CN1380094A - 一枝蒿总黄酮胶囊 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种一枝蒿总黄酮胶囊,是以一枝蒿为原料,将一枝蒿全草粉碎、用乙醇提取、石油醚脱脂、乙酸乙酯萃取、浓缩制成浸膏,其中有效部位总黄酮和酮酸类含量为50－80%;然后将浸膏经真空干燥制成干膏,加入淀粉制成颗粒,经低温干燥,整理后装入胶囊即得成品。该胶囊用于治疗病毒性肝炎和各类肝损伤的口服药,具有剂量小,疗效高,经动物试验及临床观察无毒副作用,治疗总有效率为91.0%。

Description

一枝蒿总黄酮胶囊

                      技术领域

本发明涉及一种由中草药制备一枝蒿总黄酮胶囊，用于主治病毒性肝炎和各类肝损伤病的药。

                      背景技术

病毒性肝炎、肝损伤是损害人类健康的疾病，其中病毒性肝炎是严重危害人类健康的全球性传染病，病人预后差，大多数病人转为慢性，可能发展成肝硬化等。病毒性肝炎引起的肝损伤主要由机体免疫应答反应所介导，当病毒激活机体免疫系统后，产生致敏淋巴细胞和特异性抗体，特别是病毒特异性细胞毒性T细胞。它们不但能与体内病毒起反应而加以杀灭，而且也因受病毒感染的肝细胞表面带有病毒抗原而引起肝损伤，导致肝细胞变性肿胀和坏死。目前，对于这类病中西医疗效不十分令人满意。例如，西药干扰素对肝炎病毒消除有一定疗效，但经临床效果不理想，不能杀灭病毒，而且用药时间长，药费较高。中成药类在治疗病毒性肝炎和保肝方面各有所不同，有的中药偏重于清热解毒，有的着重于活血化淤，有的滋补肝肾等，这些药物都各有其不足。临床久服苦寒药物，可伤脾肾，减少食欲、消化及吸收。另外，许多药物必须在肝脏内进行氧化、分解、排泄，有的也可直接导致肝脏损害，反而对肝病痊愈不利。

本发明针对目前在药物治疗肝病中存在的不足，结合中医药和民族医药理论两者之长，研制了一种用于治疗病毒性肝炎和各类肝损伤的口服药一枝蒿总黄酮胶囊。

                      发明内容

本发明目的在于，研制的口服药一枝蒿总黄酮胶囊是以一枝蒿为原料，将一枝蒿全草粉碎、用乙醇提取、石油醚脱脂、乙酸乙酯萃取、浓缩制成浸膏，其中有效部位总黄酮和酮酸类含量为50％-80％；然后将浸膏经真空干燥制成干膏，加入淀粉制成颗粒，经低温干燥，整理后装入胶囊即得成品。该胶囊用于治疗病毒性肝炎和各类肝损伤的口服药，具有剂量小，疗效高，经动物试验及临床观察无毒副作用，治疗总有效率为91.0％。

本发明所述的一枝蒿总黄酮胶囊是以一枝蒿为原料，将一枝蒿全草粉碎、用95％乙醇提取、石油醚脱脂、乙酸乙酯萃取、浓缩步骤制成相对密度为1.10-1.30的浸膏，其中有效部位总黄酮和酮酸类含量为50℃-80％；然后将浸膏经真空干燥制成干膏，加入淀粉制成颗粒，经低温干燥，整理后装入胶囊即得成品。

一枝蒿总黄酮胶囊的制备方法，按下例步骤进行：

a、首先将一枝蒿全草粉碎成粉末，用95％的乙醇回流提取三次，回流温度70℃-80℃，将提取后的醇提液用石油醚进行脱脂，过滤，滤去石油醚层，保留其残留物；

b、将保留的残留物用乙酸乙酯进行萃取三次，萃取温度为常温，过滤，滤去乙酸乙酯不溶物，将其余的乙酸乙酯层用0.5％-1％活性炭进行脱色，减压浓缩成相对密度为1.10-1.30的浸膏，该浸膏的有效部位为总黄酮和酮酸类，其含量为50％-80％；

c、然后将浓缩后的浸膏经40℃-60℃真空干燥得干膏，将干膏加入淀粉调制成颗粒，经40℃-60℃低温干燥，整理，装入胶囊即得成品。

本发明所述的一枝蒿总黄酮胶囊，其中一枝蒿的药理性能为：

一枝蒿Artemisia rupestris L.的干燥全草。七、八月采割、晒干。本品全长10-50厘米。根和根茎圆柱形，土黄色至灰褐色，长带少数短须根，断面浅黄色。茎单一或数个，于根茎处弯曲，直径1.5-3厘米，幼枝和花枝上部密被短绒毛，老枝或枝的下部光滑，又不显著的细条纹，表面常为紫红色，断面白色，中空。功能与主治：清热解毒，健胃消食，祛风活血。用于感冒、过敏、食积、蛇伤、疮疖。

本发明所述的一枝蒿总黄酮胶囊的药理学研究：

一枝蒿是维吾尔医常用药材，文献报道一枝蒿全草含有黄酮类、酮酸类、氨基酸、甙类、多糖类、挥发油、多肽、生物碱等化合物。我们分析了一枝蒿有效成分，并在此基础上进行了一枝蒿总黄酮胶囊的保肝作用、治疗免疫性肝炎、抗氧化、抗过敏作用研究及诱导人肝癌细胞凋亡时p53与Bcl基因的表达等实验研究，并采用电子顺磁共振方法检测一枝蒿总黄酮胶囊对O₂ ^-°、OH°的抑制作用，旨在阐明该药防治疾病的科学内涵。一、实验材料

1.药物：一枝蒿总黄酮胶囊由本发明提供。

2.试剂：磷酸组胺，中国科学院上海生物化学研究所产品；冻干皮内注射用卡介苗，兰州生物制品研究所产品；天花粉，新疆医科大学基础医学院药理教研室提供；四氯化碳，北京市新光化学试剂厂产品；D-氨基半乳糖氨盐酸盐，北京科技协作中心精细化学分部产品；脂多糖，SIGMA公司产品；5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氮化物(DMPO)购自美国Sigma公司。二甲基亚砜(DMSO)，化学纯试剂，上海硫酸厂产品。氢氧化钠，分析纯试剂，上海试剂三厂产品。NaH₂PO₄，K₂HPO₄，H₂O₂，FeSO₄.7H₂O，EDTA，均为国产分析纯试剂。QGY-7701(人肝癌)细胞，由中科院上海细胞生物所细胞库提供；焦碳酸乙二脂(DEPC)、随机引物(Oligo[dT]₁₅Primer)、脱氧核糖核酸酶抑制剂(Rnasin)、脱氧核苷三磷酸(dNTP)均为Promega产品；反转录酶(M-MuLV ReverseTranscriptase)，MBI Fermentas产品；Taq DNA聚合酶(5u)、PCR扩增缓冲液，上海生工(Sangon)产品；Marker(φχ174/Hinc IIdigest)为日本(TOYOBO)公司产品。

3.动物：Wistar大鼠、体重200±20g，二级；NIH小鼠，体重20±1.4g，二级，雌雄个半，均购自自治区卫生厅医学实验动物中心。

4.仪器：721-型分光光度计，上海第三分析仪器厂；Vital-200型全自动生化测定仪，荷兰威图公司产品；ER200D-SRC型电子顺磁共振仪及ER4111-VT变温装置，德国Bruker公司产品；PCR热循环仪(Gene Amp PCR System 9700型)，Perkin-Elmer公司；紫外光度仪(Gene Quant^TM II RNA/DNA Calculator型)，Amersham pharmaciabiotech公司。二、方法与结果(一)一枝蒿总黄酮胶囊抗过敏研究1.对同系大鼠被动皮肤过敏反应(PCA)的影响

取健康雄性大鼠5只，各鼠每足跖注射0.1ml天花粉-氢氧化铝凝胶混悬液(5mg/ml)，同时ip 0.1ml卡介苗强化，15天后心脏取血，离心得到抗血清。用前将抗血清用生理盐水稀释10倍。另取大鼠安表1随机分组，在各鼠背部脱毛处皮下注射抗血清0.1ml致敏，共3点。48h后iv 5me(5mg)天花粉的0.5％伊文思蓝溶液进行攻击。于致敏前1天开始给药，连续给药3天。抗原攻击后0.5h，断头处死大鼠，将皮肤蓝斑消化，离心，取上清液用分光光度计测定吸收度(A)。结果见表1。

表1  一枝蒿总黄酮胶囊对大鼠PCA反应的影响( X±SD)组别          动物数    剂(g/kg)   吸收度A         抑制率(％)空白对照组    5         -          0.96±0.14      -地塞米松组    5         0.01       0.04±0.02^***  95.8给药组        6         0.50       0.38±0.07^***  60.1给药组        6         1.00       0.11±0.02^***  88.5与空白对照组比较^***p＜0.01。AR表示一枝蒿

结果表明，一枝蒿总黄酮胶囊具有明显的抑制同系大鼠PCA反应的作用，而且浓度与抑制作用之间存在正比依赖性关系。2.对组胺所致毛细血管通透性增加的影响

取大鼠26只，ig给药，每日一次，共5天，于末次给药后15h大鼠背部剪毛处皮内注射磷酸组胺生理盐水溶液0.1ml(750μg/ml)，每鼠2点，同时iv 1ml 0.5％伊文思蓝溶液，0.5h后断头处死大鼠，按PCA方法测定皮肤各反应点的吸收度(A)。结果见表2。表2  一枝蒿总黄酮胶囊对磷酸组胺所致毛细血管通透性增加的影响

                         ( X±SD)组别            动物数   剂量(g/kg)   吸收度A          抑制率(％)空白对照组      7        -            0.92±0.29       -地塞米松组      6        0.01         0.38±0.11^***   58.7给药组          7        0.50         0.73±0.16^***   20.6给药组          6        1.00         0.70±0.22^***   23.6与空白对照组比较^***p＜0.01。

结果表明，一枝蒿总黄酮胶囊具有明显的抑制组胺所致毛细血管通透性增加的作用，而且浓度与抑制作用之间存在正比依赖性关系。3.对大鼠同种细胞抗体介导的肥大细胞脱颗粒的影响

取大鼠5只，按PCA方法制备大鼠抗天花粉血清。另取大鼠5只，制备大鼠肠系膜标本，每鼠10块，每块1cm²，放入台氏营养液2ml，肠系膜标本1块及大鼠抗天花粉血清0.2ml，37℃水浴温育0.5h后用37℃台氏营养液冲洗标本3次，再加台氏营养液2ml，37℃水浴温育10min，按表3剂量向管内加药，继续温育10min，加天花粉抗原0.1ml(1.1mg/ml)攻击，37℃温育20min后将标本用甲醛固定，常规染色及封片，用显微镜观察并计数肥大细胞脱颗粒情况。结果见表3。

表3一枝蒿总黄酮胶囊对大鼠同种细胞抗体介导的肥大细胞响

                         ( X±SD)组别          动物数(只)  剂量(μg/ml)   脱颗粒率(％)   抑制率(％)空白对照组    10          -              71.7±8.2      -地塞米松组    10          50             34.2±9.6^***  52.9给药组        10          50             30.1±8.7^***  30.1给药组        10          100            35.8±7.6^***  50.1与空白对照组比较^***p＜0.01。

结果表明，一枝蒿总黄酮胶囊对大鼠同种细胞抗体介导的肥大细胞脱颗粒有抑制作用，随药物浓度的增加，抑制作用也随着增加。(二)一枝蒿总黄酮胶囊的保肝抗肝炎作用研究1.一枝蒿总黄酮胶囊对四氯化碳致小鼠急性肝损伤的保护作用

取昆明种小鼠60只，按表1随机分成6组，ig给药，每日1次，共7天。末次给药后1h，除空白对照组外其它各组小鼠ip0.1％四氯化碳花生油溶液10ml/kg。24h后眼球取血，常规分离血清，测定ALT含量，结果见表4。表4 一枝蒿总黄酮胶囊对四氯化碳致肝损伤小鼠血清ALT的影响

                       ( X±SD)组别            动物数(只)    剂量(g/kg)    ALT(iμ/L)空白对照组      9             -             34.06±11.60肝损伤模型组    9             -             128.80±57.36^Δ干草甜素片组    9             0.3           18.86±8.81^***小剂量给药组    9             1.0           42.74±25.69^***中剂量给药组    9             2.0           21.81±7.43^***大剂量给药组    9             4.0           16.98±7.98^***注：与空白对照组比较^Δp＜0.01，与肝损伤模型组比较^***p＜0.01。

结果表明，一枝蒿总黄酮胶囊明显降低CCl₄致肝损伤小鼠的血清ALT含量(p＜0.01)，作用优于干草甜素片。2.一枝蒿总黄酮胶囊对四氯化碳致大鼠急性中毒性肝损伤的保护作用

取Wistar大鼠42只，按表2随机分成6组，ig给药，每日1次，共7天。给药后第3天、第7天除空白对照组外其它各组大鼠sc 25％四氯化碳0.5ml/100g。末次给药12h后处死大鼠心脏取血，常规分离血清，测定ALT含量，结果见表5。表5 一枝蒿总黄酮胶囊对四氯化碳致急性中毒性肝损伤大鼠血清ALT

                    的影响( X±SD)组别            动物数(只)    剂量(g/kg)    ALT(iμ/L)空白对照组      7             -             20.50±12.82肝损伤模型组    7             -             180.0710.40^Δ干草甜素片组    7             0.2           155.67±50.98^*小剂量给药组    7             0.75          147.97±25.78^**中剂量给药组    7             1.5           115.57±35.03^***大剂量给药组    7             3.0           129.63±21.43^***注：与空白对照组比较^Δp＜0.01，与肝损伤模型组比较^*p＞0.05，^**p＜0.05，^***p＜0.01。

结果表明，不同剂量的一枝蒿总黄酮胶囊明显降低CCl₄致急性中毒性肝损伤大鼠的血清ALT含量(p＜0.01)，作用优于干草甜素片3.一枝蒿总黄酮胶囊对D-氨基半乳糖氨盐酸盐致小鼠急性肝损伤的保护作用

取昆明种小鼠60只，按表3随机分成6组，ig给药，每日1次，共7天。末次给药后1h，除空白对照组外其它各组小鼠ip D-氨基半乳糖800mg/kg，24h后眼球取血，常规分离血清，测定ALT含量，结果见表6。

结果表明，不同剂量的一枝蒿总黄酮胶囊明显降低D-氨基半乳糖氨盐酸盐致急性肝损伤大鼠的血清ALT含量(p＜0.01)表6 一枝蒿总黄酮胶囊对D-氨基半乳糖氨盐酸盐致急性肝损伤小鼠

              血清ALT的影响( X±SD)组别             动物数(只)   剂量(g/kg)   ALT(iμ/L)空白对照组       9            -            53.89±19.23肝损伤模型组     9            -            81.13±40.18^Δ干草甜素片组     8            0.15         54.28±10.12^**小剂量给药组     8            1.0          57.38±15.53^**中剂量给药组     9            2.0          56.83±20.60^**大剂量给药组     8            4.0          50.50±17.78^**注：与空白对照组比较^Δp＜0.01，与肝损伤模型组比较^**p＜0.05。4.一枝蒿总黄酮胶囊对小鼠免疫性肝炎的预防作用

取昆明种小鼠51只，♀♂各半，按表4随机分成5组，在iv LPS前5天给药，每日1次，共5天。除空白对照组外其它各组小鼠尾静脉iv BCG 5×10⁶个菌/鼠，12d后再iv LPS 7.5μg/鼠，造成免疫性肝炎模型，10h后眼球取血，常规分离血清，测定ALT含量，结果见表7。结果，一枝蒿总黄酮胶囊在ivLPS前5天给药，对小鼠免疫性肝炎没有预防作用。

  表7 一枝蒿总黄酮胶囊对小鼠免疫性肝炎的预防作用( X±SD)组别            动物数(只)  剂量(g/kg)    ALT(iμ/L)空白对照组      11          -             55.20±8.90肝炎模型组      11          -             79.10±22.80^Δ干草甜素片组    10          0.3           76.90±32.10^*小剂量给药组    10          1.0           72.60±21.90^*中剂量给药组    9           2.0           77.10±21.70^*注：与空白对照组比较^Δp＜0.01，与肝炎模型组比较^*p＞0.05。5.一枝蒿总黄酮胶囊对小鼠免疫性肝炎的治疗作用

取昆明种小鼠51只，♀♂各半，按表5随机分成5组。除空白对照组外其它各组小鼠尾静脉iv BCG 5×10⁶个菌/鼠，10d天后再ivLPS 7.5μg/鼠，造成免疫性肝炎模型。各组小鼠在iv BCG的当天开始ig给药(正常对照组和肝炎模型组小鼠ig等容量的生理盐水)，每日1次，连续11d。在iv LPS 10h后眼球取血，常规分离血清，测定ALT含量，结果见表8。

结果，一枝蒿总黄酮胶囊在ivLPS后继续给药，对免疫性肝炎小鼠的血清ALT含量(p＜0.01)。

表8 一枝蒿总黄酮胶囊对小鼠免疫性肝炎的治疗作用( X±SD)组别            动物数(只)    剂量(g/kg)    ALT(iμ/L)空白对照组      11            -             26.45±11.81肝炎模型组      11            -             31.45±21.83^Δ小剂量给药组    10            1.0           35.70±8.29中剂量给药组    10            2.0           39.00±8.10大剂量给药组    10            5.0           13.36±2.93^***注：与空白对照组比较^Δp＜0.05，与肝炎模型组比较料^***p＜0.01。

以上实验结果表明，一枝蒿总黄酮胶囊对CCl₄或D-氨基半乳糖氨盐酸盐致急性肝损伤有保护作用：并能治疗免疫性肝炎。(三)一枝蒿总黄酮胶囊抗氧化作用研究1.对O₂ ^-°的抑制作用

在室温下，将含有饱和空气的DMSO与H₂O、NaOH溶液定量混匀。NaOH一经加入即计时，反应30min。测量前，定量吸取反应液于直径3mm的玻璃样品管内，在温度130K时进行ESR测定，此时可检测到O₂ ^-°的特征信号，此作为空白对照管。当检测样品与O₂ ^-°作用时，加入一定量的样品药液(5％100％)于产生O₂ ^-°的模型体系中，其它条件同前。

EPR操作参数：测试温度(TE)130K，微波频率(SF)9.67GHz，微波功率(SP)20mW，调制频率(MF)，调制幅度(MA)5.0G，时间常数(TC)500ms，扫场时间(TI)100s，中心磁场(CF)3360G，扫场宽度(SW)300G。2.对OH°的抑制作用

利用Fenton反应产生OH·自由基，反应体系中DMPO终浓度100μM，PH7.4 NaH₂PO₄/K₂HPO₄缓冲液终浓度40mM，H₂O₂终浓度100mM，样品药液(注：作为标准时则加100μl H₂O)5％-100％，FeSO₄.7H₂O+EDTA混和液终浓度300μM，操作时在塑料管依次加入DMPO，缓冲液，H₂O₂，药液(或水)，最后加Fe²⁺引发反应，5min后进行EPR测量。

EPR操作参数：SW＝100G，SF＝9.82GHz，MF＝100kHz，MA＝0.8G，TE＝297K。结果：根据所测得EPR波谱信号，计算样品与自由基之间的相互作用因子E。根据E的变化情况，判断样品各浓度对自由基的增抑作用。结果见表9、图1。表9 一枝蒿总黄酮胶囊对O₂ ^-°、OH°自由基的增抑作用(浓度与相互作

                      用因子E的关系)

                           相互作用因子E样品浓度(g/ml)

             超氧阴离子自由基     羟自由基0.10             -0.9999              -0.98890.08             -0.9999              -0.98850.06             -0.4858              -0.95770.04             -0.3053              -0.90200.02             0.9655               -0.73270.01             0.8963               -0.66590.005            0.4825               -0.4855

由表9、图1可见，一枝蒿总黄酮胶囊对O₂ ^-°的作用表现为高浓度抑制、低浓度增加的作用。但对OH°自由基表现为浓度依赖性地抑制作用，浓度(M)与相互作用因子(E)之间的回归关系为：E＝-1.4199-0.1709 lnM(r＝0.9887)，IC₅₀＝0.00460g/ml。(四)一枝蒿总黄酮胶囊调节人肝癌细胞凋亡基因p53、Fas和Bcl-2

的表达

1.引物序列  按文献及Gen Bank库中p53基因序列设计了两条引物，p1：5′-GGTCGACTGACACGCTTCCCTGGATTGG-3′，p2：5′-GGATCCTGCTTCTGACGCACACCTATTG-3′(295bp fragment)。按文献[1]设计了Bcl-2及Fas基因序列：Bcl-2为5′-GCGTCAACCGGGAGATGTCGCCC，3′-TTTCTTAAACAGCCTGCAGCTTTG(348bp fragment)；Fas为5′-GTACAGAAAACATGCAGAAAGCAC，3′-CTCTGCAAGAGTACAAAGATTGGC(342bp fragment)。

2.mRNA提取并反转录：收集的细胞用PBS溶液洗2次，200ul RNA提取缓冲液离心弃去未裂解细胞和细胞核组成的沉淀，上清用50μg/ml的蛋白酶K，37℃消化30min。然后，加1体积的水饱和酚和0.2体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)。离心后用异丙醇沉淀RNA并在-20℃下至少放1h，离心沉淀RNA，用70％的乙醇洗一遍，真空干燥并用DEPC水重溶RNA。向20μl的反转录缓冲液中加2μl单链[dT]₁₅引物，2.5μl dNTP(各10mmol/L)，0.5μlRNasin(1000u/ml)，然后，70℃加热5min，冰上冷却。简短离心后加1.2μl Moloney MuLV病毒反转录酶(GIBCO公司)并37℃下保温1h，90℃变性5min，得到的cDNA样品保存于-70℃。

3.PCR扩增：0.2ml的基因扩增体系含2.5μl cDNA，50mmol/L KCL，10mmol/L Tris-HCl，2.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTPs，0.5mmol/L 5′→3′寡核苷酸引物及2.5u Taq酶(Sangon)。PCR反应进行30个循环，并在94℃变性30s，在每个引物相应的退火温度上退火并在72℃中延伸2min。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，并用去离子水设阴性对照组。照象系统用正/反665底片，DNA带用溴化乙锭染色后在紫外灯下显像。

5.结果：本研究以肝癌细胞为模型应用高度敏感的RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)方法研究凋亡基因表达水平，结果显示5μg/ml、10μg/ml的一枝蒿总黄酮胶囊处理肝癌细胞24h、36h及72h时有大量的p53(图1：4、7号泳道，图2：2、3、4、5号泳道)基因表达，而bcl-2与Fas基因未见表达(图1：2、3、5、6号泳道，图2：6、7、8、9、10、11、12、13号泳道)，同样药物处理前上述三种基因均未见表达(图2：14、15、16号泳道)。

6.研究发现，一枝蒿总黄酮胶囊作用于肝癌细胞后，Fas基因与Bcl-2基因没有表达，而野生型p53基因表达增强。与细胞调亡密切相关的野生型p53基因的表达增加，与细胞分化和增殖有关的Bcl-2基因未表达，说明AR有效部位可能激活肝癌细胞凋亡基因而使细胞发生凋亡。

(五)研究表明，一枝蒿总黄酮胶囊具有保肝作用、治疗免疫性肝炎、抗过敏，并可诱导肿瘤细胞分化，对肿瘤细胞的增值及DNA的合成有明显的抑制作用，同时对超氧阴离子自由基、羟自由基具有不同程度的抑制作用，药物浓度与抑制作用之间存在正比依赖性关系。

一枝蒿总黄酮胶囊的急性毒性试验

取8只昆明种小鼠，随机分4组，每组2只小鼠，按30％、32％、36％、40％浓度，以0.2ml/10g剂量1次给药，连续观察3天。结果无一死亡。

根据其结果增加给药剂量，计每10克0.4ml，1.5小时内分两次口服，连续观察3天。结果最大全不致死量(D_分钟)为13g/kg，最小全致死量(D_max)为17g/kg。

取昆明种小鼠60只，体重20±1.8g，雌雄兼用，随机分组，每组10只。组件剂量比为1∶1.7，药业按等比(1∶1.07)稀释，按40ml/10g，1.5小时内分两次灌胃给药，每日观察，连续7天。记录动物毒性反应情况和死亡动物分布。结果如下：

剂量(mg/kg)	17000	16000	15000	14000	13000	12000
							死亡数(r/n)	10/10	6/10	2/10	0/10	0/10	0/10

用CASIO fx-180p计算器，程序按Bliss法计算LD₅₀等有关参数。

D	P	Ye	Y	n	W	A	B	Yr	Yr-Y
										17000	1.00	6.96	6.73	10	0.208	10.633	-3.459	6.83	0.10
16000	0.60	5.25	5.53	10	0.581	2.840	3.536	5.48	-0.05
										15000	0.20	4.16	4.26	10	0.532	3.202	3.525	4.04	-0.22
14000	0.00	3.04	2.89	10	0.110	22.736	2.494	2.50	-0.39

|Yr-Y|＞0.2，以Yr代替Y进行第二轮计算：

D	P	Y	n	W	A	B	Yr	Yr-Y
									17000	1.00	6.83	10	0.180	12.666	-5.411	6.89	0.06
16000	0.60	5.48	10	0.581	2.840	3.536	5.48	0.00
									15000	0.20	4.04	10	0.439	4.133	3.344	3.98	-0.06
14000	0.00	2.50	10	0.050	57.051	2.146	2.73	-0.13

|Yr-Y|＜0.2，回归结果满意，计算结果为：LD₅₀＝15673.75mg/kgS₅₀＝0.0052895％可信区间PL＝15304.75-16051.65mg/kg结论：本实验测定结果，一枝蒿总黄酮胶囊的LD₅₀为15674±0.0103mg/kg。

本发明所述的一枝蒿总黄酮胶囊经过对123例患者用药临床观察，其中男80例，女43例；年龄最大的67岁，最小的14岁；病史最长10年，最短1年；对照组60例，其中男34例，女26例；年龄最大63岁，最小15岁；病史最长11年，最短的9个月。全部病例均符合乙型病毒性肝炎的诊断标准。经过用药治疗，其中实验组使用一枝蒿总黄酮胶囊，每日3次，每次3粒，3个月为一疗程。对照组服用肝脾康胶囊，每日3次，每次5粒，3个月为一疗程。治疗结果：用药两个疗程，治疗组123例中显效86例，好转26例，无效4例；对照组60例中显效31例，好转20例，无效9例。治疗组总有效率91.0％；对照组总有效率为85.0％。

                      附图说明

参见附图

图1为本发明抗氧化作用实验中样品浓度与相互作用因子E之间的关系图

图2为本发明调节人肝癌细胞调亡基因p53、Fas和Bcl-2的表达图(24小时)

图3为本发明调节人肝癌细胞调亡基因p53、Fas和Bcl-2的表达图(36小时和72小时)

                     具体实施方式

实施例1

a、首先将一枝蒿全草10kg粉碎成粉末，用5倍95％的乙醇回流提取三次，回流温度70℃，将提取后的醇提液用400ml石油醚进行脱脂，过滤，滤去石油醚层，保留其残留物；

b、将保留的残留物用400ml乙酸乙酯进行萃取三次，萃取温度为常温，过滤，滤去乙酸乙酯不溶物，将其余的乙酸乙酯层用0.5％活性炭进行脱色，减压浓缩成相对密度为1.10的浸膏，该浸膏的有效部位为总黄酮和酮酸类，其含量为50％；

c、然后将浓缩后的浸膏经45℃真空干燥得干膏，将干膏加入淀粉调制成颗粒，经45℃低温干燥，整理，装入胶囊即得成品。

使用一枝蒿总黄酮胶囊，每日3次，每次3粒，3个月为一疗程，总有效率为91.0％，其中对乙型肝炎的总有效率为88.0％，酒精性肝损伤的总有效率为94.0％。

实施例2

a、首先将一枝蒿全草10kg粉碎成粉末，用6倍75％的乙醇回流提取三次，回流温度75℃，将提取后的醇提液用500ml石油醚进行脱脂，过滤，滤去石油醚层，保留其残留物；

b、将保留的残留物用500ml乙酸乙酯进行萃取三次，萃取温度为常温，过滤，滤去乙酸乙酯不溶物，将其余的乙酸乙酯层用0.8％活性炭进行脱色，减压浓缩成相对密度为1.25的浸膏，该浸膏的有效部位为总黄酮和酮酸类，其含量为70％；

c、然后将浓缩后的浸膏经60℃真空干燥得干膏，将干膏加入淀粉调制成颗粒，经50℃低温干燥，整理，装入胶囊即得成品。

使用一枝蒿总黄酮胶囊，每日3次，每次3粒，饭前半小时口服，3个月为一疗程，总有效率为89.0％，其中对乙型肝炎的总有效率为87.0％，酒精性肝损伤的总有效率为91.0％。

实施例3

a、首先将一枝蒿全草10kg粉碎成粉末，用6倍85％的乙醇回流提取三次，回流温度80℃，将提取后的醇提液用600ml石油醚进行脱脂，过滤，滤去石油醚层，保留其残留物；

b、将保留的残留物用600ml乙酸乙酯进行萃取三次，萃取温度为常温，过滤，滤去乙酸乙酯不溶物，将其余的乙酸乙酯层用1％活性炭进行脱色，减压浓缩成相对密度为1.30的浸膏，该浸膏的有效部位为总黄酮和酮酸类，其含量为80％；

c、然后将浓缩后的浸膏经50℃真空干燥得干膏，将干膏加入淀粉调制成颗粒，经60℃低温干燥，整理，装入胶囊即得成品。

使用一枝蒿总黄酮胶囊，每日3次，每次3粒，饭前半小时口服，3个月为一疗程，总有效率为87.0％，其中对乙型肝炎的总有效率为85.0％，酒精性肝损伤的总有效率为89.0％。

Claims (2)

1、一种一枝蒿总黄酮胶囊，其特征在于以一枝蒿为原料，将一枝蒿全草粉碎、用95％乙醇提取、石油醚脱脂、乙酸乙酯萃取、浓缩步骤制成相对密度为1.10-1.30的浸膏，其中有效部位总黄酮和酮酸类含量为50％-80％；然后将浸膏经真空干燥制成干膏，加入淀粉制成颗粒，经低温干燥，整理后装入胶囊即得成品。

2、一种一枝蒿总黄酮胶囊的制备方法，其特征在于按下例步骤进行：

a、首先将一枝蒿全草粉碎成粉末，用95％的乙醇回流提取三次，回流温度70℃-80℃，将提取后的醇提液用石油醚进行脱脂，过滤，滤去石油醚层，保留其残留物；

b、将保留的残留物用乙酸乙酯进行萃取三次，萃取温度为常温，过滤，滤去乙酸乙酯不溶物，将其余的乙酸乙酯层用0.5％-1％活性炭进行脱色，减压浓缩成相对密度1.10-1.30的浸膏，该浸膏的有效部位为总黄酮和酮酸类，其含量为50％-80％；

c、然后将浓缩后的浸膏经40℃-60℃真空干燥得干膏，将干膏加入淀粉调制成颗粒，经40℃-60℃低温干燥，整理，装入胶囊即得成品。

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