CN1381239A - 由培养的白细胞提取成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种为了掌握白细胞成分的作用、效果,在近乎活体的状态下将白细胞成分由白细胞及/或培养白细胞加以分离、提取的方法。本发明提供由下列(A)和(B)两道工序组成的方法:(A)对于由血液采取的白细胞及/或培养白细胞,用物理方法破坏其细胞膜的第一工序;(B)用离心沉淀法或电泳法,由含有上述第一工序细胞膜破坏的白细胞成分之液体中,将白细胞成分加以分离、提取的工序。

Description

由培养的白细胞提取成分的方法

本发明涉及一种破坏血液中的白细胞细胞膜提取白细胞成分的方法。

以往，一般都认为，血液中的红细胞是以迅速而大量地运搬氧和二氧化碳为主要任务，而白细胞则具有细菌吞噬作用。然而，在细菌大量存在之处的炎症部位也有红细胞聚集，可能在炎症部位起到某种作用。此外，关于红细胞和白细胞在炎症部位的相互作用，现仍未被充分研究。本发明者使用以前申请专利的「红细胞划分法」(特愿平8-215552)，将红细胞分为三层，对各层中所含的红细胞与细菌之作用进行了观察。

使用上述申请专利的「红细胞划分法」所得的上层、中层、下层之红细胞，分别添加于液体介质中，观察接种细菌而存活的红细胞对细菌所起的作用。上层中所含的红细胞对细菌会进行攻击，细菌没有繁殖。次上层中遗留有白细胞，但并未发现白细胞对细菌有何吞噬作用。中层中所含的红细胞虽未见有攻击作用，但细菌的繁殖却得到了抑制。此中层中也有少量白细胞存在，但据观察对细菌并不起任何作用。下层中所含的红细胞没有攻击作用，细菌有所繁殖。下层中并未发现白细胞。

炎症一发生，或者血液中的白细胞增加，或者炎症部位白细胞变得很巨大，由于此一现象，一般都认为白细胞会吞噬细菌。如上述申请专利的「红细胞划分法」中所记载，观察存活红细胞和白细胞对细菌的活动与变化，认为只有白细胞会攻击细菌的以往的想法不见得是正确的。

以往，一般都认为红细胞是均一的血细胞成分，而白细胞则是具有核与细胞质的真正的细胞，是在形态上，功能上各不相同的数种细胞的集合体。由形态与染色性将其分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单细胞五种。(东京化学同人、「生化学辞典」)以往进行血液研究时检查血液所采用的方法是，在玻璃板上滴一滴血液，再用另一块玻璃板之一端铺开，使其成一薄层，待此血液干燥后，用各种染色剂染色，再用显微镜观察。然而，这种方法有如下缺点。(1)由于干燥，使细胞变成木乃伊状。因此，对血细胞那样敏感、柔软易变的细胞进行观察，并不是适当的方法。(2)染色法的场合，染不上的成分完全无法观察。染色性不好的部份被忽视，相反地容易染色的部份则染得过深，微妙的变化无法观察。(3)生物研究的场合，若不自始至终，尽可能长期观察，掌握其随着时间而变化的状态，即无法了解其真相。

以往使用法科尔·康雷法就可以对淋巴细胞进行分离、提取，以淋巴细胞为中心的免疫系统也有人在进行各种研究。本发明阐明，将健康人的淋巴细胞投予风湿病患者，其效果并不大，而用同样方法投予完全培养的白细胞，其效果却极为显著，在临床方面也证实了用培养白细胞治疗风湿病的确有疗效，并曾经在许多学会(例如：1981年在巴黎举行的国际风湿病学会)发表过。

一般都认为，细胞老化而破坏时，会变成小小的水溶性物质在血液中流动，最后被搬运到肝脏和肾脏。即使肝脏和肾脏具有最终处理老化废物的机能，但其前一阶段的细胞的分解和水溶化的过程尚未得到阐明。本发明者使用「红细胞划分法」所得的三层红细胞液的下层液(不含白细胞的血细胞群)，对白细胞的老化废物排泄作用进行了观察。即，在下层液中加入同一血型的冷冻白细胞和存活白细胞进行培养。其结果表明，血细胞细胞比未加入白细胞时更加细分化，而且已经水溶化。另外，加入冷动保存的白细胞比加入存活白细胞，其效果更加显着。这表明如下两种机能：白细胞具有将死灭的红细胞作为老化废物加以处理的机能。另外，由冷冻保存的白细胞效果较佳一事，可以推断破坏白细胞的细胞所得的白细胞之内部成分起到某种作用。

由健康人采取、培养的白细胞对风湿病等某些疾病有其疗效，已经在临床试验中得到证实，实际上要治疗时必需对培养血液进行各种检查(例如：AIDS病毒的有无)，而其由于无菌培养的费事及设备、治疗费用极为高昂。以现在的试验治疗为例，按4周1次的频率使用培养白细胞，以6次为1疗程，最少4疗程为宜。一次的费用大约需要5万日圆，4疗程大约就要120万日圆。这在经济上是个相当大的负担，现阶段的治疗主要使用副作用较大的类固醇剂及只有暂时镇痛效果的消炎镇痛剂来解决此一问题。

根据上述观察结果，如果能够阐明白细胞内的成分和红细胞的相互作用及其对细菌的作用，以及白细胞与白细胞成分的细胞老化废物处理作用等，提取其成分或加以合成，即可获得副作用没有抗生素及类固醇剂那么强烈、价格低、疗效高(例如：可以治疗癌、肝病、肾病，同时也可望使肝脏移植、肾脏移植大为减少)的药剂。

基于上面所述、本发明之目的在于提供，在近乎活体的状态下，将白细胞成分由培养白细胞中加以分离、提取的方法，以阐明白细胞之作用及效果。

为解决上述的课题，本发明提供由下列(A)和(B)两道工序组成的方法：(A)对于由血液采取的白细胞，用物理方法破坏其细胞膜的第一工序；(B)用离心沉淀法或电泳法，由含有上述第一工序(A)得到的细胞膜破坏的白细胞成分之液体中，将白细胞成分加以分离、提取的工序。

用这种方法分离、提取的白细胞成分，可以使用依次由各种疾病的患者采取的血液样本，如下确认治疗效果。即，(1)从患者取血5～10ml，采用红细胞划分法分离为上、中、下三层，制成血液层，分别培养，用相位差显微镜经时观察各培养血液的变化。该观察结果作为判定治疗效果的基准。(2)在同样分离为上、中、下三层的血液层中加入由白细胞分离、提取到的成分，培养，用相位差显微镜经时观察红细胞的变化。通过(1)和(2)的操作，从患者的血液采样中发生的变化就可判定对肝脏疾病、肾脏疾病、各种癌的治疗效果。

上述(A)第一工序所用的破坏白细胞细胞膜的物理方法为下列五种中之一：(a)将1MHz-50MHz的超声波照射于含有白细胞的液体，利用振动破坏细胞膜的方法、(b)将10-100mW、50/cm2的激光照射于同一部位达数秒钟至数分钟(3分钟左右)破坏细胞膜的方法、(c)改变渗透压以破坏细胞膜的方法、(d)从-5℃冷冻到绝对零度，然后再常温解冻以破坏细胞膜的方法，(e)将采取的白细胞置于减压装置之中，急速减压以破坏细胞膜的方法。

上述(B)的分离白细胞成分的第二工序，是将含有上述(A)第一工序白细胞细胞膜被破坏的白细胞之液体充分加以搅拌，然后进行离心沉淀，对离心沉淀后形成的分离层按层进行采取，或者是用电泳法使含有上述(A)工序白细胞细胞膜被破坏的白细胞之液体泳动，加以分离，提取其各部份的成分。

上述(A)第一工序所用的白细胞，是对经各项检查的结果，判断为健康人的血液中的白细胞，进行培养所得者。

附图说明

图1培养48小时后的白细胞用相位差显微镜观察所得照片。

图2加入细菌时及24小时后，用红细胞划分法分离的血液采样用相位差显微镜观察所得照片。

图3用红细胞划分法提取的3层血液采样中加入绿脓杆菌和培养白细胞时及39小时后的变化，用相位差显微镜观察所得照片。

以下说明本发明对由健康人采取的白细胞进行培养，分离、采取其白细胞成分，将分离、采取的白细胞成分加入于由病人采取的血液中时，观察、判断其效果的可行实施例。

首先，按照以往的方法取出白细胞进行培养。取健康人(现阶段可能实施的所有健康诊断及血液检查的结果判断为无异常的人)的血液200ml加入于葡聚糖70液300ml中，充分加以混合。在25℃以上的室温下搁置1小时或在25-20℃的室温下搁置1小时20分钟左右。接着，采取含有聚集于表层的白细胞和红细胞之一部份的液体，以1000转/分的转速进行离心沉淀。去除上清液，加入低渗液，经30秒后再加入高渗液。利用此项操作取得白色干酪状的白细胞。但若一次不能如愿时，则反复进行低渗液和高渗液的操作。再用1000转/分的转速对此液进行离心分离，去除上清液，将5％FCS(牛胎儿血清)5％加入于RPMI-1640，用培养器(37℃、5％CO2恒温箱)培养48小时。

用相位差显微镜(NIKON TMS-F MFA20100)观察培养48小时后的白细胞，按形状分为5大类：如附图1所示照片，(1)食肉状细胞(++++-V)、(2)无变化细胞(++-+++)、(3)气球状细胞(++-+++)、(4)履带状细胞(++-+++)、(5)变形虫状细胞(+)。各类名称是发明人按形状特征所取得、按数目由多而少的顺序排列。

对培养48小时的白细胞培养液进行离心分离(1000转/分)，去除上清液，用生理溶胶3号20-50ml进行2次洗净和离心分离。在由此所得的培养白细胞中加入生理溶胶3号100-200ml，在5℃的温度下保存。以此作为采样A。发明人使用培养白细胞对关节风湿病患者所进行的治疗，是将其在5℃的温度下保存的培养白细胞在24小时内经静脉注入的。

在此例示显示培养白细胞具有疗效的方法。即，在用红细胞划分法分开的3层血液采样中加入细菌进行观察，再加入以上述方法取得的培养白细胞观察其变化。首先，将由健康人采取的血液10ml加入于7％葡聚糖(Dextran)生理食盐水一五姆1，充分进行混合。其次，将其搁置于20-25℃的室温下60-75分钟，即分离成上层、中层、下层的红细胞采样。用吸量管由各层采取血液采样，在装有3ml液体介质RPMI-1640的烧瓶(Costar公司制)中滴入4-6滴。至此为止，就是用红细胞划分法采取3层血液采样(采样B)的工序。在此烧瓶内的培养血液中加入绿脓杆菌(pseudomonas sp.)，放入5％二氧化碳恒温箱中保持37℃进行培养。

图2显示用相位差显微镜对加入细菌时及24小时后的各血液采样进行观察的结果。照片1和2是用红细胞划分法采得的上层红细胞采样，T表示上层(Top layer)。照片3和4是用红细胞划分法采得的中层(Middlelayer)红细胞采样。照片5和6是用红细胞划分法采得的下层(Bottomlayer)红细胞采样。上层和中间层含有白细胞，细菌的增加在某种程度上被抑制。下层的细菌增加没有被抑制。

然后，在由上述的红细胞划分法得到的3层血液采样(采样B)中加入绿脓菌和培养白细胞(采样A)，用相位差显微镜观察加入当时及39小时后的变化，结果示于图3。照片1和2是上层红细胞采样，照片3和4是中间层红细胞采样。照片5和6是下层红细胞采样，加入培养白细胞后细菌的增殖稍微被抑制。照片7-12显示不加入培养白细胞而加入抗生素的的结果。使用上层和中层的红细胞采样时(照片7-10)，对细菌繁殖的抑制力有所增强，但随着时间的经过，抑制力变得越来越差。使用下层红细胞采样时，即使加入抗生素，也不见对细菌有任何抑制效果。这种现象用以往的MIC说(最少血中有效浓度说)是无法说明的。以往的学说是以使用活体外的培养皿的试验结果为基础的，，这表示该学说无法说明抗生素在活体内的作用。

如上所述，加入培养白细胞，红细胞对细菌繁殖的抑制效果有所增大，其能力与抗生素相同，甚至于较大。尤其是随着时间的经过，其能力更加显着。抗生素的副作用是众所周知的事实，细菌对抗生素会产生抵抗力也已为人所知。可认为白细胞本来就存在于人体内，用来控制自然治愈力的。本实施例显示培养白细胞对某一种细菌繁殖的抑制力有增强效果，即有治疗效果。用同样的程序，可以在由各种病毒性疾病、癌、肝炎、肾炎等的患者采取的血液中加入培养白细胞来判断其治疗效果。对C型肝炎、透析患者的病例，加入患者本人的白细胞，红细胞4、5天就变质，但加入健康的白细胞，红细胞的变性、变质会得到抑制。由于加入由健康人采取的培养白细胞之结果，对细菌繁殖的抑制力大为增强，对于癌、风湿病患者也发现同样的效果。

如上所述，发明人用相位差显微镜对培养48小时后的白细胞进行观察，按其形状将其分为5大类(图1)。使用培养白细胞进行治疗，虽这5大类全部都可以，但如果能够特定白细胞的成分中具有这种对细菌和病毒繁殖的抑制能力者，即可对该成分进行合成、提取，以获得比现在使用的抗生素更有效的药剂。本发明的目的即在于实现分离、提取这种白细胞成分的方法。

下面就来说明按照本发明分离、提取白细胞成分的方法之最佳实施例。白细胞的培养还是按照如上所述的传统方法进行。白细胞于培养后，在-5℃--72℃的温度范围内，通常是在-20℃的温度下冷冻，并在冷冻状态下保持10天左右。然后，在常温下解冻1-3小时。将此解冻液体充分加以搅拌，通常以5-50转/分的低转速到800转/分的高转速进行离心沉淀，分别对离心沉淀后形成的各分离层进行采取。或者用电泳法使解冻后的液体泳动，加以分离。采取由此获得的各部份的成分。

根据上述培养白细胞的治疗效果判断程序，对如上采取的白细胞的成分，观察其对疾病的作用、老化废物处理作用等。所谓对疾病的作用是指，通过加入白细胞成分使红细胞抑制细菌和病毒的繁殖，甚至于停止活动，以恢复健康人的自然治愈能力的作用。这里所说的疾病是指各种癌、肝炎、肾炎、关节风湿病、各种炎症性疾病、立克次氏体和病毒等的感染性疾病、艾滋病(AIDS)等。在由这些疾病的患者采取的红细胞采样中，依次加入用本发明分离、提取的白细胞成分，特定红细胞的功能变得显著者。此外，由于考虑到成分间可能会有协同作用，也可以将成分组合起来以提高治疗效果。

如上所述，用本发明的由白细胞中取出成分的方法，可破坏白细胞的细胞膜，分离、提取白细胞成分，将此分离、提取的成分依次加入于红细胞采样中，按照治疗效果判断程序，观察其对各种细菌和疾病的效果之优劣等，即可特定与抗生素同等或更显著的细菌繁殖抑制能力的成分。而且，C型肝炎、自体免疫型肝炎、肾病的场合，白细胞与红细胞的相互关系破坏，白细胞引起红细胞的变性。因此，白细胞或白细胞成分将老化死亡的细胞加以分解，使其变为水溶性小的物质之作用变弱，不能很好的被分解。一般认为疾病是由于这种组织老化废物积留导致机能降低而发生的。如果能够观察到，用本发明的方法分离、提取的白细胞成分，将寿命告终的老红细胞、肝脏、肾脏的细胞分解成水溶性微细物质，即可将该白细胞成分应用于上述疾病的治疗。

Claims (4)

1.一种由白细胞提取成分的方法，其特征在于由下列(A)第一工序和(B)第二工序组成，

(A)对于由血液采取的白细胞(a)将1MHz-50MHz的超声波照射于含有白细胞的液体，利用振动破坏细胞膜的方法、(b)将10-100mW、50/cm2的激光照射于同一部位达数秒钟至数分钟(3分钟左右)破坏细胞膜的方法、(c)改变渗透压以破坏细胞膜的方法、(d)从-5℃冷冻到绝对零度，然后再常温解冻以破坏细胞膜的方法，(e)将采取的白细胞置于减压装置之中，急速减压以破坏细胞膜的方法，利用由上述方法中选出的物理方法破坏细胞膜的第一工序；

(B)由含有上述第一工序(A)所得到的细胞膜已破坏的白细胞成分之液体分离、提取白细胞成分的第二工序。

2.如权利要求1所述的方法，其中，上述(B)的分离、提取白细胞成分的第二工序，是将含有上述(A)第一工序白细胞细胞膜被破坏的白细胞之液体充分加以搅拌，然后进行离心沉淀，对离心沉淀后形成的分离层按层进行采取，提取各部份的成分。

3.如权利要求1所述的方法，其中，上述(B)的分离、提取白细胞成分的第二工序，是用电泳法使含有上述(A)第一工序白细胞细胞膜被破坏的白细胞之液体泳动，加以分离、提取。

4.如权利要求1所述的方法，其特征为，上述(A)之白细胞为培养白细胞。