血清、0.4-0.8克的辅酶A、0.04-0.08克的三磷酸腺苷、0.045-0.075克细胞色素丙、0.05-0.1毫克的α-萘乙酸，充分搅拌均匀后，再加入167-187.5克的马铃薯粉及11-13克的2％孔雀绿水溶液，并经充分搅匀后得1000克混合物；

C、分装及密封；

将混合物分装于大试管中，每管分装5克，置成长斜面后，熔封；

D、灭菌；

采用血清凝固器对大试管进行灭菌，灭菌条件为：头日，85℃，30分钟；次日，80℃，30分钟；第三是，80℃，30分钟。由以上所述可知，固体结核菌培养基的现有配制过程较为复杂和麻烦，故医院只能根据近期内固体结核菌培养基的大致用量予先配制一些备用，但是，全国几千家医院各自分散配制的固体结核菌培养基，均存在着质量标准不一致、成品率不高、不易长期贮存及贮存期稍长因水份散失、药物分解而使检测结果不准的缺陷。临床检测是发现现有的结核菌培养基存在以下缺陷：1、由于现有的固体结核培养基保藏在大试管中，管口用橡皮塞塞紧，故该培养基被密封的程度较差，其内的水份易散失，以至该培养基的贮藏期很短(仅3个月)，这样便不能通过工业化生产手段进行大批量生产，而只能由医院自行配制，因此，目前在我国固体结核菌培养基仅有医院配制品而并无工业化产品。2、众所周知，结核菌的生产繁殖所需条件较高，其培养基中需有多种营养物质，而如上所述可知，现有的固体结核菌培养基中营养物质的种类少，另外其内也没有能加快结核菌新陈代谢活动以提高结核菌生长繁殖速度的能量物质和植物生长刺激物质，这样使得结核菌在现有的固体结核菌培养基中不能进行很好地生长繁殖，分裂周期长达12-16小时，要4-6周方能看到菌落。3、有些液体培养基配方复杂，方法繁琐，罗氏培养基需35天。因此，使用现有的结核菌培养基来对结核菌进行体外人工分离培养时，，其检测速度相当慢，阳性检出率低，不利于结核病的早期诊断和治疗。

本发明的目的在于提供一种简单，实现快速培养结核杆菌的双相培养基，解决了临床早期诊断及有效地治疗的问题。

本发明的另一目的是提供了一种方法易行，操作方便配制结核菌双相培养基的制备方法。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：

A、平菇液相培养基由下列组分制成(用量为重量份)：

磷酸二氢钾 0.2-1

硫酸镁 0.2-1

枸橼酸铁铵 0.02-0.1

天门冬素 1-5

丙酮酸钠 0.2-1

甘油 5-20

蒸馏水 150-350

平菇浸出液 150-350

用磷酸盐调整PH6.1-7.0，再加入琼脂粉0.05-0.5份，高压灭菌，冷却，湿度控制在50-70℃，然后加入羟苄青霉素(50μg/ml)和二性霉素B(50μg/ml)，灭活小牛血清15-30摇匀，置4℃冰箱备用。

平菇固相培养基由下列组分制成(用量为重量份)：取上述平菇液相培养基200-700，加琼脂粉2-8，高压灭菌，冷却，湿度控制在50-70℃，加入灭活小牛血清15-30，搅拌均匀，分装于细胞培养瓶内，将培养瓶平放，待凝固后加入平菇液相培养基5-15，装好后经无菌试验置4℃冰箱保存。

酸罗氏培养基由下列组分制成(用量为重量份)：磷酸二氢钾2-2.8硫酸镁0.2-0.3，枸橼酸镁0.5-0.7，天门冬素3-4，甘油10-14，蒸馏水550-650，马铃薯淀粉25-35，鸡蛋液550-650，2％孔雀绿水溶液15-25。首先将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素、甘油加蒸馏水后置于沸水溶液中加热使之溶解；其次加入马铃薯淀粉，继续在沸水中加热28-34分钟，不断搅拌，使成均匀糊状；第三是冷却，湿度控制在58-62℃；第四是加入鸡蛋液及2％孔雀绿水溶液，搅拌均匀；第五是用双层纱布进行过滤，分装试管，80-90℃流动蒸汽灭菌140-160分钟，贮存在于4℃冰箱备用。

检测结果情况是：结核菌在平菇以相培养基上生长的情况：H₃₇R_V10^-1mg/ml在接种后第三天液相培养基中层略变混浊，有5-8个白色颗粒状菌落出现。第5天即有15-20个菌落，8天时中层乳白状混浊，转动试管可见无数菌落。固相在第6天出现明显细小灰白色菌落，第9天布满平板。菌落略粗糙，菌落较疏松，易于挑起。将液相和固相菌落挑出分别涂片抗酸染色，均呈典型抗酸杆菌，但前者有索状形成，后者菌体稍短。

基础试验结果见下表

H₃₇R_V菌在两种培养基上初生时间比较

液相(+)固相培养基(天) 酸性罗氏培养基(天)

3 4 5 6 8 10 12 14 17 19 25 5 8 11 14 17 20 23 3510^-1 + +10^-2 + +10^-3 +  +10^-4 +  +10^-5 +  +10^-6 +  +10^-7 +  +10^-8 +  仅二个菌落

从上表明显看到，大菌量(10^-1-10^-3)平菇液相培养基3-5天即生长丰满，而酸性罗氏基需5-11天。小接种量(10^-8mg/ml)双相为14天，酸性罗氏培养基35天才有2个菌落生长，平菇固相培养基稍晚于液相培养基，但优于酸性罗氏培养基。

临床标本分离培养结果：

387份临床标本接种平菇培养基污染21份，酸性罗氏培养基污染15份各占0.05％和0.04％，在统计中去掉所污染份数，即按366份进行分析。366份标本在两种培养基中总阳性数为172份(46.99％)，其中平菇双相培养基166份，阳性检出率为45.36％。酸性罗氏培养基础144份，阳性检出率为39.34％。分别占总阳性96.51％和83.72％，经统计学处理X²＝1.354，P＞0.05，无显著差异。

平菇双相培养基和酸性罗氏培养基生长速度的比较，结果见下表

双相培养基与酸性罗氏培养基生长速度比较

生长速度(周) 合计

1 2 3 4 5 6 7 8双相培基 12 56 76 22 166酸罗氏培基 4 62 48 18 6 4 2 144

上表说明，平菇双相培养基上生长的166份标本中，1周阳性者12份(7.23％)，2至3周阳性数分别为56份(33.73％)和76份(45.78％)，4周阳性数为22份(13.25％)；而在酸性罗氏培养基上生长的144份标本中，1周无生长，2周阳性者4份(2.77％)，3周阳性62份(43.06％)，4周48份(33.33％)，4周以后至8周仍有30份(20.83％)。结果说明平菇双相培养平均生长时间12.3天，酸性罗氏培养20.5天，前者平均生长快8.2天，二者差异非常显著(P＜0.01)。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果，配方合理，方法易行，操作方便，检测快速、准确可靠，价格低廉，通过临床实验证明，阳性标本接种双相培养基14天生长，尤其适用于基层医院，具有良好的社会和经济效益。

实施例：

平菇液相培养基由下列组分制成(用量为重量份)：磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.5，枸橼酸铁铵0.05，天门冬素2，丙酮酸钠0.5，甘油10，蒸馏水250，平菇浸出液250，琼脂粉0.1，灭活小牛血清25。首先将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸铁铵、天门冬素、丙酮酸钠，甘油用蒸馏水溶解；其次是加入平菇浸出液；第三是用磷酸盐溶解，调至PH为6.5-6.7；第四是加入琼脂粉；第五是高压灭菌，冷却，温度控制在60-65℃；第六是加入羟苄青霉素(50μg/ml)和二性霉素B(50μg/ml)，灭活小牛血清摇匀，置4℃冰箱备用。

平菇固相培养基由下列组分制成(用量为重量份)：平菇液相培养基500，琼脂粉6，灭活小牛血清25。首先在平菇液相培养基加入琼脂粉；其次是高压灭菌，冷却，湿度控制在60℃；第三是加入灭活小牛血清，混匀，分装于细胞培养瓶内；第四将培养瓶平放，凝固后加入平菇液相培养基，装好后经无菌试验置4℃冰箱保存。

酸罗氏培养基由下列组分制成(用量为重量份)：磷酸二氢钾2.4，硫酸镁0.24，枸橼酸镁0.6，天门冬素3，甘油12，蒸馏水600，马铃薯淀粉30，鸡蛋液600，2％孔雀绿水溶液20。首先将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸镁、天门冬素、甘油加入蒸馏水，置于沸水溶液中加热使之溶解；其次加入马铃薯淀粉，继续在沸水中加热30分钟，不断搅拌，成为均匀糊状；第三是冷却，湿度控制在60℃；第四是加入鸡蛋液和2％孔雀绿水溶液，搅拌均匀；第五是用双层纱布进行过滤，分装试管；第六是灭菌，85℃流动蒸汽灭菌150分钟，贮存在于4℃冰箱备用。

Claims

1、一种结核菌双相培养基，它由下述重量配比的原料制成的培养基：

A、磷酸二氢钾0.2-1，硫酸镁0.2-1，枸橼酸铁铵0.02-0.1，天门冬素1-5，丙酮酸钠0.2-1，甘油5-20，蒸馏水150-350，平菇浸出液150-350，琼脂粉0.05-0.5，灭活小牛血清15-30；

B、平菇固相培养基：平菇液相培养基200-700，琼脂粉2-8，灭活小牛血清15-30；

2、一种实现权利要求1所述的一种结核菌双相培养基的制备方法，该方法包括下列步骤：

A、平菇液相培养基，首先将磷酸二氢钾、硫酸镁、枸橼酸铁铵、天门冬素、丙酮酸钠，甘油用蒸馏水溶解；其次是加入平菇浸出液；第三是用磷酸盐调整PH6.5-6.7；第四是加入琼脂粉；第五是高压灭菌，冷却，温度为60-65℃；第六是加入羟苄青霉素和二性霉素B，灭活小牛血清摇匀；

B、平菇固相培养基，首先在平菇液相培养基加入琼脂粉；其次是高压灭菌，冷却，温度为60℃；第三是加入灭活小牛血清，混匀，分装于细胞培养瓶内；第四将培养瓶平放，凝固后加入平菇液相培养基；