CN1365608A - 一种贝类纯系制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种贝类纯系制备方法。步骤:将壳高5～6cm的贝类置于18～23℃水体内,密度为100～200枚/m3,饲以饵料,投喂量为每天18～30万细胞/ml,分5～6次投喂,每天全量换水1次,充天然空气,充气量以水体表面可见微气泡并形成水流为宜,控制光照为400～500Lux,有效积温150～250℃;将经过人工催产达性成熟的个体,在18～20℃条件下阴干1～2小时,然后每个个体分别置于1～2L容器内,再注入升温至24～25℃、照射强度为300～800mwh/L的紫外线处理海水,此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子;获得雌雄配子后进行自体受精;它能简便、快速建立贝类纯系。

Description

一种贝类纯系制备方法
本发明涉及贝类制种技术，具体地说是一种贝类纯系制备方法。
海湾扇贝Argopecten irradians irradians原产于美国大西洋沿岸，左右壳几相等，壳面放射肋18～20条，适温2℃～34℃，适盐为25～34，以浮游植物和有机碎屑为食。在原产地的繁殖期为9～10月份，引种到我国后，可于5～6月和9～10月两次性成熟。幼苗当年秋季可达5cm以上，较大个体7cm。生物学最小型为2.2cm，当年可达性成熟，翌年形成生殖高峰。寿命12～16个月，少数可达24个月。
海湾扇贝为雌雄同体，生殖腺位于腹嵴，精巢位于腹嵴外周缘，卵巢位于精巢内侧。被覆在未成熟生殖腺外表的一层黑膜在成熟过程中逐渐消退，成熟的卵巢为桔红色，精巢为乳白色。精子和卵子进入肾腔后，由外肾孔排入外套腔内，再靠水流作用排出体外，行体外受精。在自然状态下，个体精卵的成熟和排出不同步，多为异体受精。
海湾扇贝于1982年由中国科学院海洋研究所张福绥院士自美国东海岸引入我国，因其生长速度快、养殖效益高，深受广大渔农民的欢迎，在我国形成了世界上第一个海湾扇贝养殖业，并成为我国海水养殖的支柱产业之一。随着海湾扇贝全人工育苗养殖年代的增加，在生产中逐渐暴露出一些问题，如生长速度减缓，个体小型化，严重病害时有发生，如幼虫面盘解体病等。产生上述问题的遗传基础与野生型群体的养殖有关，也与无序的近交导致的遗传衰退有关。
已经在中国形成了巨大产业的海湾扇贝养殖业可持续发展的种质基础是建立适于我国不同海区养殖的性状优良人工品系。而建立人工品系的重要途径之一是建立纯系，通过近交的极端形式—自交是建立纯系的快捷方法。
目前国际上建立贝类纯系的主要方法是雌核发育，如太平洋牡蛎(Guo etal，1996)，皱纹盘鲍(Arai，1988，Li，2000)。虽然雌核发育技术在理论上可以更快地建立纯系，但由于其技术难度较大，而很难在较短的时间内建立起适于不同环境、具有明显性状优势的养殖品系。更何况海湾扇贝从理论上就难以进行有效的雌核发育制备。到目前为止，尚未见到任何有关海湾扇贝纯系研究的报道，在其它贝类也未见到有关采用近交或自交方法建立纯系的报道。
本发明的目的是提供一种简便、快速贝类纯系制备方法。
本发明的技术方案是：利用雌雄同体贝类的生物学特点，通过自交的途径建立纯系，其操作步骤为：
1)种贝促熟：将壳高5～6cm的贝类置于18～23℃水体内，密度为100～200枚/m3，饲以饵料，投喂量为每天18～30万细胞/ml，分5～6次投喂，每天全量换水1次，充天然空气以补充氧气的不足，充气量以水体表面可见微气泡并形成水流为宜，控制光照为400～500Lux；有效积温150～250℃；
2)人工诱导产卵排精：将经过人工促熟达性成熟的个体，在18～20℃条件下阴干l～2小时，然后每个个体分别置于1～2L容器内，再注入升温至24～25℃、照射强度为300～800mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；
3)获得雌雄配子后进行自体受精。
所述使用种贝可以通过人工方法达性成熟，也可在自然条件下自然发育达性成熟；所述催产在比较困难时，采用解剖方法获得精卵，并进行自体受精；所述贝类为雌雄同体贝类；所述饵料为单胞藻。
本发明具有如下优点：
1.能快速建立贝类纯系。由于本发明是利用某些贝类雌雄同体的特征，人为调控雌雄个体性腺成熟时间，促使同一个体的雌雄性腺尽可能同步成熟，以有利于自体受精。在较短的时间内建立起适于不同环境、具有明显性状优势的养殖品系。本发明实验证明：在受精卵培育60天后，扇贝种苗的个体平均大小达到0.2～0.5cm，成活率平均达到10.9％。
2.操作简便，成本低。本发明操作比较简便，不使用特殊的化学试剂，不使用特殊的仪器设备，从而降低了研究成本，容易推广应用。本发明可应用于海湾扇贝和其它雌雄同体贝类。通过建立具不同性状的纯系，或直接进行养殖或在不同纯系间进行杂交使不同性状整合表达后进行养殖。是一种新型贝类制种技术路线。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1
取原分布于美国大西洋近岸水域、现在中国海区进行养殖的海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)种贝100枚，利用海湾扇贝雌雄同体的生物学特点，通过自交的途径建立纯系，其操作步骤为：
1)种贝促熟：将壳高5cm的海湾扇贝置于18℃水体内，密度为200枚/m3，饲以金藻、硅藻、小球藻饵料，投喂量为每天18万细胞/ml，分5次投喂，每天全量换水1次，充天然空气以补充氧气的不足，充气量以水体表面可见微气泡并形成水流为宜，控制光照为400Lux，有效积温250℃，这时，其性腺表面的黑膜即可褪去，其上部为红色，下部为乳白色，表明性腺已经发育成熟；
2)人工诱导产卵排精：将经过人工促熟达性成熟的个体，在18℃条件下阴干2小时，然后每个个体分别置于1L容器内，再注入升温至24℃、照射强度为300mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；
3)获得雌雄配子后进行自体受精。
在受精卵培育60天后统计，扇贝种苗的个体平均大小达到0.2～0.5cm，成活率平均达到10.9％；海湾扇贝自体受精胚胎在22℃条件下发生进程情况见表1。
表1
         发生过程             受精后时间
       第一极体排出           20分种
       第二极体排出           30分钟
       2细胞期                1小时25分钟
       4细胞期                2小时35分钟
       8细胞期                3小时15分钟
       32细胞期               4小时05分钟
       囊胚期                 5小时35分钟
       原肠期                 9小时35分钟
       担轮幼虫期             17小时55分钟
       D形幼虫期              26小时
       眼点幼虫               11天
       稚贝(500-600μ)        35天
实施例2
与实施例1不同之处在于：将原分布于美国大西洋近岸水域、现在中国海区进行养殖的16个雌雄同体海湾扇贝(Argopecten irradians irradians)的种贝成功自交，利用海湾扇贝雌雄同体的生物学特点，通过自交的途径建立纯系，其操作步骤为：
1)种贝促熟：将壳高6cm的贝类置于23℃水体内，密度为100枚/m3，饲以扁藻、硅藻、塔胞藻饵料，投喂量为每天30万细胞/ml，分6次投喂，每天全量换水1次，充天然空气以补充氧气的不足，充气量以水体表面可见微气泡并形成水流为宜，控制光照为500Lux，有效积温150℃；
2)人工诱导产卵排精：将经过人工促熟达性成熟的个体，在20℃条件下阴干1小时，然后每个个体分别置于2L容器内，再注入升温至25℃、照射强度为600mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；
3)获得雌雄配子后进行自体受精。
经上述步骤，在其16个家系中共获得性成熟的自交子代的成体1500余枚。表2为其中13个海湾扇贝自交系制备过程的生物学数据，即所述13个家系和对照组(相关比较例)的受精率、畸形率和孵化率。
表2
家系     卵量(个)×105      受精率％       畸形率％      孵化率％
 A          6.67              97.48         75.20          1.35
 B          7.2               97.92         80.00          2.88
 C          7.92              97.44         49.43          20.74
 D          6.36              99.65         67.49          3.54
 E          7.12              99.75         30.81          16.69
对照1       0.93              99.29         2.20           75.00
 F          1.02              99.99         5.88           47.06
 G          1.12              99.99         10.71          23.21
 H          1.58              99.99         1.27           60.76
对照2       1.18              98.18         3.38           56.76
 I          2.04              99.98         23.53          41.47
 J          1.6               99.99         27.50          68.23
 K          3.46              97.11         40.46          40.46
 L          3.54              98.87         3.39           31.64
 M          8.73              98.28         3.78           27.03
对照3       2.35              99.23         2.23           73.83
由表2可以看出，自交系的受精率与对照组差别不明显，但畸形率明显高于对照组，而孵化率则明显低于对照组。其结果证明：在人工控制的条件下，可以促使扇贝雌雄性腺同步成熟并完成自体受精与受精卵孵化。这些子代均可用于进一步的自交、侧交与杂交。
本实施例中海湾扇贝自交后获得的I-M组的选育后幼虫生长状况(微米)，详见表3。
表3
              I                 J                 K               L                 M选育后
           壳高/壳长         壳高/壳长         壳高/壳长        壳高/壳长        壳高/壳长0天         75.2/96.4         78.6/97.0         78.8/96.0        76.8/96.2        74.6/95.85天         91.8/110.2        101.4/121.0       92.6/109.0       92.0/110.6       92.8/111.210天        130.0/139.0       135.6/146.2       136.8/146.6      132.2/141.2      129.8/136.815天        151.0/165.6       162.2/175.4       162.0/174.4      161.6/176.4      162.2/176.8
由表3可见，海湾扇贝自交子代可以正常生长到附着变态。
表4为本实施例中海湾扇贝自交后获得的各家系子代中达到性成熟的15个海湾扇贝自交系的成体数目。
表4
   家系             达到性成熟的子代成体数(枚)
    A                          26
    B                          13
    C                          181
    D                          28
    E                          51
    F                          142
    G                          98
    H                          186
    I                          86
    J                          48
    K                          66
    L                          74
    M                          61
    N                          37
    O                          14
由表4证明，利用本发明所提供的扇贝自交技术，可以获得可繁殖的子代。
实施例3
与实施例1不同之处在于实现步骤为：
1)种贝促熟：将壳高6cm的海湾扇贝置于20℃水体内，密度为150枚/m3，饲以塔胞藻、小球藻、扁藻饵料，投喂量为每天22万细胞/ml，分5次投喂，每天全量换水1次，充天然空气以补充氧气的不足，充气量以水体表面可见微气泡并形成水流为宜，控制光照为450Lux，有效积温200℃；
2)人工诱导产卵排精：将经过人工促熟达性成熟的个体，在19℃条件下阴干1.5小时，然后每个个体分别置于1.5L容器内，再注入升温至24℃、照射强度为500mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；
3)获得雌雄配子后进行自体受精。
所述催产在比较困难时，采用解剖方法获得精卵，并进行自体受精。
另外，凡其它雌雄同体的扇贝也为本发明所述创意思想之所及。

Claims (4)

1.一种贝类纯系制备方法，其特征在于：
利用雌雄同体贝类的生物学特点，通过自交的途径建立纯系，其操作步骤为：
1)种贝促熟：将壳高5～6cm的贝类置于18～23℃水体内，密度为100～200枚/m3，饲以饵料，投喂量为每天18～30万细胞/ml，分5～6次投喂，每天全量换水1次，充天然空气以补充氧气的不足，充气量以水体表面可见微气泡并形成水流为宜，控制光照为400～500Lux，有效积温150～250℃；
2)人工诱导产卵排精：将经过人工促熟达性成熟的个体，在18～20℃条件下阴干1～2小时，然后每个个体分别置于1～2L容器内，再注入升温至24～25℃、照射强度为300～800mwh/L的紫外线处理海水，此后一般在0.5～1.5小时内可以获得雌雄配子；
3)获得雌雄配子后进行自体受精。
2.按照权利要求1所述贝类纯系制备方法，其特征在于：所述催产在比较困难时，采用解剖方法获得精卵，并进行自体受精。
3.按照权利要求1所述贝类纯系制备方法，其特征在于：所述贝类为雌雄同体贝类。
4.按照权利要求1所述贝类纯系制备方法，其特征在于：所述饵料为单胞藻。
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