CN1346280A - 败血症治疗用免疫吸附剂 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及败血症治疗用免疫吸附剂,尤其涉及用于除去补体因子和脂多糖(LPS)的免疫吸附剂,以及视需要而定用于除去其他败血症介体如TNF和源于体液的淋巴细胞因子的免疫吸附剂。本发明还涉及该免疫吸附剂的制备方法与应用。

Description

败血症治疗用免疫吸附剂
本发明涉及败血症治疗用免疫吸附剂，尤其涉及用于除去补体因子和脂多糖(LPS)的免疫吸附剂，以及视需要而定，用于除去其他败血症介体如TNF和体液淋巴激活素的免疫吸附剂。本发明还涉及该免疫吸附剂的制备方法与应用。
在美国、日本和欧洲，每年约有350万患者得败血症。这些国家居民总人数为7亿8千5百万，患病率小于0.5％。但若对住院患者进行发病率诊查，人们却发现每100收住病例中有2.0±0.16例为败血症。观察得知，这些患者中约有25％的人即使由资深专科医生在装备现代化的设施(监护病房)中进行最努力的医疗护理，也会患败血性休克综合症，而该综合症的特征是致死率＞45％，所以这种发现在保健政策方面和个体性方面有着极大重要性。
尤其对多创伤性患者(交通事故、烧伤、高难手术)来说，败血性休克的疾病危险程度非常高。除了外部感染之外，由于这些病人部分丧失免疫系统功能，抵御通常存在于肠道中的革兰氏阴性菌的肠道屏障被穿破，从而可确认有内部感染。
在50％以上的疾病中，革兰氏阴性菌或其由内毒素(脂多糖即LPS)组成的细胞壁组成部分，都会诱发败血性休克。所述细菌释出的LPS与血清蛋白质(LBP)结合，以便继而被单核细胞/巨噬细胞(CD14)的LPS受体吸收。如此活化后的CD14+细胞产生细胞因子(TNFα、淋巴激活素-1(IL-1)、IL-6、IL-8)，它们经由靶细胞的细胞因子受体起作用。
在刺激单核细胞和巨噬细胞的同时，补体系统得以活化。这是哺乳动物用于直接和非特异性防治细菌类微生物及异物颗粒的免疫性防御所必不可缺的组成部分。存在于血清的补体蛋白质中，占优先地位的是经蛋白水解裂解活化的前酶，血清浓度约1g/1的C3-蛋白质起着重要作用。微生物与C3接触后，补体蛋白质C3a发生裂解，并一方面借助所产生的C3b形成C5转化酶(补体活化的另一种方法)，另一方面反应因此而扩展，C3b通过血清因子积聚而变成C3转化酶。同样存在于血清中的补体蛋白质C5，这时由于此种加大提供的C5转化酶而发生蛋白水解分裂，形成C5a。其他补体蛋白质(C6-C9)在所产生的C5b上积聚，直到最后形成聚合物类疏水性胞膜攻击配合物(Membranangriffskomplex，缩写为MAK)，该胞膜攻击配合物插入细菌胞质膜(调理素作用，Opsonidierung)并形成孔隙，这些孔隙产生吞噬作用，从而消除微生物(并消除所结合的MAK)。由于血管通透性提高和因血管通透性提高而诱导化学吸引素(Chemotoxinen)释出，致使补体活化过程中释出的补体因子C3a和C5a(过敏毒素)引诱细菌侵袭位置上的吞噬细胞。细菌数减少引起补体系统激活作用降低。这种直接而非特异性的反应与其他免疫防御系统在例如通过补体因子来调节主导细胞防御的细胞因子的合成和释放的范围内密切交错。为介导炎症效应起见，使C3a和C5a与对细胞固有受体特异的受体结合，这些受体因免疫反应性而异，又被不同程度地强烈表达。为不断获得能随时反应的免疫防御起见，活化补体因子不仅在微生物侵袭后可检测，而且常人血清不可缺少的组成部分浓度为1-10ng/ml。
尤其在进行性败血症情况下、在急性肺衰竭情况下以及在患者濒死情况下，过敏毒素的血浆中含有量提高一千倍以上。
为消除那些因具有预料中的副作用而几乎不能在活体条件下进行试验的各种不同补体因子所致影响起见，几乎除了以活体外为基础的诊查还存在着一些最不相同的大多数起非特异性作用的溶液变更(例如WO-A-98/34959)。
在活体内预防补体活化方法中，借助人工体外表面(例如表层)，成功地进行了非特异性补体去活化作用。此外，由US5,853,722还已知使用特异性C5抗体来选择性清除活性补体因子，而且还无疑地优选生成间歇对抗补体系统所有组分的特高亲和性抗体。
这些阐明功能的链锁特别有利于对侵入机体的细菌进行清除。然而，入侵细菌数目及/或病毒性和免疫系统除菌能力(例如外伤后免疫缺陷时)之间一出现不一致，就观察到过剩的激活作用，接着伴随这种过剩的激活作用，大量释放“休克介体”(淋巴激活素、血小板激活因子(PAF)、还有氧自由基、前列腺素及其代谢产物)，进一步消减对LPS的除菌能力。此外，由于血浆中可溶性CD14(sCD14)作为LPS捕捉者存在，它使与细胞的结合变得容易一些，并诱导其他休克介体形成和释放，因此而增加有缺陷的环，所以借助LPS还使CD14阴性细胞(例如内皮)活化。由于休克介体虽然选择性起作用而并不起特异作用，所以在不同细胞和器官中观察到功能局限性(凝血系统、循环、补体系统)，以致侵袭整个机体的炎症反应导致休克发生，这就导致不可逆器官损伤、循环衰竭，并导致死亡。
为突破此机能链起见，曾研究过各种不同的治疗方略。
在不同的动物试验败血症模型上，虽然成果给人留下深刻印象，但分别中断抗体链锁和拮抗药链锁，而所述抗体中断蛋白质(LBP、sCD14)上、受体(CD14)上、释出的细胞分裂素上或者细胞素受体上的LPS结合，所述拮抗药则阻滞受体作用的范围，所以迄今为止还没有临床试验上卓有成效的预防及/或治疗方面的研究结果。
由于必须不断清楚地看到，LPS还影响到细胞和组织，而且其不被这种治疗配药损害的机能状态发生了变化，所以高度的期待不能予以满足。此外还须考虑到，必须消除掉被抗体/拮抗药灭活的LPS(免疫复合体)，以便永久消除生物反应活性。然而，清除也是免疫系统的函数，它由于强烈减弱，而使该目的几乎不能或者仅能非常不完美实现。
败血性休克的进行是一种非常动态发生的病程，最初以不同的程度发生，在短时间中，不同介体引起非常不同的反应，然后按照无抵抗力生命维持的作用迅速因调节失调而导致败血性休克明显形成。
本发明赖以为基础的目的在于，研制一种尤其用于体外解毒、使患者特异性血浆含量和组织含量有可能降低的预构免疫吸收系统。
此外，本发明还以TNFα在该调节系统中占据主要地位的发现为基础。它通过大相径庭的“外部”影响如外伤、炎症、感染、败血症等等由巨噬细胞释出，并经由细胞因子链锁(IL-1、IL-6)诱导非特异性和特异性防御系统的局部激活作用和系统性激活作用。临床上表现出来的是，体温高时大量释放TNFα、食欲不振以及降解代谢型代谢状况的所有后遗症状。败血症发病机理中，在疾病早期，看来巨噬细胞激活作用和因此而引起的TNFα释放，对病人能否活下来有着本质上的意义，然而在后续过程中，激活状态中断引起所有防御反应代偿失调。
本发明的上述目的借助一种败血症治疗用免疫吸附剂来实现。本发明免疫吸附剂尤其用来清除补体因子和脂多糖(LPS)，以及视需要而定，用来清除其他败血症介体，如TNF和体液中的淋巴激活素。该吸附剂以其载体材料为特征，所述载体材料由有机聚合物或合成聚合物制成，其上不仅结合了抗补体因子C3a及/或C5a的多克隆抗体或单克隆抗体，而且还结合了抗脂多糖(LPS)的抗体。在一种优选实施方式，还有抗其他败血症介体的抗体与所述载体结合。
优选涉及的是多克隆抗体，尤其优选涉及的是IgY型的aviaere抗体。根据调节障碍的状况，含有抗败血症介体的抗体。
在此情况下，本发明涉及那些抗TNF、IL1、IL6、IL8及/或IL10的抗体。
抗补体因子C3a的优选抗体，至少对下列肽序列中的一种肽具有特异活性：
NH2-KCCEDGMRQNPMR-COOH
NH2-RFSCQRRTRFISL-COOH
NH2-ITELRRQHARAS-COOH
抗补体因子C5a的优选抗体，至少对下列肽序列中的一种肽具有特异活性：
NH2-QADYKDDDDKLPAE-COOH
NH2-DDKLPAEGLDIENS-COOH
抗IL1α/β的优选抗体，至少对下列肽序列中的一种肽具有特异活性
NH2-NCYSENEEDSSSID-COOH
NH2-GAYKSSKDDAKIT-COOH
NH2-WETHGTKNYFTS-COOH
NH2-RISDHHYSKGFRQA-COOH
NH2-VQGEESNDKIPVA-COOH
NH2-ESVDPKNYPKKKMEKRF-COOH
抗IL6的优选抗体，至少对下列肽序列中的一种肽具有特异活性
NH2-APHRQPLTSSERIDKQI-COOH
NH2-QNRFESSEEQARA-COOH
NH2-AITTPDPTTNAS-COOH
抗IL10的优选抗体，至少对下列肽序列中的一种肽具有特异活性
NH2-SPGQGTQSENSCT-COOH
NH2-QMKDQLDNLLLKES-CCOH
NH2-MPQAENQDPDIKA-COOH
NH2-LPCENKSKAVEQ-COOH
抗TNFα的优选抗体，至少对下列肽序列中的一种肽具有特异活性
NH2-VRSSSRTPSDKPVA-COOH
NH2-KSPCQRETPEGAEAKPW-COOH
本发明免疫吸附剂以本身常用的膜或颗粒作为载体材料，所述膜或颗粒由有机或合成聚合物制成，例如由聚苯乙烯、碳水化合物如纤维素衍生物或琼脂糖衍生物制成，或者由丙烯酸盐制成，因此特异抗体可与载体材料共价结合，或者经由间隔序列或联结子固定在载体材料上。
本发明免疫吸附剂借助本身已知的方法来制备，制备时使抗C3a及/或C5a及LPS以及视需要而定抗其他败血症介体的抗体与由有机聚合物或合成聚合物制成的载体材料共价结合，或者以吸附方式与所述载体材料偶合。
所述特异抗体用本身已知的免疫接种法来制造，优选用具有相应抗原的小型哺乳动物如小鼠、大鼠或家兔或者禽类如母鸡来制备。
本发明的主题还包括本发明免疫吸附剂在装置中清除补体因子、LPS和视需要而定清除来源于体液如血浆等因患者特异性情况而异的其他介体方面的应用。
优选将本发明免疫吸附剂用于对患有败血症或败血性休克的病人进行去血浆疗法的败血症治疗。
虽然对大多数物质(Substanzen)都可用能按已知方法与不同载体偶合的抗体，但是优选使用鸟类(aviaere)抗体，因为与哺乳动物抗体相反，这种抗体不能激活。由于活化性能受哺乳动物抗体fc部分的制约，原则上也可使用以番木瓜蛋白酶裂解的Fab断片。
按照目前的了解程度，固定的鸟类(aviaere)抗体对人类丝毫没有非特异性作用。以常规方法对鸟，优选母鸡不用或采用辅剂进行免疫接种。在蛋黄中析出特异免疫球蛋白，并且使之能以常规方法从中分离出来。以已知方法使之经由fc部分与大颗粒或膜共价结合。
本发明体外解毒免疫吸附系统首先提供了一种选择性系统，它可患者特异性地使用，并能消除免疫系统的调节失常。
下列各实施例进一步阐明本发明：
实施例1
用免疫原肽制备多克隆抗体：
用固相合成法制造表1中列举的肽：
                        表1
    肽序列     抗原
    KCCEDGMRQNPMR C3a
    RFSCQRRTRFISL
    ITELRRQHARAS
    QADYKDDDDKLPAE C5a
    DDKLPAEGLDIENS
    SPGQGTQSENSCT IL10
    QMKDQLDNLLLKES
    MPQAENQDPDIKA
    LPCENKSKAVEQ
    NCYSENEEDSSSID IL1α
    GAYKSSKDDAKIT
    WETHGTKNYFTS
    RISDHHYSKGFRQA IL1β
    VQGEESNDKIPVA
    ESVDPKNYPKKKMEKRF
    APHRQPLTSSERIDKQI IL6
    QNRFESSEEQARA
    AITTPDPTTNAS
    VRSSSRTPSDKPVA TNFα
    KSPCQRETPEGAEAKPW
使制得的肽与载体(KLH)共价结合。使所述轭合物溶于PBS，与等份弗罗因德氏佐剂混合。将每次接种剂量调节得使之含有归属相应抗原的肽各200μg。用这些混合物对15周龄的幼母鸡进行免疫接种，并且在4周时间内增效4次。
实施例2
用脂多糖(LPS)制备多克隆抗体
将埃希氏大肠杆菌J5的纯化LPS(SIGMA公司出品)溶于PBS，并与等份弗罗因德氏佐剂混合。用此混合物对15周龄的幼母鸡s.c.进行免疫接种。LPS剂量为每次免疫接种1毫克LPS。在4周时间内进行4次增效。
实施例3
从卵黄中提取抗体(IgY)：
收集窝中免疫接种后母鸡下的蛋。分离出含抗体卵黄后，将之贮藏于-20℃下。按照需要将蛋黄解冻，并且按下列程式进行预加工(C.Schwarzkopf，B.Thiele(1996)ALTEX 13 Suppl.16，35-3)：
A TBS：20mM Tris/HCl，pH7.5，0.5M NaCl
B 10％(w/v)硫酸葡萄糖溶于A所成的溶液  溶液
C 1M CaCl2
D 0.5M EDTA，pH7.5
E饱和硫酸铵溶液
将蛋黄(每个蛋黄的体积相当于10-20ml)悬浮于100ml TBS中。用硫酸葡萄糖(6ml B每100ml TBS蛋黄悬浮液)和Ca++(15ml C每100ml TBS蛋黄悬浮液)使脂质和脂蛋白沉淀，室温下搅拌30至60min并用5,000转/分钟进行离心分离。所得片状沉淀物用小体积TBS(约20ml/g蛋黄)洗涤，并再次进行离心分离。
合并后的上清液用纸过滤器进行过滤，然后向滤液中添加0.5M EDTA，直至最终浓度约为30mm EDTA(6ml每100ml)，以牢固结合剩余的Ca++离子。接着，每100ml上清液加入24.3克硫酸铵(相当于40％饱和)，并在+4℃下保温30min。所产生沉淀物(IgY)先用30％(NH4)2SO4(30mlE+70ml蒸馏水)进行洗涤、离心分离，然后以尽可能最小的体积溶解TBS(约10ml/所用的蛋黄)，并对TBS进行透析。
IgY的含量在275nm光条件下用光度测定法进行测定。
实施例4
a)载体活化：
使按实施例3除杂的IgY与相宜的载体共价结合。为此，例如可如下所述，使琼脂糖珠活化(H.-F.Boeden，W.Büttner，C.Rupprich，D.Büttner，S.Heinrich，M.Becker，M.Holtzhauer(1992)Makromol.Chem.193，865-887)：
将所述琼脂糖载体分多步，也即以逐步增加20％的量转化成丙酮。最后，在密闭容器中，将五倍于流化床床体积的载体用无水丙酮静置过夜，并再次用5至10体积的无水丙酮洗涤，并用G2玻璃漏斗迅速吸滤。向10ml沉淀后的载体添加400mg N-(氯代羰氧基)-5-降冰片烯-2，3-二羧基酰亚胺(ClCOONB)溶于10ml无水丙酮p.a.所成的溶液。边摇振边在15分钟内滴加由280μl三乙胺和20毫克4-二甲基氨基-吡啶(DMAP)溶于5ml无水丙酮所成的溶液(摩尔比ClCOONB∶三乙胺∶DMAP1∶1，2∶0，1)。接着，再摇振15分钟，然后用约200ml无水丙酮洗涤载体。
b)固态载体与IgY的结合
分多步将按实施例4a)进行过活化的多糖基质(凝胶)转移到水基介质中，然后立即搅入含有配位体的偶联溶液中。将pH4.2的柠檬酸盐缓冲液用作偶联缓冲液。室温下轻轻摇振2小时，进行偶联。接着，添加乙醇胺，将自由键封闭。表2中示明各别抗体的具体条件。
                        表2
凝胶编号   鸡-Ak(IgY) mg mg/ml   Ak-溶液(ml) ml偶合缓冲液(柠檬酸盐，0，1M，pH4，2) 乙醇胺1M(ml)   湿凝胶Gel(g)
    1  ChaIL1  13.5     0.7     4.3     0.5     5.55
    2  ChaIL6 9.8   9.8     1.0     4.0     0.5     5.58
    3  ChaIL10 9.2   7.4     1.2     3.8     0.5     5.55
    4  ChaTNF 11.0   11.6     1.0     4.1     0.5     5.56
    5  ChaLPS 11.6   13.7     0.9     4.2     0.5     5.60
    6  ChaC3a 6.9   10.7     0.6     4.4     0.5     5.57
    7  ChaC5a 11.3   11.1     1.0     4.0     0.5     5.55
    8     对比 0.0   0.0     0.0     5.0     0.5     5.61
实施例5
使用按实施例4固定的抗体，以便从液态介质如缓冲液、血清脂多糖或血浆脂多糖中除掉淋巴激活素、TNF或者补体因子。
为此，对载体进行洗涤，转移到生理缓冲液(PBS)中，并装入无气泡塑料柱或玻璃柱中。连接色谱仪，把装置配成套。这时，可借助重力或用相宜的泵，经由固定的、对所举抗原特异的抗体，引入待吸附的材料样品(添加了抗原的缓冲溶液、掺杂或含自然抗原的血清样品或血浆样品)。现存的抗原被IgY辨出，牢固结合，从而从流过分离柱的介质中分离出来。经柱流分析(ELISA)，柱流中抗原含量减少，证明有效。分离柱经生理缓冲溶液洗涤后，以相宜洗脱剂(0.1M柠檬酸盐缓冲液，pH3)脱附结合抗原，分馏并分析洗脱液。抗原的定量测定用来确定免疫吸附剂的吸附容量。

Claims (17)

1.败血症治疗用免疫吸附剂，其特征在于，
载体材料由有机聚合物或合成聚合物制成，载有抗补体因子C3a及/或C5a并抗脂多糖(LPS)的结合多克隆抗体或结合单克隆抗体，以及视需要而定，载有抗其他败血症介体的抗体。
2.权利要求1所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体。
3.权利要求2所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述抗体为IgY型鸟抗体。
4.权利要求1至3所述的免疫吸附剂，其特征在于，根据调节障碍的状况，含有其他抗败血症介体的抗体。
5.权利要求1和4所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述抗体为抗TNF、IL1、IL6、IL8及/或IL10的抗体。
6.权利要求1所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述结合抗体针对至少一种下列补体因子C3a以及C5a的肽序列：
C3a：NH2-KCCEDGMRQNPMR-COOH
NH2-RFSCQRRTRFISL-COOH
NH2-ITELRRQHARAS-COOH
C5a：NH2-QADYKDDDDKLPAE-COOH
NH2-DDKLPAEGLDIENS-COOH。
7.权利要求5所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述结合抗体针对至少一种下列白细胞介素1α以及1β的肽序列：
IL1α：NH2-NCYSENEEDSSSID-COOH
NH2-GAYKSSKDDAKIT-COOH
NH2-WETHGTKNYFTS-COOH
IL1β：NH2-RISDHHYSKGFRQA-COOH
NH2-VQGEESNDKIPVA-COOH
NH2-ESVDPKNYPKKKMEKRF-COOH。
8.权利要求5所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述结合抗体针对至少一种下列淋巴细胞激活因子6的肽序列：
IL6：NH2-APHRQPLTSSERIDKQI-COOH
NH2-QNRFESSEEQARA-COOH
NH2-AITTPDPTTNAS-COOH。
9.权利要求5所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述结合抗体针对至少一种下列淋巴细胞激活因子10的肽序列：
IL10：NH2-SPGQGTQSENSCT-COOH
NH2-QMKDQLDNLLLKES-CCOH
NH2-MPQAENQDPDIKA-COOH
NH2-LPCENKSKAVEQ-COOH。
10.权利要求5所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述结合抗体针对至少一种下列肽序列：
TNFα：NH2-VRSSSRTPSDKPVA-COOH
NH2-KSPCQRETPEGAEAKPW-COOH。
11.权利要求1至10所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述有机或合成载体材料由聚苯乙烯、碳水化合物如纤维素衍生物或琼脂糖衍生物或者丙烯酸盐(酯)制成的膜或颗粒构成。
12.权利要求1至11中任何一项所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述特异抗体与膜或颗粒共价结合。
13.权利要求1至11中任何一项所述的免疫吸附剂，其特征在于，所述抗体经由间隔序列或联结子固定在载体材料上。
14.权利要求1至13所述免疫吸附剂的制备方法，其特征在于，抗体与载体材料由有机聚合物或合成聚合物制成的载体材料共价结合或以吸附方式结合，所述抗体针对C3a及/或C5a及LPS，以及视需要而定针对其他败血症介体。
15.权利要求14所述的方法，其特征在于，所述抗体经免疫法，优选对小型哺乳动物如小鼠、大鼠或家兔或者禽类如鸡进行免疫，用相应的抗原来制造。
16.权利要求1至13所述免疫吸附剂作清除补体因子、LPS以及视需要而定、源于体液的患者特异性组合物中其他介体器件有效组成部分的应用。
17.权利要求16所述的应用，其特征在于，所述免疫吸附剂用于对败血症或败血性休克及其他炎症并发疾病的患者进行去血浆疗法。
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