TWI223067B - Method of detecting shikimic acid - Google Patents
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223067 A7 __ B7 五、發明說明（1) 本發明镅域 本發明有關各種用以偵測莽草酸之方法，且尤其有關 能偵測植物性物質內莽草酸之方法〇 本發明背景 莽草酸乃由D-葡荀糖生物合成芳香族胺基酸如苯丙胺 酸、酪胺酸及白胺酸之一重要中間產物〇 草甘膦除草劑，N-(膦醯甲基）甘胺酸，抑制芳香族 胺基酸之生物合成，最終導致植物內莽草酸之累積〇草甘 膦爲5-烯醇丙酮基莽草酸鹽-3-磷酸鹽（EPSP)合成酶（芳 香族胺基酸生物合成路徑中之關鍵酵素）之强力抑制劑〇 草甘膦初期導致莽草酸鹽-3-磷酸鹽（EPSP合成酶之底質 )之累積，之後於植物內水解成莽草酸〇植物內莽草酸之 偵測可用以確定植物是否已暴露於草甘膦，且亦可用以確 定植物是否對除草劑有抗性〇
Gai tondeffl Gordon, J. Biol. Ch e m. , v o 1 . 230, no. 1，p.1 043-1 050揭示一種用以將莽草酸量化之方法，其中 以過碘酸將莽草酸之溶液氧化，添加氫氧化鈉以形成黃色 之發色基，且添加甘胺酸使顏色穩定〇然後在將氫氧化鈉 添加於該溶液之十分鐘內測量該溶液之光密度〇
Millican，Methods in Enzymology, v ο 1 . 17 A , p. 352-353，1 970揭示一種偵測莽草酸之方法，其中以過碘 酸將含有莽草酸之溶液氧化，然後用亞砷酸鹽處理。添加 硫代巴比土酸而該溶液成爲紅色。然後用環己嗣萃取該溶 液〇澄清之上方環己酮相含有該紅顏色，然後測定環己酮 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） ~ 一4- -----------裝------- 丨訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223067 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 ___B7_____ 五、發明說明（2) 相之光密度。
Singh 與Shaner ， Weed Technology, vol· 12, ρ·527 -530，1 998揭示一種偵測植物組織內莽草酸之方法，其中 用過碘酸將一含有莽草酸之試樣氧化。然後使該試樣與氫 氧化鈉混合，添加甘胺酸並讀取光密度〇
Siehl ，在 Herbicide Activity: Toxicology, B i ο -chemistry and Molecular Biology，R.M· Roc 等編輯， IOS press，1997, p.37-65中揭示一種用於酵素DAHP之分 析方法，其中酵素係在其磷酸烯醇丙酮酸底質及赤蘚糖-4-磷酸鹽存在時予以培育〇添加過碘酸使反應停止〇之後 添加亞硫酸鈉以減少超量之過碘酸鹽〇然後添加硫代巴比 土酸，而於十分鐘內繼以二甲基亞颯。之後測定549納米 之吸光度。 本發明綜沭 本發明提供一種偵測水液內莽草酸之方法，包含以下 步驟：（a)用過碘酸或一包含過碘酸鹽及過碘酸之試劑（ 過碘酸及該試劑在本文中合稱爲過碘酸鹽）將莽草酸氧化 ;(b)添加一强鹼以產生一發色基；（c)添加亞硫酸鹽使 該發色基安定；（d )偵測該發色基之存在；以及隨意（e ) 將該發色基之量量化〇該發色基之存在告知水液內有莽草 酸存在〇該發色基之量係直接與水液內莽草酸之量相關〇 在本發明之一較佳具體形式中，步驟b及c係同時用一包 含亞硫酸鹽及一强驗之混合物執行，以便同時出現超量過 碘酸鹽減少及產生發色基〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -5- -----------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223067 A7 __ B7 五、發明說明（3) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 申請人發現，過碘酸及過碘酸鹽之使用提供較過碘酸 單項更快速之與莽草酸反應時間，尤其在氧化反應以高於 周圍室溫之溫度實施時爲然〇 申請人額外發現，使用亞硫酸鹽減少超量過碘酸及過 碘酸鹽則大幅改善因莽草酸之氧化繼以强鹼之添加所產生 發色基之安定性。 申請人之方法亦可用以偵測組織內之莽草酸，較佳爲 植物組織。因此，本發明之另一方面爲提供一種用於偵測 試樣內莽草酸之方法，包含以下步驟：（a)用過碘酸或一 包含過碘酸鹽及過碘酸之試劑處理該試樣；（b )添加一强 鹼至該試樣以產生一發色基；（c)用亞硫酸鹽使該發色基 安定；（d )偵測該發色基之存在；以及隨意（e )將該發色 基之量量化〇該發色基之存在告知水液內有莽草酸存在。 該發色基之量直接與水液內莽草酸之量相關〇在本發明之 一較佳具體形式中，步驟b及c係同時用一包含亞硫酸鹽 及一强鹼之混合物執行，以便同時出現超量過碘酸鹽減少 及產生發色基〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 不同於一些舊有之莽草酸偵測方法，申請人之方法可 直接與組織萃取物併同使用〇無需硏磨或長時迴流植物性 物質即可生成合宜之組織萃取物〇此外，不同於一些其他 舊有方法，申請人之方法提供一更穩定之發色基，以使發 色基之偵測無需在將過碘酸氧化作用驟冷之後儘速發生〇 本發明方法直接與組織試樣併同使用之應用性、延遲發色 基偵測達至少一小時之能力、以及於生成發色基之隨意量 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -6- 1223067 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7_ 五、發明說明（4) 化使本發明良足適用於組織試樣之高通量篩檢〇 本發明之此等及其他方面列於以下本發明詳述中。 本發明詳沭 莽草酸係藉過碘酸予氧化以獲得反烏頭酸及二醛。當 添加足夠之氫氧化鈉將超量過碘酸移除而使pH升至1 0以上 ，在靜置時展現强烈之黃色〇經發現僅有莽草酸、金雞納 酸及白胺酸於鹼性條件下，在用過碘酸處理後產生黃顏色 之發色基〇由莽草酸形成黃顏色之作用（可能爲所形成二 醛之特徵）乃若干莽草酸偵測方法之基礎〇產生黃顏色之 發色基不穩定，故有些方法採用譬如甘胺酸之化合物使顏 色穩定〇申請人發現，亞硫酸鹽使發色基安定爲遠優於已 知之方法，故提供一可直接與組織試樣併同使用之方法。 本發明提供一種偵測水液內莽草酸之方法，包含以下 步驟：（a)用過碘酸或一包含過碘酸鹽及過碘酸之試劑（ 在本文中合稱爲過碘酸鹽）將莽草酸氧化；（b)添加一强 鹼以產生一發色基；（c)添加亞硫酸鹽使該發色基安定； (d )偵測該發色基之存在；以及隨意（e )將該發色基之量 量化〇該發色基之存在告知水液內有莽草酸存在◦該發色 基之量係直接與水液內莽草酸之量相關◦該水液可知爲含 有莽草酸，譬如當添加一已知量至水液以產生標準液時， 或予懸浮以含有莽草酸，譬如試樣〇 植物內莽草酸之偵測可用以確定植物是否已暴露於草 甘膦除草劑，且亦可用以確定植物是否對此除草劑具有抗 性〇因此，本發明之方法有用於需要偵測及/或量化莽草 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -----------裝·-------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223067 A7 ___B7__ 五、發明說明（5) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 酸之情況〇舉例言之，本發明之方法可用於篩檢植物或植 物組織或細胞以確定對草甘膦除草劑之抗性，或用於測試 農作植物以確定彼等是否已暴露於草甘膦。 本發明之方法便利在水液內執行0該水液可爲水或者 水與一水混溶性有機溶劑之混合物〇本發明之方法適合用 於各種類型之組織，包括植物、動物、及微生物組織0該 組織較佳爲植物組織0當使用組織試樣時’需先將莽早酸 萃入合宜之溶劑內，譬如水與一水混溶性有機溶劑之溶液 ，然後在有必要時將所得溶液澄清〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 莽草酸可用任何合宜之方法萃取自各種組織〇申請人 發現莽草酸可於室溫藉一由水與水混溶性有機溶劑組成之 溶液輕易且定量萃取自植物組織0該植物組織較佳爲事先 冷凍至約-4 °C以下。用以自該組織萃取莽草酸之溶液可具 有鹼性或酸性P Η 〇該水混溶性有機溶劑可爲任何可溶解莽 草酸之溶劑，較佳爲低分子醇，更佳爲異丙醇0該組織於 萃取溶液內培育直到全部或充份量之莽草酸已予萃取爲止 。萃取工作大致約在24小時後完成，但通常在16至24小時 後完成，甚至更快〇 萃取莽草酸之較佳溶液爲0·05Μ鹼金屬氫氧化物（在 水中）與異丙醇之2:1 (體積：體積）混合物0該鹼金屬 氫氧化物較佳爲氫氧化鈉或氫氧化鉀c 在一用以自植物組織萃取莽草酸之較佳方法中，冷凍 至約-4°C之組織予切成小塊，並浸入充份量之〇 · 〇5Μ氫氧 化鈉或氫氧化鉀（在水中）與異丙醇之2:1 (體積：體積 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -8- 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223067 A7 B7 五、發明說明（6) )混合物0 一般而言’爲方便計，每ο·1克之植物組織用 1毫升之萃取混合物，但其他萃取混合物：組織比例亦合 宜〇讓萃取工作在室溫進行直到無額外之莽草酸被萃入溶 液爲止。多種植物組織內之莽草酸以此步驟在16-22小時 內完全萃取0 於是可用本發明之方法分析該萃取混合物各等分量是 否存在莽草酸，無需額外之操作，而使此程序便利用於分 析大數量之試樣0舉例言之，組織萃取可就96井或類似塑 膠平板上之小量植物組織進行，各等分量可用自動試樣處 理設備自該等平板移去供測定吸光度，從而測定植物試樣 內之莽草酸量〇 莽草酸之氧化可用過碘酸或一包含過碘酸及過碘酸鹽 之試劑（過碘酸鹽試劑）予以完成0爲本文中易於指述， 過碘酸及該包含過碘酸與過碘酸鹽之試劑通稱爲過捵酸鹽 〇較佳爲將包含過硪酸與過碘酸鹽比例爲1:1之試劑用於 氧化。該試劑可在水中製成0.5 % (重量/體積）過碘酸 及0.5 % (重量/體積）偏過碘酸鈉〇將該過碘酸鹽添加 於一含有或疑似含有莽草酸之水液內◦將充份之過碘酸鹽 添加於該水液，故過碘酸鹽較水液內已知或疑似量之莽草 酸有相當之摩爾超量〇 莽草酸之氧化可在周圍室溫或高溫進行〇氧化作用較 佳爲發生於25與65 °C間之溫度，更佳爲35與5 0°C間0申請 人發現，莽草酸之氧化在37 °C時約於三十至四十五分鐘後 完成〇當氧化發生於周圍室溫時，氧化作用約需三小時0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐) " -9- 裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1223067 A7 B7__ 五、發明說明（7) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 將一產生發色基之强鹼添加於該水液使莽草酸之氧化 反應停止或驟冷，並添加亞硫酸鹽以減少超量之過確酸鹽 而使該發色基安定。較佳爲將一包含該强鹼及亞硫酸鹽之 混合物添加於該水液以使反應驟冷，同時使發色基安定〇 然而，有可能藉由分別添加該鹼及新製備之亞硫酸鹽溶液 完成此一步驟0 該鹼較佳爲强鹼譬如氫氧化物，該鹼更佳爲鹼金屬氫 氧化物譬如Μ氧化鈉或氫氧化鉀，最佳爲氫氧化鈉0添加 充份之鹼使水液成鹼性達pH高於10，較佳爲高於11。在本 發明方法中，較佳爲使該鹼與水或其他溶劑混合，更佳爲 使用該鹼與水之混合物〇將鹼及亞硫酸鹽添加於該水液產 生一安定發色基，其存在可於鹼及亞硫酸鹽添加後約達一 小時在水液內偵測0 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 亞硫酸係以足以使該因添加强鹼至已完成之過碘酸鹽 氧化反應所產生發色基安定之量，單獨或與强鹼混合添加 於該水液〇水液內所添加之亞硫酸鹽爲使亞硫酸鹽至少在 摩爾基準上與過碘酸鹽相同〇超量之亞硫酸鹽不干擾本發 明方法〇任何可溶形式之亞硫酸鹽均可用於本發明之方法 ，譬如鈉或鉀鹽，該亞硫酸鹽更佳爲亞硫酸鈉0本發明方 法中，該亞硫酸鹽較佳爲與水或其他溶劑混合，更佳爲使 用亞硫酸鹽與水之混合物〇 發色基之存在於該水液內（告知有莽草酸存在）可以 任何合宜之方法偵測，譬如使用分光光度計於382納米測 量光密度，或目視檢驗水液是否黃色。發色基在試樣內之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） — 10 — 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223067 A7 __B7__ 五、發明說明（8) 量可隨意予以量化，從而提供水液內之莽草酸量0量化工 作可用任何合宜之方法完成，譬如將一使用本發明方法所 製備之莽草酸標準液與已知量之莽草酸比較〇在本發明之 一較佳具體形式中，水液之光密度係用分光光度計於382 納米予以測量，而發色基之量係與一使用已知量之莽草酸 所產生之莽草酸標準液比較予以測定，並用分光光度計於 382納米予以測量〇 在執行本發明方法中偵測發色基時，未處理對照組植 物試樣宜有至少〇·〇5吸光度單位（AU)之吸光度，而具有最 大莽草酸/莽草酸鹽量之試樣具有至少2.0 AU之吸光度， 以便自發色基之分光光度計測値獲得最佳之結果〇申請人 發現大多數用致死量之草甘膦處理之植物將莽草酸/莽草 酸鹽累積至某一位準，使5-10微升之一由約150毫克葉組 織在8倍（重量/體積）之0.25N氫氯酸中硏磨所製備水 液可添加於2 50微升之過碘酸鹽試劑及水中，而獲得0.5 毫升之體積〇在與過碘酸鹽試劑反應及以0.5毫升包含亞 硫酸鹽與氫氧化鈉之混合物驟冷之後，會有1毫升吸光度 約爲1.8 AU之溶液，而未處理對照組植物則產生約0.1 AU 之吸光度〇 在本發明之一較佳具體形式中，本發明之方法係用以 測定莽草酸在酸性之植物組織萃取水液內之存在及/或位 準〇在此一本發明具體形式中，組織試樣（較佳爲由本文 中所製備植物組織水液予以構成之試樣）係用過碘酸或一 包含過碘酸鹽與過碘酸之試劑予以處理，以氧化莽草酸〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -11- -----------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1223067 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（9) 將一强鹼添加於該試樣以產生發色基，並用亞硫酸鹽使該 發色基安定。然後偵測發色基之存在，而此告知該試樣內 有莽草酸存在〇該試樣內發色基之量可隨意予以量化，以 提供試樣內之莽草酸量〇 將發色基之偵測及/或量化延遲長達至少至少之能力 及使用組織萃取物而無需額外操作之能力，使本發明之方 法甚爲適用於高通量篩檢及其他測試大數量試樣之場合。 舉例言之，組織萃取可就96井或類似塑膠平板上之小 量植物組織進行，各等分量可用自動試樣處理設備自該等 平板移去供測定吸光度，而植物試樣內之莽草酸量可與一 莽草酸標準液之吸光度比較予以測定〇 實例 實例1 -試劑之背景吸光度 將250微升之水、2 5 0微升之過碘酸鹽試劑、0.3毫 升IN NaOH及0,2毫升之0.056M Na2S03 混合，並於382 納米測量吸光度0吸光度爲〇 · ，且在五分鐘內不顯著 漂移〇 0.0 5 6M濃度之亞硫酸鈉係選定爲與所添加之過碘酸 鹽等摩爾〇 過碘酸鹽試劑在水中製備成0.5重量％過碘酸及0.5 重量％偏過碘酸鈉0 管例2 -莽草酸之偵測 將2 mM莽草酸之1〇微升試樣添加於240微升之水中〇 然後添加250微升之過碘酸鹽試劑。於37 °C達30分鐘後， 用（a) 0.3毫升之IN NaOH繼以0.2毫升之0.056M亞硫酸 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 、 一12 — 1 ------------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1223067 A7 B7 五、發明說明（10) 鈉，或（b) 0.5毫升由〇·3毫升之IN NaOH及0·2毫升之 0.056Μ亞硫酸鈉混合所製備之組合溶液（稱爲組合溶液） 將反應驟冷。該溶液於382納米之吸光度（Α)予立即讀取 ，然後於室溫靜置5 、30、及6 0分鐘之後爲之。表1中所 示由複製3份平均所得之結果證實382納米吸光度在存在 添加莽草酸時增大〇
Μ_L 添加於 τ=0分鐘時 τ=5分鐘時Τ=30分鐘時Τ=60分鐘時 分析溶液_少A (382) 之A (382)之A (382)之A (382)
NaOH 然後亞硫酸鈉 0.049 0.949 0.941 0.924 組合溶液 〇·959 0.957 0.953 0.930 鹼繼以亞硫酸鈉之添加提供一在30分鐘內具有優異安 定性且在60分鐘後僅約3 %吸光度損失之發色基，而組合 試劑之添加提供稍爲增加之靈敏度及同等之安定性〇該組 合溶液在室溫時穩定達約1 2小時，但額外之測試可能顯示 穩定之時間較長〇 校正曲線之製備—表2中各筆所指示2 mM莽草酸之量係置 於1.5毫升裝聚丙烯微量試管內，用水加成250微升〇然 後添加250微升之過碘酸鹽試劑，並於37 °C維持各試管30 分鐘，而於該時間添加0.5毫升之HaOH/亞硫酸鹽組合試 劑。於5分鐘內測定每一所得溶液之382納米吸光度，並 將複製2份獲得平均示於表2之第二欄內〇 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格(210 X 297公釐） -13一 -----------裝--------訂---------線 (請先閱讀背面之注音？事項再填寫本頁) 1223067 A7 B7 五、發明說明（11) m___2 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 2 mM莽草酸鹽 僅用水之 植物萃取物 之微升數_A ( 38 2 )_之A ( 382 ) 0 0.066 0 .095 2 0.218 0.266 4 0.409 0 .479 6 0.575 0.664 10 0 .944 1.028 14 1 .243 1.320 在溫室內讓Lolium perrenne生長於土中2-3週，直 到植物有3-4片葉子之階段〇收取各植物之地上部份，並 立即置於維持在-80 °C之冷凍箱內〇將約1克之組織試樣 解凍並稱重供製備植物萃取物〇將植物冷凍於液態氮內， 並用硏缽及杵磨成細粉。然後，添加容積等於4倍組織重 量之0.2 5N HC1 ，並將漿液另外硏磨5分鐘。此一物質以 25，00 〇X g離心15分鐘，並用吸管移除上澄液且保持於琥 珀色玻璃瓶內〇 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 重複製備校正曲線所用之方法，唯將5微升未處理之 Lol ium萃取物添加於每一試管〇各項結果示於表2之第三 欄內〇若將此等資料繪製成吸光度對所添加莽草酸鹽之圖 形，即獲得二條平行之直線。莽草酸鹽單項硏究之資料顯 示此一分析步驟在所存在莽草酸鹽與382納米吸光度間獲 得直接之相關性，至少高至約1 . 25之吸光度爲然〇該一植 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -14- 1223067 A7 B7 -----——--------- 五、發明說明（12) 物萃取物係隨莽草酸鹽添加之硏究資料同時證實未經處理 Lolium perrenne之萃取物含有小量之莽草酸，且植物萃 取物之添加並不干擾此種莽草酸鹽化學分析0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） -15-
Claims (1)
1223067 A8 B8 C8 D8_ 六、申請專利範圍 7 ·如申請專利範圍第6項之方法，其中所述强鹼爲氫 氧化鈉。 8 ·如申請專利範圍第6項之方法，其中所述試樣爲植 物組織試樣〇 9 ·如申請專利範圍第6項之方法，其中所述亞硫酸鹽 爲亞硫酸鈉〇 1 〇 ·如申請專利範圍第6項之方法，其中所述步驟b及 c係同時用一包含亞硫酸鹽及强鹼之混合物執行〇 11·如申請專利範圍第6項之方法，其中步驟（a)係用 一包含過碘酸及過碘酸鹽之試劑執行。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐） 申請曰期 89.02.03 案 號 ~ " 8FID2UUb 類 別 (以上各欄由本局填註）
aV 口 霉墨專利説明書1223067 發明 新型 名稱 發明 創作> 中 文 英 文 姓 名 國 籍 住、居所 姓 名 (名稱） f專贼负則汰 METHOD OF DETECTING SHIKIMIC ACID 1. 湯瑪斯克洛瑪蒂2. 尼古拉寶吉 .美國英國 1. 美國加州阿伯尼皮爾斯街555號1142公寓2. 美國加州柔納公園馬堤道121¾ 英商欣健達有限公司 裝 訂 線 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 申請人 國 籍 住、居所 (事務所 代表 姓 名 英國 英國沙f言禹褐炒雷钟兔匾普利斯晻欧叫區域寺心、 琦爭爾痛、隹'勒 本紙張尺度適用中國國家標準（CNs ) A4規格（21〇X297公釐） 1223067 A8 、 B8 L.10.1·修正） 舄 j~ -1 --- 六、申請專利範圍 广二钊‘‘ 1 . 一種偵測水液中莽草酸之方法，包含以下步驟·· (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) (a) 用過碘酸或一包含過碘酸鹽及過碘酸之試劑將 莽草酸氧'化； (b) 添加一足以使水液成鹼性達pH高於10之强驗以 產生一發色基； (c) 用亞硫酸鹽使所述發色基安定； (d) 偵測所述發色基之存在；以及 隨意（e)將所述發色基之量量化。 2 .如申請專利範圍第1項之方法，其中所述强鹼爲氫 氧化鈉。 3 .如申請專利範圍第1項之方法，其中所述亞硫酸鹽 爲亞硫酸鈉。 4 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中所述步驟b及 c係同時用一包含亞硫酸鹽及一强鹼之混合物執行〇 5 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中步驟（a )係用 一包含過碘酸及過碘酸鹽之試劑執行〇 6 · —種偵測試樣內莽草酸之方法，包含以下步驟： 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 (a) 用過碘酸或一包含過碘酸鹽及過碘酸之試劑處 理一試樣； (b) 對所述試樣添加一足以使其成鹼性達pH高於1〇 之强鹼以產生一發色基； (c) 用亞硫酸鹽使所述發色基安定； (d )偵測所述發色基之存在；以及 隨意（e)將所述發色基之量量化。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)A4規格（210 X 297公釐）
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