CN103276043B - 用于结核菌的培养基和制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升含肌苷的10-15微克，由于肌苷能直接透过细胞膜进入细胞，使低能、缺氧静止状态的细胞恢复正常活动，因此缩短了结核菌的培养周期和对结核菌的治疗周期。
Description
技术领域
本发明涉及一种培养基和制备方法，尤其是一种用于结核菌的培养基和制备方法。
背景技术
结核病是常见病，多发病是严重危害人体健康的乙类传染病，根据2000年我国结核病流行病学抽样调查结果分析，目前我国结核病疫情十分严重，呈现五多一高的特点，即结核病感染人数增多，全国已有4亿多人感染了结核菌；现患肺结核病人多，我国现有500万结核病人，其中200万具有传染性；结核病死亡人数多，我国每年因结核病死亡的人数约15万；耐药结核病人多，我国耐药病人高达46%；农村结核病人多，我国80%的结核病人在农村，老、少、边、穷地区更为严重；结核病疫情高，20年来，我国结核病疫情居高不下，并呈蔓延趋势。2000年以后，结核病的发病、耐药及死亡呈上升趋势，列各类传染病之首，因此防治结核病是一个十分重要的医疗课体。
结核病的诊断及治疗是通过影像学检查及实验室查结核菌，影像学检查仅仅是参考指标，而诊断的依据是在病人体内找到结核菌，因此检验找到结核菌是确诊的关键，而找结核菌有两种方法：一是痰（分泌物）涂片染色后直接查结核菌，操作简便快速，但对于排菌少的病人不易查到，阳性率低（60%）。另一种方法为痰（分泌物）培养，阳性率可达90%特别对一些不典型排菌少的病例有较好效果。不论从结核病控制、流行病学调查和研究，还是从临床诊疗的角度看，分枝杆菌的分离培养都是结核病原学诊断的“金标准①。同时，分枝杆菌的分离培养也为进行菌种鉴定和药物敏感性监测提供试验菌株，结核病明确诊断后的治疗，选择药物是关键，而选择药物就需要做药敏试验，通过药敏选择有效药物既能减轻病人负担又避免应用无效药物而引起的副作用，目前结核菌培养及结核菌培养+药敏最经典的方法是用改良罗氏培养基进行培养，改良罗氏培养基（Lowensten-Jensen，L-J）是由国际防痨协会和肺病联合会（International union Against Taberculosis and lung Disease，IUATLD）推荐，用的培养及与其它培养基相比，此培养基培养结核菌从开始培养到能看到明显结核菌菌落约需16-56天，药敏约需14-60天，因此培养周期较长。
发明内容
为了克服上述技术缺点，本发明的目的是提供一种用于结核菌的培养基和制备方法，因此缩短了结核菌的培养周期和对结核菌的治疗周期。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案是：一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的10-15微克。
结核菌营养要求较高，在改良罗氏培养基上，结核菌处于低能缺氧状态，生长缓慢，由于肌苷能直接透过细胞膜进入细胞，使低能、缺氧静止状态的细胞恢复正常活动，因此缩短了结核菌的培养周期和对结核菌的治疗周期。
本发明设计了，用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.0-2.8g、MgSO4.7H2O 0.20-0.28g 、柠檬酸镁或枸橼酸镁0.4-0.8g、天门冬素3.2-3.9g、丙三醇10-14ml、蒸馏水400-800ml、马铃薯淀粉25-35g、新鲜鸡卵液800-1200ml、2%孔雀绿水溶液18-22ml。
本发明设计了，用于分离培养的标准配制改良罗氏培养基即酸性L-J培养基设置为包含有KH2PO4 12.0-16.0g、MgSO4.7H2O 0.20-0.28g 、柠檬酸镁或枸橼酸镁0.4-0.8g、天门冬素3.2-3.9g、丙三醇10-14ml、蒸馏水400-800ml、马铃薯淀粉25-35g、新鲜鸡卵液800-1200ml、2%孔雀绿水溶液18-22ml。
本发明设计了，一种标准配制改良罗氏培养基的制备方法，其特征是：其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 2.0-2.8g或12.0-16.0g、MgSO4.7H2O 0.20-0.28g 、柠檬酸镁或枸橼酸镁0.4-0.8g、天门冬素3.2-3.9g、丙三醇10-14ml、马铃薯淀粉25-35g、蒸馏水400-800ml混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为110-131℃高压灭菌器中， 15-25min灭菌，冷却至室温后，在温度为2-6℃的冰箱保存待用；
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液18-22ml、无菌蒸馏水80-120ml 混合， 在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置1-2小时助溶；孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液；
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗，再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡20-40min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡10-20min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物；
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液400-800ml、孔雀绿溶液15-25ml、 全质卵液800-1200ml 、肌苷的10-15微克 充分混匀，培养基溶液静置30-60min，然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子。每支试管内加量7-10ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳，培养基分装结束后，在10-20min内开始凝固，以防沉淀发生；
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到80-90℃，培养基放入后，当温度达到80-90℃时开始计算时间，凝固45-55min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却，凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力；
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存，放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入，培养基保存期不能超过4周。
附图说明
图1中的左图是使用本发明第一个实施例中的同一份标本培养11天后的效果图，右图是使用普通培养基的同一份标本培养11天后的效果图。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步描述，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。
本发明的第一个实施例，一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的10微克。
本实施例中，用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.0g、MgSO4.7H2O 0.20g 、柠檬酸镁0.4g、天门冬素3.2g、丙三醇10ml、蒸馏水400ml、马铃薯淀粉25g、新鲜鸡卵液800ml、2%孔雀绿水溶液18ml。
一种用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基的制备方法，其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 2.0g、MgSO4.7H2O0.20g 、柠檬酸镁0.4g、天门冬素3.2g、丙三醇10-14ml、马铃薯淀粉25g、蒸馏水400ml混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为110℃高压灭菌器中， 15min灭菌。冷却至室温后，在温度为2℃的冰箱保存待用。
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液18ml、无菌蒸馏水80ml 混合，
在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置1小时助溶，孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液.
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗。再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡20min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡10min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物。
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液400ml、孔雀绿溶液15ml、全质卵液800ml 、肌苷的10微克 充分混匀，培养基溶液静置30min。然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子，每支试管内加量7ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳，培养基分装结束后，在10min内开始凝固，以防沉淀发生。
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到80℃，培养基放入后，当温度达到80℃时开始计算时间，凝固45min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却。凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存，放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入，培养基保存期不能超过4周。
使用本实施例进行试验，图1中的左图是使用本发明第一个实施例中的同一份标本培养11天后的效果图，右图是使用普通培养基的同一份标本培养11天后的效果图。
本发明的第二个实施例，一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的15微克。
本实施例中，用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.8g、MgSO4.7H2O 0.28g 、柠檬酸镁0.8g、天门冬素3.9g、丙三醇14ml、蒸馏水800ml、马铃薯淀粉35g、新鲜鸡卵液1200ml、2%孔雀绿水溶液22ml。
一种用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基的制备方法，其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 2.8g、MgSO4.7H2O0.28g 、柠檬酸镁0.8g、天门冬素3.9g、丙三醇14ml、马铃薯淀粉35g、蒸馏水800ml混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为131℃高压灭菌器中， 25min灭菌。冷却至室温后，在温度为6℃的冰箱保存待用。
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液22ml、无菌蒸馏水120ml 混合，
在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置2小时助溶，孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液。
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗。再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡40min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡20min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物。
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液800ml、孔雀绿溶液25ml、全质卵液1200ml 、肌苷的15微克 充分混匀，培养基溶液静置60min，然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子，每支试管内加量10ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳。培养基分装结束后，在20min内开始凝固，以防沉淀发生。
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到90℃，培养基放入后，当温度达到90℃时开始计算时间，凝固55min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却，凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存，放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入，培养基保存期不能超过4周。
本发明的第三个实施例，一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的12.5微克。
本实施例中，用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.4g、MgSO4.7H2O 0.24g 、枸橼酸镁0.6g、天门冬素3.55g、丙三醇12ml、蒸馏水600ml、马铃薯淀粉30g、新鲜鸡卵液1000ml、2%孔雀绿水溶液20ml。
一种用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基的制备方法，其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 2.4g、MgSO4.7H2O 0.24g 、枸橼酸镁0.6g、天门冬素3.55g、丙三醇12ml、蒸馏水600ml混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为120℃高压灭菌器中， 20min灭菌。冷却至室温后，在温度为4℃的冰箱保存待用。
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液20ml、无菌蒸馏水100ml 混合， 在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置1.5小时助溶，孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液.
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗。再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡30min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡15min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物。
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液600ml、孔雀绿溶液20ml、全质卵液1000ml 、肌苷的12.5微克 充分混匀，培养基溶液静置45min。然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子，每支试管内加量8.5ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳。培养基分装结束后，在15min内开始凝固，以防沉淀发生。
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到85℃，培养基放入后，当温度达到85℃时开始计算时间，凝固50min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却，凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存，放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入，培养基保存期不能超过4周。
本发明的第四个实施例，一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的15微克。
本实施例中，用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.8g、MgSO4.7H2O 0.28g 、枸橼酸镁0.8g、天门冬素3.9g、丙三醇14ml、蒸馏水800ml、马铃薯淀粉35g、新鲜鸡卵液1200ml、2%孔雀绿水溶液22ml。
一种用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基的制备方法，其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 2.8g、MgSO4.7H2O0.28g 、枸橼酸镁0.8g、天门冬素3.9g、丙三醇14ml、马铃薯淀粉35g、蒸馏水800ml混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为131℃高压灭菌器中， 25min灭菌。冷却至室温后，在温度为6℃的冰箱保存待用。
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液22ml、无菌蒸馏水120ml 混合，
在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置2小时助溶，孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液。
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗。再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡40min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡20min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物。
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液800ml、孔雀绿溶液25ml、全质卵液1200ml 、肌苷的15微克 充分混匀，培养基溶液静置60min，然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子，每支试管内加量10ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳。培养基分装结束后，在20min内开始凝固，以防沉淀发生。
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到90℃，培养基放入后，当温度达到90℃时开始计算时间，凝固55min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却，凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存，放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入，培养基保存期不能超过4周。
本发明的第五个实施例，一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的10微克。
本实施例中，用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.0g、MgSO4.7H2O 0.208g 、柠檬酸镁0.4g、天门冬素3.2g、丙三醇10ml、蒸馏水400ml、马铃薯淀粉25g、新鲜鸡卵液800ml、2%孔雀绿水溶液18ml。
一种用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基的制备方法，其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 2.0g、MgSO4.7H2O0.20g 、柠檬酸镁0.4g、天门冬素3.2g、丙三醇10ml、马铃薯淀粉25g、蒸馏水400ml混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为110℃高压灭菌器中， 15min灭菌。冷却至室温后，在温度为2℃的冰箱保存待用。
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液18ml、无菌蒸馏水80ml 混合，
在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置1小时助溶，孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液.
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗。再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡20min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡10min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物。
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液400ml、孔雀绿溶液15ml、全质卵液800ml 、肌苷的10微克 充分混匀，培养基溶液静置30min，然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子，每支试管内加量7ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳，培养基分装结束后，在10min内开始凝固，以防沉淀发生。
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到80℃，培养基放入后，当温度达到80℃时开始计算时间，凝固45min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却。凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存，放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入，培养基保存期不能超过4周。
本发明的第六个实施例，一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的10微克。
本实施例中，用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.0g、MgSO4.7H2O 0.208g 、枸橼酸镁0.4g、天门冬素3.2g、丙三醇10ml、蒸馏水400ml、马铃薯淀粉25g、新鲜鸡卵液800ml、2%孔雀绿水溶液18ml。
一种用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基的制备方法，其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 2.0g、MgSO4.7H2O0.20g 、枸橼酸镁0.4g、天门冬素3.2g、丙三醇10ml、马铃薯淀粉25g、蒸馏水400ml混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为110℃高压灭菌器中， 15min灭菌。冷却至室温后，在温度为2℃的冰箱保存待用。
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液18ml、无菌蒸馏水80ml 混合，
在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置1小时助溶，孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液.
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗。再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡20min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡10min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物。
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液400ml、孔雀绿溶液15ml、全质卵液800ml 、肌苷的10微克 充分混匀，培养基溶液静置30min，然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子，每支试管内加量7ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳，培养基分装结束后，在10min内开始凝固，以防沉淀发生。
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到80℃，培养基放入后，当温度达到80℃时开始计算时间，凝固45min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却。凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存，放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入，培养基保存期不能超过4周。
本发明的第七个实施例，一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的15微克。
本实施例中，用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.8g、MgSO4.7H2O 0.28g 、枸橼酸镁0.8g、天门冬素3.9g、丙三醇14ml、蒸馏水800ml、马铃薯淀粉35g、新鲜鸡卵液1200ml、2%孔雀绿水溶液22ml。
一种用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即 改良L-J培养基的制备方法，其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 2.8g、MgSO4.7H2O0.28g 、枸橼酸镁0.8g、天门冬素3.9g、丙三醇14ml、马铃薯淀粉35g、蒸馏水800ml混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为131℃高压灭菌器中， 25min灭菌。冷却至室温后，在温度为6℃的冰箱保存待用。
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液22ml、无菌蒸馏水120ml 混合，
在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置2小时助溶，孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液.
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗。再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡40min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡20min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物。
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液800ml、孔雀绿溶液25ml、全质卵液1200ml 、肌苷的15微克 充分混匀，培养基溶液静置60min。然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子，每支试管内加量10ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳，培养基分装结束后，在20min内开始凝固，以防沉淀发生。
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到90℃，培养基放入后，当温度达到90℃时开始计算时间，凝固55min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却，凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存，放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入，培养基保存期不能超过4周。
本发明的第八个实施例，一种用于结核菌的培养基，包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的12.5微克。
本实施例中，用于分离培养的标准配制改良罗氏培养基即酸性L-J培养基设置为包含有KH2PO4 14.0g、MgSO4.7H2O0.24g 、柠檬酸镁0.6g、天门冬素3.55g、丙三醇12ml、蒸馏水600ml、马铃薯淀粉30g、新鲜鸡卵液1000ml、2%孔雀绿水溶液20ml。
一种用于分离培养的标准配制改良罗氏培养基即酸性L-J培养基的制备方法，其步骤为：
（1）基础液的配置：
把KH2PO4 14.0g、MgSO4.7H2O0.24g 、柠檬酸镁0.6g、天门冬素3.55g、丙三醇12ml、蒸馏水600ml、马铃薯淀粉30g混合,加热溶解到蒸馏水中,在温度为120℃高压灭菌器中，20min灭菌，冷却至室温后，在温度为4℃的冰箱保存待用。
（2 ）孔雀绿溶液的配置
把 2%孔雀绿水溶液20ml、无菌蒸馏水100ml 混合，
在无菌环境中将孔雀绿染料溶解在无菌蒸馏水里,温箱放置1.5小时助溶，孔雀绿溶液不能长期保存,如果出现沉淀或颜色变浅,都应废弃并制备新鲜溶液；
（3 ）全质卵液的匀化
用刷子蘸温水和普通的碱性肥皂将不超过7天的并且为食用不含抗生素饲料的母鸡下的新鲜鸡蛋彻底刷洗，再将鸡蛋在肥皂夜里浸泡35min，用流动水彻底冲洗鸡蛋后，在75%乙醇中浸泡15min，晾干后使用，在无菌环境中制备匀化卵液，并用双层以上医用无菌纱布过滤取出不能匀化的膜状物。
（4 ）培养基的配制
在无菌环境中，按 基础液600ml、孔雀绿溶液 20ml、全质卵液1000ml 、肌苷的12.5微克 充分混匀，培养基溶液静置40min，然后分装在无菌试管内，注意拧紧盖子，每支试管内加量8.5ml，以培养基斜面高度占试管的2/3、且底部充满培养基为佳。培养基分装结束后，在15min内开始凝固，以防沉淀发生。
（5 ）培养基的凝固
培养基放入凝固器之前，先将凝固器温度升到85℃，培养基放入后，当温度达到85℃时开始计算时间，凝固50min后及时将培养基从凝固器中取出或以电动风机将其冷却，凝固好的培养基斜面颜色呈黄绿色，表年光滑无泡，具有一定韧性和酸碱缓冲能力。
（6 ）培养基的保存
在无菌试管上注明日期后分装于防潮包装内，在4℃冰箱内保存。放入前检查瓶盖是否闭封，以防止培养基干化和冰箱凝固水的渗入。培养基保存期不能超过4周。
进行分枝杆菌L-J培养检测的临床标本，包括痰、支气管灌洗液、体液（尿液）、穿刺液（脑脊液、胸水、腹水、关节腔液等）及分泌物（前列腺液、皮肤粘膜分泌物等），除非脓性的脑脊液标本采用直接离心接种外，其他标本通常需要进行标本前处理。标本在检查前应在4℃冰箱中保存，并应尽快进行检查。 痰或其它标本的“前处理”有两个目的，一是除去分枝杆菌以外的杂菌（去污染），二是液化标本。在“前处理”过程中，同时也应尽可能地减少对分枝杆菌的损害，要严格掌握“前处理”是试剂的浓度和处理标本的时间。
L-J培养常用标本的“前处理”方法有“碱处理直接法”、“检处理中和离心沉淀法”、“酸处理法”。用“碱处理中和离心沉淀法”为优选方法，以提高阳性率。 对于脓液、尿液、粪便等标本，由于此类标本容易被污染、或含污染菌较多且此类标本中分枝杆菌活性较低，推荐使用4%H2SO4进行去污染处理。
采用“碱处理”的标本,应接种“酸性L-J培养基”;采用“碱处理中和离心沉淀法”和“酸处理”的标本,应接种“改良L-J培养基”，取前处理后的标本0.1ml,无菌操作分别接种于改良罗氏培养基和结核菌快速培养基斜面上,每分标本同时接种在每种培养基的两支培养基上.宜同时接种一支丙酮酸钠罗氏培养基，以利于牛结核分枝杆菌生长。如临床怀疑非结核分枝杆菌感染,相应标本经前处理接种后,应同时在28℃温箱孵育2支培养管。
前处理的方法有：
1、碱处理-直接法
4%（W/V）NaOH的配置：取4g氢氧化钠加入80ml蒸馏水中，完全溶解后补充蒸馏水至终体积100ml。
根据标本的粘稠程度，加1-2倍体积的4%NaOH，涡旋振荡器振荡，使标本匀化，室温放置。自加入4%NaOH到标本接种应在20min内完成。、
2、碱处理-中和离心沉淀法
标本加入1-2倍体积的4%NaOH，涡漩振荡，15-20min后加入1/15Mph6.8磷酸缓冲液至20-40ml并混匀(从加入4%NaOH到与缓冲液混合应在20min内完成).离心3,000g,20-30min,去其上清液,沉淀物加入碱酸缓冲液0.5ml混匀、接种。沉淀物可同时进行涂片、抗酸染色镜检。
接种后的培养管在37℃温箱孵育,接种后3天、7天分别观察结果一次，然后每天观察结果一次。发现菌落生长者，经抗酸染色证实为抗酸菌，可报告分枝杆菌培养阳性。若满8周仍无菌落生长，方可报告培养阳性。观察时要注意菌落的外观和色素产生情况。 接种并孵育后第3、7天各观察一次菌落生长情况。发现菌落生长着，经抗酸染色证实后，可报告快速生长分枝杆菌阳性。此后每两天观察一次，记录菌落生长及污染情况。生长物经抗酸染色证实后，可报告分枝杆菌生长。培养阴性结果须在满8周后未见菌落生长者方可报告。
上述实施例只是本发明所提供的用于结核菌的培养基和制备方法的一种实现形式，根据本发明所提供的方案的其他变形，增加或者减少其中的成份或步骤，或者将本发明用于其他的与本发明接近的技术领域，均属于本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种用于结核菌的培养基；其特征是：包含有标准配制改良罗氏培养基的1毫升和肌苷的10-15微克；
用于分离培养和药敏试验的标准配制改良罗氏培养基即改良L-J培养基设置为包含有KH2PO4 2.0-2.8g、MgSO4.7H2O 0.20-0.28g 、柠檬酸镁0.4-0.8g、天门冬素3.2-3.9g、丙三醇10-14ml、蒸馏水400-800ml、马铃薯淀粉25-35g、新鲜鸡卵液800-1200ml和2%孔雀绿水溶液18-22ml；
或用于分离培养的标准配制改良罗氏培养基即酸性L-J培养基设置为包含有KH2PO4 12.0-16.0g、MgSO4.7H2O 0.20-0.28g 、柠檬酸镁0.4-0.8g、天门冬素3.2-3.9g、丙三醇10-14ml、蒸馏水400-800ml、马铃薯淀粉25-35g、新鲜鸡卵液800-1200ml和2%孔雀绿水溶液18-22ml。
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