CN1380419A - 基因工程制备人白细胞介素4的方法及其表达载体和工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种表达基因工程人白细胞介素4(rhIL－4)的表达载体pK223－3m－hIL－4,还公开了用该表达载体转化的大肠杆菌DH5α,以及用上述表达载体和/或宿主细胞发酵表达、纯化人基因工程白细胞介素4的工艺方法。用本发明可表达载体及工程菌可高获得IL－4的高表达,并通过复性及纯化获得人IL－4纯品,且获得的基因工程IL－4比活性高。
Description
本发明涉及利用重组DNA技术生产蛋白质或多肽药物的领域，更具体地，本发明涉及基因工程人白细胞介素4(Interleukin-4，IL-4)的制备方法，还涉及有关的表达载体和工程菌。
白细胞介素4是一种由辅助性T细胞(Th细胞)产生的细胞因子，能作用于体内的多种细胞包括B细胞、T细胞、巨噬细胞等，能增强IgE介导的体液免疫和杀伤细胞的杀伤能力。
IL-4属于Th2细细胞产生的特征性细胞因子，对多种免疫活性细胞的功能具有明显的作用可增强机体的体液免疫(特别是IgE反应)及特异性和非特异性的细胞免疫功能。对B细胞，IL-4是IgE的特异性诱导剂，IL-4还能增加B细胞表达MHC-II类分子、LFA1、LFA3和CD23(低亲和力IgE受体)，并能能维持抗原活化B细胞的生长和扩增。对T细胞，IL-4能诱导TCR/δ前T细胞分化。在一定条件下可维持胸腺细胞和活化T细胞生长，诱导活化T细胞表达CD23。IL-4还能增加抗原特异性CTL的活性。对NK细胞，IL-4能诱导其增殖。IL-4对造血功能也有一定影响，能增加G-CSF诱导的粒细胞集落，增加EPO诱导的红细胞集落，增加IL-6诱导的红细胞和粒/单核细胞集落，增加IL-3诱导的嗜碱/肥大细胞集落等。IL-4能通过增加呼吸爆发增强中性粒细胞的吞噬功能；增加中性粒细胞表达膜结合型和可溶性IL-1RII，这种作用与IL-4的抗炎效应有关。IL-4能增强单核巨噬细胞表达MHC-II类分子、LFA-1、CD23；减少CD14和FcγR(CD64、CD32和CD16)表达。阻断巨噬细胞介导的ATCC(抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)但不影响细胞吞噬。抑制单核细胞自发释放或被诱导释放细胞因子(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN)的能力，但增加细胞释放IL-1受体拮抗因子，IL-4还能诱导单核细胞凋亡；抑制单核细胞分泌胶原酶，从而降低细胞对细胞外基质的降解作用；抑制细胞释放超氧化离子和PGE2。这些作用说明IL-4是有效的抗炎因子。
树突状细胞(DC)是已知的机体内功能最强的抗原提呈细胞(antigen-presenting cells，APC)，是目前发现的唯一一种能直接激活初始型T细胞的APC。DC在激活、启动机体免疫应答尤其是细胞免疫应答反应中起着十分重要的作用。作为肿瘤细胞与特异性免疫效应细胞之间的“桥梁”，DC所具有的处理、加工和提呈抗原的功能在肿瘤抗原诱导宿主免疫反应，尤其是T细胞介导的抗肿瘤免疫功能的过程中所发挥的作用极为重要。近年来，随着对DC研究的不断深入，尤其是DC大量扩增技术的建立，以DC为基础的肿瘤特异性免疫治疗和基因治疗的研究成为相当热门的研究课题，并显示出良好的基础研究及临床应用前景，有望为肿瘤的治疗提供新的途径。在该方面最引人嘱目的研究工作是应用抗原或抗原多肽在体外冲击致敏(pulsing)DC，然后将之回输或免疫接种至荷瘤宿主，进行的肿瘤免疫治疗，临床试验已证明该疗法能显著地诱导机体产生抗原特异性CTL，产生保护性免疫反应并能治疗肿瘤患者。目前常用的培养扩增人树突状细胞的方法需要加入人白细胞介素4，因此基因工程人白细胞介素4在树突状细胞介导的肿瘤的免疫治疗中有着广泛的应用前景。
由于IL-4具有多方面生物学功能，其临床适应症较广。IL-4可发挥其抗肿瘤作用而用于某些肿瘤的治疗；IL-4的抗炎作用可能在某些炎症或自身免疫病中有治疗价值，如应用于关节炎的治疗；IL-4增加抗HBV特异性抗体产生的作用也有应用价值；IL-4还可能成为防治糖尿病的药物。目前国外应用基因工程IL-4治疗肿瘤已进入I期和II期临床试验。
国内外有关IL-4的表达和纯化研究工作亦有数家报道，但是目前IL-4的表达量不高，一般均在为菌体蛋白的5-10％，特别是由于IL-4的本身的生物学特性，使得从原核表达产物中复性较困难，复性得率较低(通常小于10％)，活性较差。制备后的IL-4的比活性一般为1.0-3×106单位/毫克，很难满足肿瘤免疫治疗的临床研究需求。因此用何种表达载体和宿主细胞来表达IL-4，提高复性得率，一直是本领域技术人员研究的焦点所在。
因此，本发明的目的就是提供一种高效地制备基因工程人白细胞介素4的方法(包括分离纯化工艺)，以及有关的载体和宿主细胞。
在本发明的第一方面，提供了一种表达基因工程人白细胞介素4的表达载体，该载体为含有人白细胞介素4序列的原核pK223-3m载体，且人IL一4编码序列位于pL和rrnBT1T2序列之间。
较佳地，该载体是pK223-3m-hIL-4，其结构如图2所示。
在本发明的第二方面，提供了一种宿主细胞，其特征在于，它被本发明所述的载体所转化。较佳地，所述的宿主细胞是原核细胞，如大肠杆菌。
在本发明的第三方面，提供了一种制备人白细胞介素4的方法，该方法包括：
在适合表达IL-4的培养条件下，培养权利要求3中所述的大肠杆菌宿主细胞，从而表达出IL-4；
分离纯化出IL-4，得到所表达的人白细胞介素4。
较佳地，分离纯化包括以下步骤：
(a)制备包含体；
(b)洗涤包含体；
(c)溶解包含体，
(d)复性；
(e)阳离子交换；
(f)凝胶过滤。
此外，在一实施例中，复性步骤如下：
在溶解的包含体中，加入2-4倍体积的甘油，充分混匀后，加入4-8倍体积的复性液进行稀释复性，并静置0.5-24小时，其中该复性液配方含有20-250mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mM GSSG。
更佳地，该复性液配方如下：50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.0；0.1M NaCl；2mM GSH/2mM GSSG，且静置时间为2-5小时。
附图包括：
图1是编码人IL-4的核苷酸序列。
图2是pK223-3m-hIL-4载体的构建示意图，其中将人IL-4 cDNA克隆入pK223-3m载体，形成表达载体pK223-3m-hIL-4。
图3为用pK223-3m-hIL-4转化的DH5α发酵后rhIL-4表达量的电泳照片。其中泳道M为分子量标记；泳道1-3分别连续三批发酵后rhIL-4的表达结果。
图4是基因工程人IL-4纯化过程的阳离子交换图谱。
图5是基因工程人IL-4的凝胶过滤图谱。
图6是纯化后基因工程人IL-4的SDS-PAGE电泳鉴定照片。其中泳道1-3为三批纯化的rhIL-4(非还原型)；泳道M为低分子量标准蛋白；泳道4-6为三批纯化的rhIL-4(还原型)。泳道7为国外标准品(见图6)。
本发明的发明人发现，通过将编码hIL-4的核苷酸序列克隆入一种载体即pK223-3m，可十分高效地表达基因工程人IL-4。通过优化培养及制备工艺，完成了本发明。
在一个较佳例子中，结合特别设计的分离纯化重组IL-4过程，充分体现出本发明的表达载体和/或工程菌的高效性。特别是纯化过程通过优化IL-4的复性过程，使纯化IL-4的得率大大提高。
表达载体pK223-3m的元件来源于pK223-3(Pharmacia公司，GenBank登录号：M77749)和pJL6这两个载体，经构建后重命名为pK223-3m；其中主要包括基因的转录启动子-λ噬菌体的PL启动子，以及控制该启动子的温度敏感的阻抑蛋白cIts857，这一对元件构成基因转录启动元件；其它的元件则包括质粒复制启动子、抗氨苄青霉素的抗性基因以及调节转录终止的元件。插入人IL-4基因后命名为pK223-3m-hIL-4，其中人白细胞介素4的序列如图1所示，表达载体的结构如图2所示。
本发明新型的表达载体是这样构建的：采用中国人外周血单个核细胞作为人IL-4基因的来源，采用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法获得编码人IL-4 cDNA；将人IL-4 cDNA克隆到原核表达载体pK223-3m中；经核酸测序证明，人IL-4序列正确，在该载体中，人IL-4基因的转录受到cIts857启动子的控制。该重组表达载体命名为pK223-3m-hIL-4；
采用大肠杆菌DH5α作为宿主细胞，用载体pK223-3m-hIL-4转化DH5α细菌，经过反复筛选和表达分析，获得高表达人IL-4的生产菌株DH5α/pK223-3m-hIL-4。
可用于本发明的宿主细胞宜为原核细胞，更佳地为大肠杆菌，最佳地为大肠杆菌DH5α菌株。
表达载体的转化可采用常规的方法，如氯化钙法、电穿孔法等。选用的培养基可以是本领域的常规使用的培养基。
在本发明中，可用多种常规方法使携带表达载体的菌株表达IL-4。在下面的实施例4给出了一个优选方案。在一级种子培养中，采用LB培养基，培养时间一般为12-16小时，收获时的OD600光吸收应大于约0.6，一般为0.6-0.8。在二级种子培养中，采用2YT培养基，培养时间一般为12-16，收获时的OD600光吸收应大于约2.0。在发酵罐培养中，当收获时的OD600光吸收大于约3.0时，可升高温度以诱导IL-4在热诱导调控元件下进行表达。诱导时间一般为2-6小时，较佳地为2.5-4小时。收获时OD600光吸收一般应大于约5.0，一般为4.5-5.5。这样，获得的IL-4表达量一般占菌体中蛋白的20-30％。
表达蛋白后的分离纯化步骤，一般包括以下步骤：(a)制备包含体，(b)洗涤包含体，(c)溶解包含体，(d)复性，(e)阳离子交换柱层析和(f)凝胶过滤柱色谱。
本发明的另一改进之处在于复性步骤。一种优选的复性步骤如下：在溶解的包含体中，加入2-4倍体积的甘油，充分混匀后，加入4-8倍体积的复性液进行稀释复性，并静置0.5-24小时，其中该复性液配方含有20-250mMNa2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mMGSSG。更佳地，该复性液配方如下：50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.0；0.1MNaCl；2mM GSH/2mM GSSG，且静置时间为2-5小时。
纯化工艺可采用本领域中常规使用的纯化工艺，也可采用本发明人专门设计的纯化工艺，其中纯化工艺包括包含体制备、洗涤包含体(任选步骤)、溶解包含体、复性、阳离子交换、凝胶过滤等步骤。一种纯化方案是用工程菌DH5α/pK223-3m-hIL-4，在发酵条件下进行发酵，收集菌体通过包含体的制备，复性后转换缓冲液，进行CM Sepharose FF柱层析，Sephacryl S-200凝胶过滤纯化制成半成品，用本发明人选择的工艺进行纯化，最终可获得纯度大于95％基因人白细胞介素4制品。
本发明的优点在于：
(1)表达量高。目前，现有技术中人IL-4的重组表达量占菌体总蛋白的5-10左右，本发明通过优化表达载体并结合培养发酵条件，使其表达量高达30％。
(2)复性得率高：采用其它方法复性得率＜10％，本发明通过对复性液的改进，优化复性条件，使复性得率提高至35％以上。
以下结合实施例和附图，来进一步详细地阐述本发明。下列实施例用于说明目的而并非用于限制本发明范围。实施例1、hIL-4 cDNA的克隆
天然成熟的人白细胞介素4由129个氨基酸组成。
本发明人通过反转录PCR从中国人的健康成人外周血单个核细胞中克隆出人白细胞介素4的cDNA。
本发明所采用的上游引物为：
5’-AATGCACAAGTGCGATATCACCT-3’，
下游引物为：
5’-CG
GGATCCTCAGCTCGAACACTTTGAA-3’(含BamHI酶切位点)。
RT-PCR按常规方法进行，得到的PCR产物被直接克隆至pK223-3m载体，进行DNA测序，
测序引物为：
5’-CTTTGGGGTGTGTGATAC-3’
DNA的测序证实，本发明人所克隆的人白细胞介素4 cDNA序列是正确的(图1)。实施例2、表达IL-4原核载体的构建
在该实施例中所采用pK223-3m原核载体含有PL启动子，热诱导表达调控元件cIts857等元件。
对实施例1制备的pK223-3m-hIL-4载体即可直接用于诱导表达。经酶切鉴定，pK223-3m-hIL-4载体的酶切图谱正确，含有所插入的rhIL-4 cDNA序列(图2)。实施例3.IL-4表达工程菌的建立及其鉴定
在该实施例中，将pK223-3m-hIL-4载体转化至大肠杆菌DH5α，从而建立表达人IL-4的转化的宿主细胞(工程菌)DH5α/rhIL-4。
获得的原始工程菌菌种用含15％甘油的LB培养基保存于-70℃，每支1.0ml。工程菌在LB软琼脂平板上生长呈典型的大肠杆菌菌落特征。为检查工程菌的稳定性，每传20代作一次酶切图谱分析，结果与原始菌种一致，这证明本发明中的工程菌是很稳定的。
该工程菌于2001年4月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，中国，武汉，保藏编号为CCTCC No.M201009。实施例4.发酵(a)种子培养
将菌种0.1ml接种入含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(一级种子培养基)，在摇床中30℃、200rpm培养12-16小时，在OD600光吸收为大于0.6时(在该例子中为0.8)进行收取。
取一级种子培养基中扩增后的种子2.5ml，接种入含250ml二级种子培养基(同发酵培养基)的1L培养瓶中，在摇床中30℃、200rpm培养12～16小时，在OD600光吸收应大于2.0时(在该例子中为2.2)。发酵罐培养
发酵培养基以M9基本培养为基础，添加其它物质，其配方如下：
酪蛋白水解氨基酸 5.0g/L
Na2HPO4 6.0g/L
KH2PO4 3.0g/L
NaCl 3.0g/L
NH4Cl 0.5g/L
用NaOH调PH值至7.2，高压灭菌。
添加以下微量元素配方：
FeCl3 125mM
MnSO4 20mM
ZnSO4 20mM
CuSO4 20mM
CoCl2 20mM
H3BO3 20mM
Na2MoO4 20mM
上述物质分别溶解于1N HCl中，过滤除菌。
临用前无菌加入下述物质：
1M MgSO4 1ml/L
0.1M CaCl2 1ml/L
1mg/ml硫胺素 1ml/L
葡萄糖 5g/L
微量元素 1ml/L
100mg/ml氨苄青霉素 1ml/L
工作体积为10L的发酵罐，接种入500ml培养好的二级种子培养液，开始发酵。发酵参数设置如下：
搅拌速率： 200-600rpm
通气量： 2.0L/分钟
罐压： 5.0PSI
溶解氧： 30％
PH值控制： 6.5
温度： 32.0℃
发酵中用NH4OH控制PH值；产生过量泡沫时，用Antifoam 204(Sigma)0.2ml消泡；溶氧控制为与搅拌速率级联，溶氧低于30％时自动加快搅拌速度，以满足氧的供应。发酵过程中测定OD600光密度值，监测细菌的生长情况，OD600光密度值为3.0左右时，开始升温至42℃，诱导细菌表达IL-4。
诱导表达4小时后，此时OD600值为5.5-6.5时收获菌体，这相当于菌体湿重为5～8克/升发酵终产物。IL-4表达量为菌体总蛋白的30％(图3)。4℃离心收集菌体，保存于-20℃备用。实施例5.基因工程人IL-4的纯化包含体制备
取实施例4中发酵好的冻存菌体25克，加入50mM Tris 2mM EDTA pH8.3缓冲液250ml，待样品融化后制成悬液，9000rpm离心15分钟收集菌体。
加入含50mM Tris 2mM EDTA pH8.3缓冲液500ml，制成悬液后，静置20分钟。
冰浴下超声，功率300W，占空比为50％，每个循环30秒，总时间为15分钟，处理样品体积为250ml，超声粉碎的细菌经革兰氏染色后，4℃、9000rpm离心20分钟，收集沉淀。
在收集的沉淀中，加入2M尿素、50mM Tris 2mM EDTA pH8.3缓冲液200ml，制成悬液，室温下搅拌洗涤30分钟。4℃、7000rpm离心20分钟收集菌体。
再加入2M尿素、50mM Tris 2mM EDTA PH8.3缓冲液200ml，制成悬液，室温下搅拌洗涤30分钟。4℃、7000rpm离心20分钟收集菌体。
加入50mM Tris 2mM EDTA PH8.3缓冲液200ml，制成悬液，室温下搅拌洗涤30分钟。
最后按上述方法用50mM PB 1mMEDTA PH7.0搅拌洗涤菌体一次，离心收集沉淀。溶解包含体
在如上制备的包含体中，加入6M盐酸胍、10mM DTT、1mM EDTA、50mMTris/HCl，pH＝9.0的溶液(按每克包含体加入10ml)，吹打，充分搅拌，直至包含体完全溶解。4℃、9000rpm离心30分钟，取上清备用。复性
取上述溶解后的包含体，加入3倍体积的甘油，充分混匀后，在室温下静置30分钟。然后用5倍体积的复性液进行稀释复性得，室温下静置4小时。
复性液的成分如下：
50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.0
0.1M NaCl
2mM GSH/2mM GSSG
4℃、9000rpm离心30分钟，取上清备用缓冲液转换
取上述复性后组分，超滤浓缩至原体积的1/10，然后加入10倍体积的50mM柠檬酸缓冲液，PH＝5.4，继续超滤浓缩至1/10体积。重复一次后，所得的样品经4℃、9000rpm离心30分钟，取上清备用。阳离子交换柱层析
层析柱为CM-Sepharose FF 2.6×10cm，样品为上述的包含体溶解液，缓冲液为A为50mM柠檬酸，PH＝5.0，缓冲液B为含2M NaCl的50mM柠檬酸，PH＝5.0。
上样后采用NaCl线性梯度洗脱，收集各组分，SDS-PAGE鉴定后，合并含IL-4的组分进行下一步纯化(图4)。凝胶过滤柱层析
上述组分采用凝胶过滤柱层析进一步纯化，方法如下：层析柱为SephacrylS2002.6×100cm，缓冲液为50mM PB PH7.0，流速为60ml/小时，上样量为柱体积的1/10，收集蛋白峰。层析图如图5所示。冻干
上述制备的基因人IL-4纯品，用20mM谷氨酸，PH＝7.0，0.1M NaCl溶液稀释到终浓度100ug/ml，加入甘露醇至终浓度2％，人血白蛋白至终浓度0.1％。分装至西林瓶中，冷冻干燥后制成基因工程人IL-4成品。该制品可以-20℃保存2年而无明显的活性丧失。实施例6 基因工程人IL-4的鉴定和活性测定
用常规方法进行SDS-PAGE电泳测定：纯化后的IL-4进行常规SDS-PAGE电泳，银染后扫描测得IL-4为单一条带。图6是纯化后基因工程人IL-4的SDS-PAGE电泳鉴定照片。其中泳道1-3为三批纯化的rhIL-4(非还原型)；泳道M为低分子量标准蛋白；泳道4-6为三批纯化的rhIL-4(还原型)。泳道7为国外标准品(见图6)
用常规方法进行N末端氨基酸残基测定：N端15个氨基酸鉴定结果与天然的IL-4完全一致，为MetHisLysCysAspIleThrLeuGlnGluIleIleLysThrLeu。
用常规方法进行比活性测定：即采用TF-1依赖株、MTT法测定纯化的IL-4活性，测定的活性单位IL-4蛋白质绝对含量之比为比活性(单位为国际标准单位/毫克)。结果表明，采用实施例5方法纯化的IL-4终产品比活性为6.5×106国际标准单位/毫克。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种表达基因工程人白细胞介素4的表达载体，其特征在于，该载体为含有人白细胞介素4序列的原核pK223-3m载体，且人IL-4编码序列位于pL和rrnBT1T2序列之间。
2.如权利要求1所述的载体，其特征在于，该载体是pK223-3m-hIL-4，其结构如图2所示。
3.一种宿主细胞，其特征在于，它被权利要求1所述的载体所转化。
4.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，它是大肠杆菌。
5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，它是大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α/pK223-3m-hIL-4，CCTCC M 201009。
6.一种制备人白细胞介素4的方法，其特征在于，该方法包括：
在适合表达IL-4的培养条件下，培养权利要求3中所述的大肠杆菌宿主细胞，从而表达出IL-4；
分离纯化出IL-4，得到所表达的人白细胞介素4。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，分离纯化包括以下步骤：
(a)制备包含体；
(b)洗涤包含体；
(c)溶解包含体，
(d)复性；
(e)阳离子交换；
(f)凝胶过滤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，复性步骤如下：
在溶解的包含体中，加入2-4倍体积的甘油，充分混匀后，加入4-8倍体积的复性液进行稀释复性，并静置0.5-24小时，其中该复性液配方含有20-250mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝8.0-10.0，0.02-0.2M NaCl，0.5-5mM GSH/0.5-5mM GSSG。
9.如权利要求4所述的方法，其特征在于，该复性液配方如下：
50mM Na2CO3/NaHCO3，PH＝9.0
0.1M NaCl
2mM GSH/2mM GSSG。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，静置时间为2-5小时。
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