CN1362527A - 一种定量检测趋化因子表达水平的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属生物技术领域,本发明通过构建含有与LARC特异性引物互补序列的特定内参照质粒,以同一对引物在同一反应管中竞争扩增LARC,从而对LARC的表达水平进行定量,建立了定量检测趋化因子LARC表达水平的cQRT－PCR技术。并通过对LARC水平、HBV不同感染状态下体外培养细胞及病人活检肝组织标本中LARC表达量的测定,验证了本方法具备了较高的可靠性和准确性,本方法可用于某些疾病如慢性乙肝等疾病的诊断、预后判断及各种治疗和预防效果的评价。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及一种定量检测趋化因子LARC表达水平的方法，和构成本发明方法的关键内对照质粒。
背景技术
随着PCR(Polymerase Chain Reaction)技术在基础研究、临床诊断等各个领域的广泛应用，人们逐渐意识到仅仅停留在PCR的定性应用上的诸多局限性。生命科学研究，已超出了最初“有/无”的简单的定性范围，而需要更精准的“多/少”的定量概念。以HIV、HBV、HCV等病毒研究为例，定量PCR检测病毒基因，可协助判断潜伏的感染者及无症状携带者的情况，并可从测定结果来判断药物的治疗效果、推测复发的可能性；至于mRNA的RT-PCR定量更能进一步反映病毒的转录水平、活动性、复制性等指标。
LARC(Liver and Activation-Regulated Chemokine)是1997年日本学者Hieshima发现并鉴定的一个新的CC类趋化蛋白。LARC在生理状态下在人肝脏中有一定水平的表达，是肝脏中的一看家趋化蛋白；LARC可趋化活化T淋巴细胞、记忆T淋巴细胞、B淋巴细胞等免疫活性细胞表面，在乙肝病毒感染的病毒特异性细胞免疫，尤其是CTL杀伤肝细胞、清除病毒的免疫应答过程中有重要的角色。LARC的表达水平与其相关疾病如乙型肝炎的免疫状态、转归、预后等的判断具有重要意义。由于LARC与大多数趋化蛋白一样，具有瞬时分泌、含量微弱、局部表达、而不进入循环等的特点，无法用传统的定量方法对其进行精确的定量，所以，需要建立一个良好的分子水平的定量系统，对LARC转录及翻译进行较为准确的定量，用较为精准的量化概念反映该分子的表达水平。
目前常用的对趋化因子进行定量的方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学实验和定量RT-PCR/PCR法等。其中ELISA方法较为迅速简便，但需要体液如血清、分泌物等为检测对象，且精确度和敏感性较差，而趋化蛋白恰恰又是一种分泌水平相对微弱的蛋白质，这势必限制了该方法的应用。免疫组化实验能直观地对趋化蛋白的表达进行定位、定量研究，但对抗体的要求较高、且仅局限于对一些胞内分泌型趋化蛋白的检测，而大多数趋化蛋白往往具有广泛弥散性分泌的特点。定量PCR技术是根据PCR的产物量来推断其原始模板量的方法。常用的定量方法主要有外标法(external standard)、内标法(internal standard)和实时荧光法(real time)三种。外标法具有操作简便、快速等特点，但由于PCR反应是一指数变化过程，反应过程中任一参数如模板起始量、引物浓度、DNA聚合酶活性、反应温度、循环时间、循环数等的微小变化都会显著改变终产物的量，反应前几个循环的不均一性、各反应管不同的升降温效率等将造成无法避免的管间差异，使定量结果的可靠性大为降低。内标法是在定量系统中设立内参照，将参照基因与待测基因在同一反应管内共同进行扩增，这样可在很大程度上消除“管间差异”带来的误差。
发明内容
本发明的目的是建立能对LARC转录及翻译水平进行相对精确的定量cQRT-PCR系统，用较为准确的量化概念反映LARC的表达水平。
本发明通过构建含有与LARC特异性引物互补序列的特定内参照质粒，以同一对引物在同一反应管中竞争扩增LARC，从而对LARC的表达水平进行定量，建立了定量检测趋化因子LARC表达水平的cQRT-PCR技术。并通过对已知量的LARC水平、HBV不同感染状态下体外培养细胞及病人活检肝组织标本中LARC表达量的研究和测定，验证了本方法具备了较高的可靠性和准确性。
本发明的技术方案是通过以下步骤实现的：
1、构建及鉴定PAL-2质粒 自HepG22.2.15细胞中扩增得到目的基因LARC，以T4DNA连接酶克隆到载体pBS-VH62-ANK质粒中。以P2/P3为引物(P2：5’GTC
GAA TTC CAT TCT AGA AAA GCC ACA G 3’，P3：5’CG
G AAT TCC CAT GTG CTG TAC CAA G 3’)，自新质粒中扩增出的PCR产物，经与DNA marker、LARC阳性对照电泳比较，是为324bp的目的基因LARC；进一步以EcoR I对质粒进行酶切，产物经电泳分析，证实目的基因已插入到空载体pBS-VH62-ANK中；DNA测序最终确证了上述结果，将该质粒命名为PAL-2(P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15)(图1，2)。
2、构建及鉴定PAL-2-IS.4质粒取人工合成的一对互补的42bp外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，以连接酶克隆到经Af1 III酶切的质粒载体PAL-2中，得到用作内参照的质粒PAL-2-IS。以P2/P3为引物对质粒进行PCR初步鉴定，产物与PAL-2(324bp)，电泳条带比对照PAL-2的稍后，提示前者插入了42bp的IS(CATGTAAACATTCTCTTCGACATTCTCTTCAACATTCTCTTC)；该质粒可被Af1 III酶切成线型。最终经测序确认新质粒已插入了IS片段，质粒5’及3’端双侧序列与野生型LARC相同，但中间序列多了42bp，是用于内对照的质粒，命名为PAL-2-IS.4(P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15，IS-Insert Sequence，4-4号阳性克隆)。
3、建立检测LARC表达的竞争性RT-PCR技术以2.50pg/10μl的PAL-2与不同已知浓度的PAL-2-IS.4共扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外成像凝胶处理系统扫描分析，结果各个电泳条带的光密度值与DNA的起始浓度成正比。根据各扩增条带的光密度值，用光密度比值法，即以内参照的不同浓度为横坐标，待测模板与内参照模板光密度扫描值的比值为纵坐标作图，得到一直线回归方程y＝ax+b(图5)；当y＝1，即PAL-2-IS.4与PAL-2扩增产物的光密度值一致时的x值，便是待测样品中LARC cDNA的起始浓度，计算出的PAL-2浓度为2.38pg/10μl，与实际浓度无显著性统计学差异(95％可信限)。
4、验证本发明方法的准确性
1)检测HBV不同感染状态下LARC表达水平，代表HBV不同感染状态的肝细胞分别为：“正常”肝细胞L02、HBV慢性持续性感染肝细胞HepG22.2.15，并以HBV双体DNA体外转染HepG2细胞，建立HBV短暂(急性)感染肝细胞模型。自1×106的不同细胞株中抽提到的总RNA，cQRT-PCR方法对各株细胞中LARC表达的定量结果显示(表1)：HBV不同感染状态下LARC的表达水平是不同的，分别为：“正常”：2.65±0.02pg/10μl/106细胞、HBV“急性”感染：3.43±0.02pg/10μl/106细胞、HBV“慢性”持续感染；1.22±0.04pg/10μl/106细胞；且这三种状态下LARC的表达水平存在显著性差异，即HBV“急性”感染肝细胞＞“正常”肝细胞＞HBV“慢性”感染肝细胞(p＜0.05)。
2)检测正常及慢性肝炎活检肝标本中LARC表达量，对数例正常人的肝脏组织标本及经病理诊断证实为慢性乙型肝炎的肝脏活检标本分别抽提总RNA，在同一RNA起始水平，以相同的竞争性RT-PCR方法对LARC mRNA的表达进行定量，结果表明，慢性乙型肝炎患者肝脏中LARC的表达水平呈现出个体差异，其含量界于2.372-4.6pg/10μl之间，但均普遍显著低于其在正常肝脏组织中的平均表达量8.74pg/10μl(p＜0.01)；提示人体肝脏中存在着基础分泌量的LARC，HBV慢性感染状态下，病毒可通过某种途径下调LARC的表达。本发明具有如下特点
1、本发明是一种定量检测LARC表达水平的竞争性逆转录PCR
(cQRT-PCR)
2、本发明RT-PCR系统中含特定的内参照质粒(PAL-2-IS.4)
3、该质粒DNA内含一比正常(野生型)LARC大42bp、但其5’
和3’末端序列与LARC基因的5’和3’末端序列同源的特定基因
序列
4、本发明cQRT-PCR技术可检测包括细胞和组织标本中LARC
的表达量
5、本方法可用于人、小鼠、大鼠等哺乳类动物LARC基因表达
水平的检测
6、本方法可用于某些疾病如慢性乙肝等疾病的诊断、预后判
断及各种治疗和预防效果的评价
附图说明
图1是质粒PAL-2构建示意图：HepG22.2.15细胞中获得的LARC纯化产物与pBS-VH62-ANK质粒DNA分别经EcoR I酶切，1％低熔点琼脂糖凝胶电泳后，回收酶切产物。将得到的两个片段以T4DNA连接酶连接，取5μl连接产物转化感受态菌DH5α。所得质粒命名为PAL-2。
图2是质粒PAL-2的鉴定Aa.：以P2为引物的测序结果；Ab：以P3为引物的测序结果；D：PAL-2的DNA序列。
图3是内参照质粒PAL-2-IS的构建示意图人工合成一对互补的42bp外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，利用克隆于PAL-2的LARC基因内源性Af1 III位点经Af1 III酶切后，加入IS退火产物，以T4DNA连接酶连接，转化感受态菌DH5α。获得内参照质粒PAL-2-IS(P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15，IS-Insert Sequence)。
图4是质粒PAL-2-IS.4的测序鉴定粗体为插入片断的DNA序列，下划线为Af1 III酶切位点
图5是竞争性定量RT-PCR检测LARC表达水平在同一PCR反应体系中，同时扩增固定浓度的PAL-2和不同浓度梯度的内参照PAL-2-IS.4，两者的共扩增产物电泳后，对各条带的光密度值进行扫描分析，得到PAL-2的推算浓度。A.PAL-2与PAL-2-IS.4的共扩增，B.光密度比值法。
表1 HBV不同感染状态肝细胞株中LARC的表达量编号 细胞 回归方程 r p LARC的浓度(pg/10μl)a L02 y＝0.29x+0.23 0.96 ＜0.01 2.65b HepG22.2.15 y＝0.55x+0.31 0.94 ＜0.01 1.22c HepG2-2 y＝0.51x-0.16 0.90 ＜0.01 2.29d HepG2-4 y＝0.37x+0.13 0.92 ＜0.01 2.34e HepG2-6 y＝0.49x-0.09 0.90 ＜0.01 2.23f HepG2-7 y＝0.62x-0.47 0.92 ＜0.01 2.35g HepG2-pEHH-2 y＝0.36x-0.16 0.93 ＜0.01 3.21h HepG2-pEHH-4 y＝0.35x-0.16 0.90 ＜0.01 3.30i HepG2-pEHH-6 y＝0.32x-0.09 0.91 ＜0.01 3.40j HepG2-pEHH-8 y＝0.32x-0.10 0.91 ＜0.01 3.47k HepG2-pEHH-10 y＝0.32x-0.08 0.92 ＜0.01 3.37l HepG2-pDEH-12 y＝0.35x-0.13 0.89 ＜0.01 3.26
表2 慢性肝炎及正常肝脏标本中LARC的表达量编号 回归方程 r p LARC的浓度 LARC的起始浓度
(pg/10ul) (pg/10ul)a y＝1.78x-2.26 0.89 ＜0.01 1.83 4.575b y＝1.72x-0.92 0.91 ＜0.01 1.11 2.773c y＝1.73x-0.94 0.90 ＜0.01 1.13 2.826d y＝1.74x-1.99 0.91 ＜0.01 1.72 4.3e y＝1.37x-0.29 0.93 ＜0.01 0.95 2.372f y＝1.71x-1.93 0.89 ＜0.01 1.71 4.275g y＝1.70x-1.88 0.92 ＜0.01 1.10 2.74h y＝1.52x-0.18 0.90 ＜0.01 1.66 4.15i y＝1.76x-2.03 0.91 ＜0.01 1.75 4.374j y＝1.61x-0.70 0.92 ＜0.01 1.05 2.629k y＝1.47x-1.70 0.91 ＜0.01 1.84 4.6l y＝0.28x+0.02 0.95 ＜0.01 3.54 8.83m y＝0.30x-0.06 0.94 ＜0.01 3.44 8.6n y＝0.30x-0.05 0.97 ＜0.01 3.51 8.775
Claims (5)
1.一种定量检测趋化因子表达水平的方法，其特征是通过构建含
有特定内参照质粒PAL-2-IS.4，以同一对引物在同一反应管中
竞争扩增，建立对趋化因子的表达水平的竞争性定量检测方法。
2.按权利要求1所述的方法，其特征是所述的趋化因子为LARC。
3.按权利要求1所述的方法，其特征是所述的内参照质粒
PAL-2-IS.4与LARC特异性引物互补序列，该质粒DNA内含比
野生型sLARC大42bp、其5’和3’末端序列与LARC基因的5’和
3’末端序列同源的特定基因序列。
4.按权利要求1所述的方法，其特征是按以下步骤进行：
a)从HepG22.2.15细胞中扩增得目的基因LARC，以T4DNA连接酶
克隆到载体pBS-VH62-ANK质粒中，以P2/P3为引物，从新质粒
中扩增出324bp的目的基因LARC；再以EcoR I对质粒行酶切，
目的基因插入到空载体pBS-VH62-ANK中构建成PAL-2质粒，
其中P-pBS，A-ANK，L-LARC，2-HepG22.2.15；
b)构建及鉴定PAL-2-IS.4质粒，取人工合成的一对互补的42bp
外源性核酸片段IS，退火后形成Af1 III粘性末端，以连接
酶克隆到PAL-2中，得质粒PAL-2-IS后，以P2/P3为引物对质
粒进行鉴定，经测序确认新质粒已插入了IS片段，得内对照
质粒PAL-2-IS.4
c)建立检测LARC表达的竞争性RT-PCR技术，以PAL-2与
PAL-2-IS.4共扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外成像凝胶
处理系统扫描分析，根据各扩增条带的光密度值，用光密度比
值法，得直线回归方程y＝ax+b，
d)验证本发明方法的准确性。1)检测HBV不同感染状态下LARC
表达水平，2)检测正常及慢性肝炎活检肝标本中LARC表达
量。
5.按权利要求4的方法，其特征是所述的P2/P3引物，其中P2序
列：5’GTC
GAA TTC CAT TCT AGA AAA GCC ACA G 3’，P3
序列：5’CG
G AAT TCC CAT GTG CTG TAC CAA G 3’。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 01132232 CN1362527A (zh) | 2001-11-19 | 2001-11-19 | 一种定量检测趋化因子表达水平的方法 |
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| CN 01132232 CN1362527A (zh) | 2001-11-19 | 2001-11-19 | 一种定量检测趋化因子表达水平的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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| CN1362527A true CN1362527A (zh) | 2002-08-07 |
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| CN 01132232 Pending CN1362527A (zh) | 2001-11-19 | 2001-11-19 | 一种定量检测趋化因子表达水平的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1362527A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004015137A1 (fr) * | 2002-08-09 | 2004-02-19 | Huadong Research Institute For Medicine And Biotechnics | Methode de comparaison du niveau d'expression de genes |
| WO2006005235A1 (fr) * | 2004-07-09 | 2006-01-19 | Huadong Research Institute For Medicine And Biotechnics | Procede de comparaison destine a la quantite d'expression pour le meme gene provenant de sources differentes par la mesure des sequences de base |
| EP2360277A1 (en) * | 2006-05-03 | 2011-08-24 | Geisinger Clinic | Methods for diagnosing and predicting non-alcoholic steatohepatitis (NASH) |
-
2001
- 2001-11-19 CN CN 01132232 patent/CN1362527A/zh active Pending
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| PB01 | Publication | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |