CN1353314A - 艾滋病病毒快速检测试纸及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明阐述了一种快速、准确检测艾滋病病毒的试纸及这种试纸的制备方法,它以一种或多种多肽物质按配比为抗原喷涂到试纸基质上经干燥后,再与喷有胶体金的试纸基质粘贴、剪切、包装后得到,用这种试纸检测艾滋病病毒HIV1/2只需3-5分钟,准确率高,抗干扰性强,检测灵敏度和特异性灵敏度均达到99%以上,而且制备工艺简单,检测操作方便易掌握,生产成本低,检测费用少,不仅适合专业检测机构使用,也适合例行体检、采/供血、疫情检测、医疗临床等场合使用,尤其能使受试者个人在产品使用说明书的指导下进行“家庭化”的自我检测应用。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测方法,特别是一种艾滋病病毒(人类免疫缺陷病毒)快速检测试纸及其制备方法。
背景技术
艾滋病是目前世界上还没有合适的药物能对其进行有效预防和治疗的危害极大的传染性疾病,因此世界上许多国家都对预防艾滋病给予极大关注并采取多种预防措施,以防止其迅速蔓延。为了更有效地管理、预防及治疗艾滋病以及艾滋病病毒感染者,艾滋病病毒(HIV)的简易及快速测定已显得尤为重要。
在中国,由于许多地区和高危人群对艾滋病的认识和防范意识不强,导致艾滋病病毒感染人群已经在一些地区迅速蔓延。中国艾滋病的传播已经从特殊人群向一般人群扩散,经性传播途径传播的病例正在持续增加。据2000年最新的统计报告表明,中国的艾滋病病毒总感染人数已达86万人,并以每年30%的速度增长,若不采取有效预防措施。艾滋病毒感染者和艾滋病病人将以更快速度增加,预计到2010年将超过1000万人,因而如何在预防和检测艾滋病病毒(HIV)方面做好工作,不仅政府和卫生防疫部门应加大力度,而且在检测和控制艾滋病病毒(HIV)的技术方面也应加快我们的研究步伐。
在艾滋病病毒检测方面,目前公开文献报道和实际使用的主要有三种方法:
(一)酶联免疫法(ELISA法);
(二)免疫印迹法(WB法);
(三)快速测试法。
以上三种方法的测试原理都是利用“抗原——抗体”反应来检查测试者血液或体液中是否含有抗艾滋病病毒(HIV)的抗体。
其中,酶联免疫法和免疫印迹法是利用“抗原——抗体”所标记的碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶的活力来测定“抗原——抗体复合物”,判断测试者血液或体液中是否含有抗艾滋病病毒(HIV)的抗体,因而这两种方法检测较准确和灵敏。但这两种检测方法操作复杂,专业性强,检查时需到专门的机构由专业人员进行操作,检测耗时长,而且检测试剂需要在特殊条件下保存,不利于在全社会推广使用。
第三种方法是通过“抗原——抗体复合物”由其所结合的“胶体金或硒”的浓度高低来区分,因而灵敏度比第一、第二两种方法稍偏低,但第三种方法由于检测时不需要任何仪器设备,检测时间较短(需30分钟左右),检测成本较低,因此快速测定法已经变得越来越流行。此外,以上三种艾滋病病毒(HIV)检测方法中,完整的或部分重组的艾滋病病毒(HIV)结构蛋白都可以用来作为抗原,但现有技术都存在着检测试剂需要特殊条件保存、未经过培训学习的普通医务人员不能掌握操作技能的缺点,以及不能适应大规模体检、供采血、乃至根据需要由受试者自己在家中依据产品使用说明书的指导、自己进行检测的要求。由于艾滋病的特殊社会原因,以及艾滋病病人和艾滋病病毒(HIV)感染者所拥有的特殊的心理状态,导致其中的绝大部分人不愿意到专业机构中去做艾滋病病毒(HIV)的检测。这就必将导致目前使用的艾滋病病毒(HIV)检(监)测方法,无法对社会中的艾滋病流行状况及艾滋病病毒(HIV)的感染情况做出真正准确的报告,同时也无法真正监控艾滋病的流行趋势。因此,这就使得在日常生活中,在我们身边随时都可能出现艾滋病病人或艾滋病病毒(HIV)感染者的现象成为可能。
技术内容
本发明人在了解和分析了现有检测艾滋病病毒的方法之后,在保持“抗原抗体”快速检测法的基础上,经过多方面研究和探索,研究成功新型的艾滋病抗原及其生产工艺,找到了一种区别于现有检测方法的、简便高效、快速准确,并且适合于受试者在说明书指导下,自己在家中就可以检测的新方法。这种方法是“快速检测法”的发展,测试耗时缩短到了只要2-5分钟(原方法要30分钟左右)。
本发明人经过比较和分析100多种艾滋病病毒的基因序列,最后设计了6种多肽抗原,这6种多肽抗原本通过人工合成之后,以单一或数种多肽以不同的组合混合后为特异性抗原(原快速测定法中是以蛋白为抗原)经过溶解后,喷涂到试纸基质上,经过干燥后与喷有胶体金的试纸按一定的要求粘贴在一起,再经过切割、包装后,做成艾滋病的快速检测试纸。
以“特异性多肽”为抗原在快速测定法中具有很大的优势,特异性多肽抗原的优点在于其易于合成,检测重复性好,稳定性高,用其制成的检测试剂可以在室温中长期运输和保存(至少1年以上)。而且检测的灵敏度可以通过增加所掺入的抗原(多肽)的剂量来提高。因此,本发明所公布的“多肽抗原艾滋病病毒(HIV)检测试纸快速测定法”,是目前正在使用的检测艾滋病病毒(HIV)的方法所无法比拟和替代的。具备了操作方便、简洁、快速、准确度高、重复性好的特点,并且已经在美国经过小规模临床试验,取得了成功。
本发明中所应用的数种多肽抗原物质是通过分析和比较全世界的100多种艾滋病病毒株的基因组序列后并结合在中国流行的艾滋病病毒(HIV)株中分离的基因序列,最后综合研究的成果。目前通过测试15例已知的HIV-1/2型患者的标准血样,准确率达100%。最重要的是,这些多肽抗原对中国流行的病毒株产生的抗体更为灵敏和特异,因此检测的准确率更高。
本检测试纸使用的多肽类物质主要包括以下几种:1、多肽A——其序列来源于蛋白质gp36 (国际标准命名)2、多肽B——其序列来源于蛋白质gp41 (国际标准命名)3、多肽C——其序列来源于蛋白质gp120(国际标准命名)4、多肽D——其序列来源于蛋白质p24 (国际标准命名)5、多肽E——其序列来源于蛋白质P55 (国际标准命名)6、多肽F——其序列来源序列于蛋白质P17 (国际标准命名)
上述六种多肽物质可以用各种不同氨基酸经过化学合成的方法得到,也可以利用重组DNA技术制备得到。
以下是本发明“艾滋病病毒(HIV)检测试纸”的制备方法:一、配料:
选择上述多肽中的一种或若干种混合,用生理盐水稀释到0.5-10mg/ml的浓度,使其充分溶解或混匀,静置3-6小时,最好4-5小时,过滤,置无菌室(箱)中待用。稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%。二、喷涂:
用上述配好的多肽溶液均匀、准确地呈线状喷涂到试纸基质上,喷后烘干,温度为10℃-80℃,最好30℃-50℃,然后喷涂多次,每喷一次都要烘干,喷涂的多肽溶液为特异性多肽的单一溶液或混合溶液。三、制备胶体金试纸片:
当特异的抗体结合蛋白被胶体金标记后,可以用它们浸泡玻璃纤维试纸。浸泡后的试纸片经干燥后备用。四、粘贴:
将喷涂了溶液并干燥后的试纸基质一侧粘上干燥过的胶体金试纸,在另一侧粘上用于吸水的厚层滤纸片,并保证多肽抗原线条的位置位于塑料外壳的观察窗口中。五、切割包装:
将上述粘合好的试纸按规格切割,然后用塑料壳封装或安放到保护盒中密封保存,得到产品。六、外包装:
将包装好的检测试纸条与弹簧针、毛细管、消毒巾、包扎带、稀释液、废弃物收集袋等,组合在一起装入外包装盒内,使其形成一个完整的,可以家庭化使用的最终产品。本发明的工作原理:
当艾滋病病毒侵入人体后,在1-2周内病毒大量复制,此时的病人的症状与感冒十分相似(浑身无力、发烧、出现红色疱疹),一般在病毒侵入人体后3-4周,人体会产生相应的抗体,此时就是所谓的“血清阳性”期,我们的快速艾滋病病毒检测试纸,就是通过检测病人体内产生的抗艾滋病病毒抗体,来检定受检者是否是阳性或阴性。
对受试者取血样(可以用血清、血浆或全血),加到HIV快速检测试纸的点样孔内,当样品加到试纸条一端的样品垫上后,通过毛细作用向前移动,溶解固化在结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应,再移动至固定的抗原(或抗体)的区域时,待测物和金标试剂的复合物又与之发生特异性结合而被截留,聚集在检测带上,通过可自测的胶体金标记物得到直观的显色结果,而流离标记物则越过检测带,达到与结合标记物自动分离之目的。本发明与已有技术相比,其突出的实质性特点和显著的进步是:
1、检测迅速:从被试者取出血样或体液,到用试纸检测获得检测结果,期间只需3-5分钟便可。
2、检测准确率高、灵敏度高:检测灵敏度和特异性灵敏度达到99%以上,比现有技术的快速检测法的准确率和灵敏度大大提高。
3、改变了原先要到专业机构并且必须经专业人员检测才能得到结果的传统检测方式,使用者可以在产品使用说明书的指导下,自己进行检测,并且不影响检测结果的可靠性。因此可以最大限度地保护受试者的隐私权,并且可以解决人们在进行艾滋病病毒(HIV)检测时所带来的敏感的社会问题和沉重的心理压力的问题。所以本发明的产品能够在大范围内的推广使用成为可能,能够在社会各个领域全面进行艾滋病疫情的监测,为预防艾滋病的监控体系的建立起到了重要的不可替代的作用。如临床采、供血,出入境人员、入学、参军、婚检、手术病人手术前的检测、高危人群的自我监测等都可进行快速而准确的测定。
4、操作方法简单:普通医务人员只需在使用说明书的指导下,即可学会操作,还可适合艾滋病患者或HIV感染者以及高危人群的个体自我检测,达到有目的的预防、控制和保护作用。同时其操作简便和可以家庭化使用的特点,可以使其监测的范围更大、更广,自我保护的功能更强,这样就可以为控制艾滋病的迅速蔓延起到更为积极的作用,并可为科学家研制出有效的治疗艾滋病的药物赢得更加宝贵的时间。
5、本项发明的“艾滋病病毒快速检测试纸”的制作工艺简单,成本低。用普通氨基酸进行人工合成或用DNA重组技术可以得到多种特异性的多肽抗原物质。整个检测费用只是酶联免疫法(ELISA)或免疫印迹法(WB)的1/5或1/10。较低的检测费用,使产品的普及使用成为可能。
6、试纸不需要在低温或特殊条件下保存,在0℃-40℃,特别在4℃-37℃的条件下只要不曝晒或受潮,有效期可达1.5年,并且检测的灵敏度和特异性灵敏度及准确率均不会发生变化,而且检测的重复性好。
7、抗干扰能力强:本发明所使用的特异性多肽抗原具有很强的选择性。在检测过程中,它可以排除流感、乙肝、丙肝等多种人类常见的病毒性感染疾病和一些细菌性感染疾病、以及一些常见的过敏性疾病在人体血液内形成的抗体对检测结果的干扰,因此,灵敏度极高,特异性极强。
具体实施方式:
试纸制作实施例一:按照多肽A中氨基酸排序的要求,以L-赖氨酸、谷氨酸和胱氨酸等氨基酸为原料,在特定的条件和设备内,经过人工合成得到的多肽A,经分离纯化后备用。将此多肽A物质用生理盐水配成0.5-10mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤备用。将配好的多肽物质A溶液喷涂到预先按要求准备好的试纸基质上,在30-50℃烘箱内烘干,然后与已喷涂了胶体金的试纸基质按一定的要求粘贴,按一定的规格剪切,包装得到产品。
试纸制作实施例二:按照多肽B和多肽C中的氨基酸排序的要求,以亮氨酸、丝氨酸等氨基酸为原料,在特定的条件和设备内,经人工合成,分别得到多肽B、多肽C,经分离、纯化后备用。将上述两种物质按一定比例用生理盐水配成0.5-10mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤备用。将多肽B、多肽C的混合溶液喷涂到预先准备好的试纸基质上,在30-50℃烘箱烘干,然后与已喷涂了胶体金的试纸基质按一定的要求粘贴好,并按一定的规格剪切,包装得到产品。
试纸制作实施例三:按照多肽A和多肽D中的氨基酸排序的要求,以L-赖氨酸、亮氨酸、蛋氨酸等氨基酸为原料,在特定的条件和中,经人工合成,分别合成出多肽A和多肽D,并经分离纯化后备用。
将多肽A和多肽D按一定的比例混合后用生理盐水稀释成0.5-10mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤备用。将多肽A、多肽D的混合溶液喷涂到预先准备好的试纸基质上,在30-60℃烘干,再与已经喷有胶体金的试纸基质按一定的要求粘贴在一起,按一定的规格切割成条状,包装得到产品。
试纸制作实施例四:用实施例一的多肽物质A、实施例二的多肽物质B和多肽物质C、实施例三的多肽物质D,用生理盐水分别配成0.5-10mg/ml的浓度,静置3-6小时,过滤,备用。
在预先准备好的试纸基质上先喷涂多肽物质A,烘干,再依次喷涂多肽物质B、C、D,每次喷涂后均烘干,最后将喷涂了多肽的试纸基质与已预先喷好胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴好,按一定规格剪切,包装得到产品。
试纸制作实施例五:将实施例四的四种多肽物质按均等的重量混合,用生理盐水溶解成1.5-30mg/ml的浓度,静置3-6小时,过滤,备用。
将上述配好的混合溶液喷涂到预先准备好的试纸基质上,烘干,然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
试纸制作实施例六:按照多肽A、B、E、F的中的氨基酸排序的要求,以相应的单体氨基酸为原料,在特定的条件和设备内,经过人工合成,分别得到的多肽A、B、E、F,并经分离纯化后备用。
将多肽A、B、E、F分别用生理盐水配成0.5-10mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤,备用。在预先准备好的试纸基质上分别依次喷上多肽A、B、E、F的溶液,每次喷涂后均烘干然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
试纸制作实施例七:用试纸制作实施例六的多肽A、B、E、F,按等量配比混匀,用生理盐水配成1-30mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤,备用。
将上述多肽混合溶液喷涂到预先准备好的试纸基质上,烘干,然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
试纸制作实施例八:按照多肽C、D、E、F的中的氨基酸排序的要求,以相应的单体氨基酸为原料,在特定的条件和设备内,经过人工合成,分别得到的多肽C、D、E、F,并经分离纯化后备用。
将多肽C、D、E、F分别用生理盐水配成0.5-10mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤,备用。在预先准备好的试纸基质上分别依次喷上多肽C、D、E、F的溶液,每次喷涂后均烘干然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
试纸制作实施例九:用试纸制作实施例八的多肽C、D、E、F,按等量配比混匀,用生理盐水配成1-30mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤,备用。
将上述多肽混合溶液喷涂到预先准备好的试纸基质上,烘干,然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
试纸制作实施例十:按照多肽E、F的中的氨基酸排序的要求,以相应的单体氨基酸为原料,在特定的条件和设备内,经过人工合成,分别得到的多肽E、F,并经分离纯化后备用。
将多肽E、F分别用生理盐水配成0.5-10mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤,备用。在预先准备好的试纸基质上分别依此喷上多肽E、F的溶液,每次喷涂后均烘干然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
试纸制作实施例十一:用试纸制作实施例十的多肽E、F,按等量配比混匀,用生理盐水配成0.5-20mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤,备用。
试纸制作实施例十二:按照多肽A、B、E、F的中的氨基酸排序的要求,以相应的单体氨基酸为原料,在特定的条件和设备内,经过人工合成,分别得到的多肽A、B、E、F,并经分离纯化后备用。
将多肽A、B、E、F分别用生理盐水配成0.5-10mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤,备用。在预先准备好的试纸基质上分别依此喷上多肽A、B、E、F的溶液,每次喷涂后均烘干然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
试纸制作实施例十三:用试纸制作实施例十二的多肽E、F,按等量配比混匀,用生理盐水配成0.5-20mg/ml的浓度(稀释的浓度数据可以加或减变化2.5%),静置3-6小时,过滤,备用。
将上述多肽混合溶液喷涂到预先准备好的试纸基质上,烘干,然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
试纸制作实施例十四:将多肽A的基因序列克隆到细菌表达载体中,然后将该工程菌接种到培养基上,再经过蛋白纯化即可得到重组的多肽A抗原。多肽B、C、D、E、F分别按照其特定的基因序列参照上述多肽A的制备方法分别制备得到。
用经过DNA重组技术得到的多肽A、B、C、D、E、F抗原按照实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10、实施例11、实施例12、实施例13的方法分别制备得到本发明的产品。
将上述多肽混合溶液喷涂到预先准备好的试纸基质上,烘干,然后与喷有胶体金的试纸基质,按一定的要求粘贴在一起,经按一定的规格要求切割、包装后得到产品。
将以上实施例制备的艾滋病病毒HIV1/2快速检测试纸做成整体包装盒,整体包装盒中配置了“弹簧针”、“点样管”、“稀释液”、“消毒巾”、“包扎带”、“废弃袋”等六件特殊的装备,这些装备保证了本发明所公布的产品可以使受试者,在产品使用说明书的指导下,自己进行“家庭化”的检测操作,不再需要到特定的专业机构去找专业的人员进行检测操作,并且不影响检测结果的准确性。本发明试纸的试验效果:
用上述各方法制得的各种试纸通过测试15例已知的HIV-1和HIV-2患者的标准血样,每次测试3-5分钟,准确率达到100%,同时测试无病毒的血样或血清,准确率也达到100%,并最后均用酶联免疫法(ELISA)和免疫印迹法(WB)进行复核、验证。
Claims (4)
1、一种艾滋病病毒快速检测试纸,其特征是由喷涂过特异性多肽物质的试纸基质和喷涂有胶体金的试纸基质粘合而成,所述的特异性多肽物质包括多肽物质A、其序列来源于蛋白质gp 36(国际标准命名);多肽物质B、其序列来源于蛋白质gp41(国际标准命名);多肽物质C、其序列来源于蛋白质gp120(国际标准命名);多肽物质D、其序列来源于蛋白质p24(国际标准命名);多肽物质E、其序列来源于蛋白质P55(国际标准命名);多肽物质F、其序列来源于蛋白质P17(国际标准命名)的其中一种或数种的混合物。
2、根据权利要求1所述的艾滋病病毒快速检测试纸,其特征是:多肽物质A、B、C、D、E、F是由单体氨基酸经过人工合成或DNA重组技术得到。
3、一种权利要求1所述的艾滋病快速检测试纸的制备方法,其特征是先将一种或多种多肽物质用生理盐水配制成0.5-10mg/ml的浓度的溶液,静置3-6小时,过滤,备用,将配制好的多肽溶液喷涂到预先准备好的试纸基质上,在10℃-80℃条件下烘干,将烘干的喷有多肽物质的试纸基质与喷有胶体金的试纸基质粘贴在一起,然后剪切,密封包装得到产品。
4、一种权利要求1所述的艾滋病快速检测试纸的检测方法,其特征是:将制备的艾滋病病毒快速检测试纸做成整体包装盒,整体包装盒包括弹簧针、点样管、稀释液、消毒巾、包扎带、废弃袋,使用时受试者取血样(可以用血清、血浆或全血),加到快速检测试纸的点样孔内,通过可反应的胶体金标记物得到直观的显色结果。
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2001
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---|---|---|---|
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Granted publication date: 20051214 Termination date: 20171206 |