CN1351711A - 莽草酸的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种检测莽草酸的方法,它包括:用高碘酸或含有高碘酸盐和高碘酸的试剂氧化莽草酸;加入强碱,以产生生色团;加入亚硫酸盐,以稳定生色团;检测生色团的存在;还可任选地进行生色团的定量测定。本发明的方法可直接应用于组织抽提液,应用于植物组织抽提液较佳。

Description

莽草酸的检测方法
                           发明领域
本发明涉及莽草酸的检测方法，更具体说，本发明涉及能够检测植物材料中莽草酸的方法。
                           发明背景
莽草酸是D-葡萄糖生物合成芳香族氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的重要的中间体。
除草剂草甘膦〔即，N-(磷酰基甲基)甘氨酸〕抑制了芳香族氨基酸的生物合成，这最终导致了莽草酸在植物中的积累。草甘磷是5-烯醇丙酮酰基-莽草羧基-3-磷酸(EPSP)合成酶的强抑制剂，此酶在芳香族氨基酸生物合成途径中是一个关键酶。草甘磷先导致EPSP合酶的底物——莽草羧基-3-磷酸的积累，后者随后在植物中被水解成莽草羧基。检测植物中的莽草酸，能够用来确定植物是否接触过草甘磷，还能够用来测定该植物是否对这种除草剂有抗性。
Gaitonde和Gordon，J.Boil.Chem.，vol.230，no.1，p.1043-1050公开了一种定量测定莽草酸的方法，其中，用高碘酸氧化莽草酸的溶液，加入氢氧化钠以形成黄色的生色团，并加入甘氨酸以稳定该色彩。然后在该溶液加入氢氧化钠后的十分钟内测量该溶液的光密度。
Millican，Methods in Enzymology，vol.17A，p.352-353，1970公开了一种检测莽草酸的方法，其中，用高碘酸盐氧化含莽草酸的溶液，然后用亚砷酸盐处理。加入硫代巴比妥酸，溶液呈红色。然后用环己酮抽提该溶液。澄清的上层环己酮相呈红色，测定其光密度。
Singh和Shaner，Weed Technology，vol.12，p.527-530，1998公开了一种检测植物组织中莽草酸的方法，其中，用高碘酸氧化含有莽草酸的试验样品。然后将样品与氢氧化钠混合，加入甘氨酸测量其光密度。
Sichl，在Herbicide Activity：Toxicology Biochemistry and molecular Biology中(由R.M.Roc等人编辑，IOS出版，1997，p.37-65)公开了一种DAHP酶的试验方法，其中，该酶在存在其底物磷酸烯醇丙酮酸和丁糖-4-磷酸下培育。加入高碘酸停止该反应。随后加入亚硫酸钠，以还原过量的高碘酸。然后加入硫代巴比土酸，接着在十分钟内加入二甲亚砜。测定其549nm吸收值。
                           发明内容
本发明提供一种检测水溶液中莽草酸的方法，它包括：a)用高碘酸或含有高碘酸盐和高碘酸(高碘酸和所述试剂在本文同指高碘酸盐)的试剂氧化莽草酸；b)加入强碱以产生生色团；c)加入亚硫酸盐以稳定生色团；d)检测生色团的存在。还可包括步骤e)定量测定生色团。生色团的存在表明在该水溶液中存在莽草酸。生色团的量与水溶液中的莽草酸的量有直接的关系。在本发明的一个较佳实施例中，步骤b和c加入含有亚硫酸盐和强碱的混合物同时进行，这样，过量高碘酸盐的还原和生色团的产生同时发生。
申请者已发现，同时使用高碘酸和高碘酸盐与莽草酸反应，比单独使用高碘酸具有更快的反应时间，特别是当氧化反应在温度高于环境室温进行时。
另外，申请者还发现，使用亚硫酸盐来还原多余的高碘酸和高碘酸盐大大地增进了加入强碱氧化莽草酸后产生的生色团的稳定性。
申请者的方法也可用于检测组织尤其是植物组织中的莽草酸。因此，本发明另一方面提供了一种检测试验样品中的莽草酸的方法，该方法包括(a)用高碘酸或含有高碘酸盐和高碘酸的试剂处理试验样品；(b)将强碱加入试验样品中以产生生色团；(c)用亚硫酸盐稳定生色团；(d)检测生色团的存在。该方法还可以包括步骤(e)定量测定生色团。较佳的方法是，步骤b和c用含有亚硫酸盐和强碱的混合物同时进行，这样，过量的高碘酸盐的还原和生色团的产生同时发生。
与现有的检测莽草酸的一些方法不同，申请者的方法能直接应用于组织抽提液。适当的组织抽提液可不用研磨而得到，或者延长植物材料的回流而得到。另外，与现有的其他一些方法不同，申请者的方法提供了更稳定的生色团，这样，生色团的检测不需要在高碘酸氧化反应结束后尽可能快的进行。本发明方法直接用于组织样品的适用性、可以延迟对生色团的检测至少一小时、以及可任选地对生成的生色团进行定量测定使得本发明非常适合于以高通量对组织样品进行筛选。
本发明这些和其他方面的内容将在以下的本发明的详细描述中进行陈述。
                       发明的详细描述
高碘酸氧化莽草酸产生反式-乌头酸和一个二醛。当通过加入足量的氢氧化钠去除多余的高碘酸以将pH值升至10以上时，产生了显著的强烈的黄色。已发现只有莽草酸、奎尼酸和色氨酸在用高碘酸处理后，在碱性条件下产生黄色的生色团。莽草酸形成的黄色是几种检测莽草酸方法的基础，这种黄色可能是形成的二醛的特征。呈黄色的生色团不稳定，一些方法使用一种化合物如甘氨酸来稳定该颜色。申请者已发现，亚硫酸盐比已知的方法能更好得多地稳定生色团，并提供了一种可直接用于组织样品的方法。
本发明提供一种检测水溶液中莽草酸的方法，该方法包括a)用高碘酸或含有高碘酸盐和高碘酸(在这里同指高碘酸盐)的试剂氧化莽草酸；b)加入强碱以产生生色团；c)加入亚硫酸盐以稳定生色团；d)检测生色团的存在。并可任选地包括步骤e)定量检测生色团。生色团的存在表明水溶液中存在莽草酸。生色团的量与水溶液中的莽草酸的量有直接的关系。可能已知水溶液含有莽草酸，如当将已知数量的莽草酸加入到水溶液中以产生标准品时，或者怀疑含有莽草酸，如试验样品。
检测植物中的莽草酸可用来确定一种植物是否接触过除草剂草甘膦，也可用来测定植物是否对该除草剂有抗性。因而，本发明的方法可用于需要检测和/或定量莽草酸的情况。例如，本发明的方法可用来筛选植物或植物组织或细胞，以确定其对除草剂草甘膦的抗性，或者用来测试农作物，以确定其是否接触过草甘膦。
本发明的方法可在水溶液中方便地进行。该水溶液可以是水，或者水与可水溶和的有机溶剂的混合液。本发明的方法适用于不同类型的组织，包括植物、动物和微生物组织。植物组织较佳。当使用组织样品时，需先将莽草酸抽提到一种合适的溶剂中，如一种水溶液和可水溶和的有机溶剂，然后如有必要，澄清得到的溶液。
使用合适的方法可从组织中抽提莽草酸。申请者已发现，在室温下，使用含有水和可水溶和的有机溶剂的溶液可不难且大量地从植物组织中抽提出莽草酸。较佳的是，该植物组织事先已被冷冻至-4℃以下。用来从组织中抽提莽草酸的溶液的pH可以是碱性的或酸性的。可水溶和的有机溶剂可以是莽草酸能溶于其中的任何溶剂，较佳的是低分子量的酒精，更佳的是异丙醇。在抽提液中培育该组织，直到全部或足够量的莽草酸被抽提出来。一般大约24小时后完成抽提，但通常在16到24小时后完成，或甚至更短。
抽提莽草酸的溶液较佳的是体积比为2∶1的0.05M碱金属氢氧化物(水溶液)和异丙醇。碱金属氢氧化物以氢氧化钠或氢氧化钾较佳。
在从植物组织中抽提莽草酸的一个较佳的方法中，将冷冻至-4℃以下的组织切成小片，将其沉浸在足量的体积比为2∶1的0.05M氢氧化钠或氢氧化钾(水溶液)和异丙醇的混合液中。一般情况下，为了方便，每0.1克的植物组织用1毫升的抽提混合液，但其他抽提混合液与组织的比例也是合适的。抽提可以在室温进行，直到没有另外的莽草酸被抽提到溶液中。通过这些步骤，许多植物组织的莽草酸可在16-22小时里被全部抽提出来。
按照本发明的方法而无需额外的操作，可分析上述抽提混合液各等份中是否存在莽草酸，使大量的样品分析能方便地进行。例如，可在96孔或更小的塑料板中对少量的植物组织进行组织抽提，用自动处理装置从板孔中取出等份抽提液，测定其吸收值，从而确定植物样品中的莽草酸量。
可以用高碘酸或含有高碘酸和高碘酸盐的试剂(高碘酸盐试剂)来进行莽草酸的氧化反应。为了易于参考，高碘酸和含有高碘酸和高碘酸盐的试剂一般称为高碘酸盐。较佳的是，用含有比例为1∶1的高碘酸和高碘酸盐试剂来进行氧化反应。该试剂可以用水配成0.5％(重量/体积)的高碘酸和0.5％(重量/体积)偏高碘酸钠水溶液。将高碘酸盐加到含有或怀疑含有莽草酸的水溶液中。将足量的高碘酸盐加到该水溶液中，这样，在该水溶液中就有超过已知量或怀疑量的莽草酸的摩尔浓度大大过量的高碘酸盐。
莽草酸的氧化反应可在环境室温或高的温度下进行。较佳的是，氧化反应在25-65℃之间进行，更佳的在35-50℃之间。申请者已发现，在37℃时莽草酸的氧化反应在30到45分钟后完成。当氧化反应在环境室温下进行时，反应要花3小时。
在水溶液中加入强碱，停止或结束莽草酸的氧化反应，产生生色团；然后加入亚硫酸盐，以还原过量的高碘酸盐，稳定该生色团。较佳的是，同时将含有强碱和亚硫酸盐的混合物加到该水溶液中以结束该反应和稳定生色团。然而，分别地加入碱和新配置的亚硫酸盐溶液也能实现这些步骤。
碱是强碱较佳，如氢氧化物，是碱金属氢氧化物更佳，如氢氧化钠或氢氧化钾，最佳的是氢氧化钠。加入足量的碱，使水溶液碱性pH超过10，超过11较佳。较佳的是，用水或其他溶剂混合碱，本发明方法中更佳的是使用碱与水的混合液。在该水溶液中加入碱和亚硫酸盐产生稳定的生色团，在加入碱和亚硫酸盐后大约1小时可在该水溶液中检测到该生色团的存在。
将数量足以稳定生色团的亚硫酸盐分别或与强碱混合加入到该水溶液中，这些生色团因将强碱加入完成的高碘酸盐氧化反应而产生。亚硫酸盐被加入到水溶液中，因此，溶液中亚硫酸盐比高碘酸盐有更多的摩尔。过量的亚硫酸盐并不干扰本发明的方法。任何溶液形式的亚硫酸盐都可用于本发明的方法，例如钠盐或钾盐，较佳的是亚硫酸钠。亚硫酸盐宣与水或其它的溶剂混合，更佳的在本发明方法中采用亚硫酸盐与水的混合液。
水溶液中表明有莽草酸的生色团的存在可用任何适合的方法检测，例如用分光光度计测量382nm的光密度，或者目测水溶液是否呈黄色。任选地也可以定量测定试验样品的生色团，因而可提供水溶液中的莽草酸量。定量测定可用任何适合的方法进行，例如与标准莽草酸比较，该标准样品是用本发明方法由已知数量的莽草酸制成。本发明的一个较佳实施例中，水溶液的光密度是用分光光度计测量382nm得到的，通过与用已知量莽草酸配制的并用分光光度计测量382nm光密度的莽草酸标准品的比较而确定生色团的量。
本发明方法的实施中，较佳的是，对于未处理对照植物试验样品，它的生色团的检测至少有0.05吸光度单位(AU)的吸收值，为了从分光光度计测量生色团获得最佳效果的含最大量莽草酸/莽草羧基的试验样品，其生色团的检测少于2.0AU吸收值。申请者已发现，用致死量的草甘膦处理过的植物，大多数都积累了莽草酸/莽草羧基到如下水平：可将150mg叶组织以8倍(w/v)0.25N的盐酸研磨制成的水溶液5-10μL，加入250μL的高碘酸盐试剂和水而得到0.5毫升。在上述水溶液中，莽草酸/莽草羧基与高碘酸盐试剂反应之后，加入0.5毫升含有亚硫酸盐和氢氧化钠的混合液终止反应，得到1毫升溶液，其吸收值大约为1.8AU，而未处理的对照植物产生的吸收值大约为0.1AU。
本发明的一个较佳实施例中，用本发明方法来测定植物组织的酸性水抽提液中的莽草酸的存在和/或水平。在本发明的这个实施例中，组织的试验样品，宜是含有按本文所述用高碘酸或含有高碘酸盐和高碘酸的试剂处理，使莽草酸氧化制得的植物组织的水溶液的试验样品。将强碱加入该试验样品中，以产生生色团，再用亚硫酸盐稳定生色团。然后检测生色团的存在，从而表明试验样品中莽草酸的存在。可任选的，定量测定该试验样品中的生色团的量，以提供试验样品中的莽草酸量。
延迟检测和/或定量测定生色团达到至少1小时的能力，和不用额外的操作即能运用组织抽提的能力使得本发明方法非常适合于高通量筛选，以及其它的检测大量样品的情况。
例如，组织抽提可在96孔板或更小的塑料板中的少量的植物组织上进行，通过自动采样处理装置从中取出等份抽提液，以测定其吸收值。植物样品中的莽草酸量可以通过与莽草酸标准品的吸收值比较而确定。
                         具体实施方式实施例1-试剂的背景吸收
将250μL水、250μL高碘酸盐试剂、0.3毫升1N的NaOH和0.2毫升0.056M的Na2SO3混合，测定382nm的吸收值。吸收值是0.047，在5分钟内没有明显的漂移。选择0.056M的亚硫酸钠，是因其与加入的高碘酸盐的摩尔相等。
高碘酸盐试剂系将重量百分比0.5％的高碘酸和重量百分比0.5％的偏高碘酸钠溶于水中制成。
实施例2-莽草酸的检测
将2mM莽草酸的10μL样品加到240μL的水中。然后加入250μL的高碘酸盐试剂。37℃放置30分钟后，加入下列物质终止反应：a)0.3毫升1N的NaOH，接着加0.2毫升0.056M的亚硫酸钠；或者b)0.5毫升混合溶液，该溶液由0.3毫升1N的NaOH和0.2毫升0.056M亚硫酸钠混合而成(称为混合溶液)。在室温下，立即读取该溶液382nm的吸收值(A)，之后读取第5、30和60分钟的吸收值。作3组试验，取其平均值，其结果列于表1中。该结果表明在加入的莽草酸的存在下，382nm的吸收值增加。
                           表1加入试验溶液       T＝0分时        T＝5分时        T＝30分时        T＝60分时的物质            的A(382)       的A(382)        的A(382)         的A(382)先加NaOH，
                 0.949           0.949           0.941            0.924然后加Na2SO3加混合溶液           0.959           0.957           0.953            0.930加碱后再加入亚硫酸钠，使生色团具有超过30分钟的优异稳定性，60分钟后仅有大约3％的吸收值损失；而加入混合试剂，稍微增加了其敏感性，稳定性相当。混合溶液室温时可稳定大约12小时，但另外的试验可能显示它能稳定更长的时间。标准曲线的绘制
将表2的每一个条目所显示2mM莽草酸量加到在1.5毫升聚丙烯微型试管中，并加入水至250μL。然后加入250μL的高碘酸盐试剂，将该试管37℃放置30分钟。在第30分钟时加入NaOH/Na2SO3混合试剂。在5分钟内测完各生成溶液的382nm吸收值，将两组试验结果平均，其值列于表2中的第2栏。
                           表2加2mM莽草酸的     仅加水的A(382)    加了植物抽提液的A体积(μL)            值                 (382)值
0                 0.066                0.095
2                 0.218                0.266
4                 0.409                0.479
6                 0.575                0.66410                 0.944                1.02814                 1.243                1.320
将黑麦草(Lolium perrenne)培养在温室的土壤中2-3周，直到它长出3-4片叶子。采集其在空气中的部分，然后立即将此部分冷冻，维持在-80℃。为了制备植物抽提液，将大约1克的组织样品解冻并称量。在液氮中将组织冷冻，并用研钵和杵将其研磨成细粉末。然后加入相当于4倍组织重量体积的0.25N盐酸，再将得到的浆研磨5分钟。将此材料以25000转/分钟离心15分钟，用移液管将上清液移到琥珀色玻璃小瓶中。
重复上述绘制标准曲线的方法，但将5μL未处理的黑麦草(Lolium)抽提液加到每个试管中。其结果列在表2中的第三栏。如果将这些数据绘制成吸收值对所加莽草酸的曲线，将得到两条平行的直线。仅对于莽草酸而言，其研究数据表明，在这个试验步骤中，存在的莽草酸和其385nm的吸收值有直接的关系，其吸收值至少达到1.25AU。加入植物抽提液及莽草酸后所得的研究数据表明，未处理黑麦草(Lolium perrenne)抽提液含有少量的莽草酸，以及加入的植物抽提液并不影响到莽草酸的化学测试。

Claims (11)

1.一种检测水溶液中莽草酸的方法，其特征在于，它包括：
(a)用高碘酸或含有高碘酸盐和高碘酸的试剂氧化莽草酸；
(b)加入强碱，产生生色团；
(c)用亚硫酸盐稳定所述生色团；
(d)检测所述生色团的存在；以及可任选地
(e)定量测定所述生色团的量。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述强碱是氢氧化钠。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述亚硫酸盐是亚硫酸钠。
4.如权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(b)和(c)是通过加入含有亚硫酸盐和强碱的混合液同时进行。
5.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)用含高碘酸和高碘酸盐的试剂进行。
6.一种检测试验样品中的莽草酸的方法，它包括：
(a)用高碘酸或含有高碘酸盐和高碘酸的试剂处理试验样品；
(b)在所述试验样品中加入强碱，产生生色团；
(c)用亚硫酸盐稳定所述生色团；
(d)检测所述生色团的存在；以及可任选地
(e)定量测定所述生色团的量。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述强碱是氢氧化钠。
8.如权利要求6所述的方法，其中，所述试验样品是植物组织样品。
9.如权利要求6所述的方法，其中，所述亚硫酸盐是亚硫酸钠。
10.如权利要求6所述的方法，其中，所述步骤(b)和(c)加入含有亚硫酸盐和强碱的混合液同时进行。
11.如权利要求6所述的方法，其中，步骤(a)使用含高碘酸和高碘酸盐的试剂进行。
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