CN1325911C - 一种含有微量三七总皂苷的样品的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种含有微量三七总皂苷的样品的检测方法，能测定样品中低浓度的以人参二醇和/或人参三醇为次生苷元的三七总皂苷。本发明采用酸水解样品中的三七总皂苷，将其转化成为人参二醇和/或人参三醇，经高效液相/电喷雾串联二级质谱系统进行分析，准确地测定人参二醇和/或人参三醇的浓度，从而准确地反映对应的三七总皂苷的浓度。该方法的效果是特别适合于以人参二醇和/或人参三醇为次生苷元的三七总皂苷的血药浓度的检测，以评价生物体对三七总皂苷的生物吸收和作用机理。
Description
技术领域：
本发明提供一种含有微量三七总皂苷的样品的检测方法，能测定含有微量的以人参二醇和/或人参三醇为次生苷元的三七总皂苷的样品。
背景技术：
达玛甾烷型四环三萜皂苷是中药三七(Panax notoginseng F.H.Chen以及himalaicus)中的主要活性成分。其苷元主要有20(S)-原人参二醇和20(S)-原人参三醇两种，在C3、C12和C20位有β-OH存在。原人参二醇和原人参三醇的区别仅在于后者还具有C6位的α-OH。成苷的位置通常在C3、C20和C6位，其相应的各种苷的结构如附图11所示。
原人参二醇型皂苷和原人参三醇型皂苷在生物体内进行一系列复杂的转化，虽然对于它们的作用机理已有大量研究报道，现有技术都只是测定了粪便、尿液、肠容物、注射后血浆中的皂苷及其代谢物的浓度，但是由于口服这两类皂苷后，它们及其代谢物在血浆中的浓度太低，无法检测，对于对其生物利用度，体内作用机制无法深入研究(何希辉、炎彬、潘卫松，等，三七皂苷中R1、Rg1在正常和脑缺血再灌大鼠中的动力学变化，[J]中药药理和临床，2001，17(6)12-14)、(王毅，刘铁汉，王巍，等人参皂苷Rg1的肠内菌代谢及其代谢产物吸入血的研究[J] 药学学报，2000，35(4)：284.)(王毅，刘铁汉，王巍，等肠内菌群对人参皂苷Rg1的代谢转化作用的研究[J]中国中药杂志，2001，26(3)：188)、(Akao T，Kida H，KanaokaM，Hattori M，et，Intcstinal bacterial hydrolysis is required for the apperance ofcompound K in rat plasma after oral administration of ginsenoside Rbl from Panaxginseng.J Pharm Pharmacol 1998 Oct，50(10)：1155.)。由于没有发现在体内代谢的过程中，上述两种类型皂苷的体内代谢物的母核结构发生了改变，因此，如果建立苷元或次生苷元与苷及其代谢物之间的关系，建立一种方法，通过测定苷元或次生苷元的含量，反映相应的苷或苷的代谢物的量，将有利于上述研究的发展。
人参二醇、人参三醇及其相应皂苷的分析方法有大量的研究，有光谱法和色谱法，其中HPLC由于对相似结构的化合物分离度高，定量分析精度高，结果准确，常用于分析含有人参二醇、人参三醇及其相应皂苷的药材和制剂，具体有HPLC-UV，HPLC-IR，HPLC-ELSD，HPLC-MS，HPLC等方法(三七及其制剂中化学成分分析方法概述，黄永焯，王宁生，[J]中药新药与临床药理，2002年月13卷第3期194-197)。人参皂苷Rg1的化学结构式见附图12
人参二醇和人参三醇成苷的位置通常在C3、C20和C6位。由于苷键属缩醛结构，极易被催化降解。酸水解依条件不同，酸水解产物分为完全水解和部分水解。C20位的构型极易受酸的影响转位，发生互变异构现象，形成处于平衡状态的二种异构体的混合物。当酸性比较强时，如由于水解条件比较剧烈，可断裂所有的糖苷键，生成人参二醇和人参三醇(李云华等.超临界流体色谱法测定三七及云南白药中人参二醇和人参三醇的含量.药学学报，1991，26(10)：764。杨崇仁等.三七中达玛甾烷型皂甙的热不稳定性及酸水解产物.云南植物研究，1986，8(1)：87)。人参皂苷的全水解产物较复杂。酸解引起苷元结构发生变化，得不到原苷元。(张树臣主编.中国人参[M].上海：上海科技教育出版社，1992.93-149.)在温和酸条件下水解，可保留一部分糖苷键，得到次生皂苷，如用0.7％H2SO4或0.1NHCl等进行水解。如人参皂苷Rg1在0.1NHCl水解下生成次生苷人参皂苷-Rh1及其C20差向异构体20(R)-人参皂苷-Rh1和它们的C24-C25水合产物.(HanBH，Park M H，Han Y Netal.Degradatio，of ginseng saponins under mild acidicconditions[J]，Planta Med，1982，44：146-149).(Tsutomu O，Hisayuki T，Yoshio T.Studieson the Absorption，Distribution，Excretion and Metabolism of Ginseng SaponinsIV，Decomposition of Ginsenoside Rg1 and Rb1 the Digestive Tract of Rats.Chem PharmBull，1983，31(10)：3691.)。但是，温和酸水解生成人参三醇或人参二醇的水解率不够高，因此，人参三醇或人参二醇分析测定条件的确定依赖于三七总皂苷水解条件的优化。
发明内容
发明目的
本发明提供了含有微量三七总皂苷的样品的检测方法，并研究口服含有次生苷元为人参二醇和/或人参三醇的三七总皂苷的药物动力学机制。
技术方案
本发明所述的一种三七总皂苷中人参二醇和/或人参三醇的微量检测方法，其步骤如下：a水解含有微量三七总皂苷的样品，b萃取水解产物，用HPLC、ESI和MS联用测定水解产物中的人参二醇和/或人参三醇，c以人参三醇的含量高低来代表样品中人参三醇为次生苷元的三七总皂苷的含量。
本发明所述的样品是含有以人参三醇为次生苷元的三七总皂苷中和/或其代谢物的血浆、尿液、粪便、唾液、胆汁、肠液、胃液和其他体液。
本发明所述的以人参二醇和人参三醇为次生苷元的三七总皂苷包括：
三七皂苷-A、三七皂苷-B、三七皂苷-C、三七皂苷-D、三七皂苷-K、人参皂苷-Ra3、人参皂苷-Rb1、人参皂苷-Rb2、人参皂苷-Rd、三七皂苷-Fa、三七皂苷-R4、绞股蓝皂苷-XVII，西洋参皂苷-R1，三七皂苷-RE、三七皂苷-RG、人参皂苷-F1、人参皂苷-Re、人参皂苷-Rg1、人参皂苷-Rg2、人参皂苷-Rh1、三七皂苷-R1、三七皂苷-R2、三七皂苷-R3、三七皂苷-R6、20-O-20-O-葡萄糖人参皂苷-Rf、三七皂苷-RH、三七皂苷-RI、三七皂苷-RJ。
本发明所述的皂苷来自三七总皂苷、及其提取物和以三七为活性成分的片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、以及其他制剂形式。
本发明所述的人参皂苷是人参皂苷Rg1。
本发明所述的反应介质是30％-70％乙醇水溶液。
本发明所述的酸是无机酸、有机酸。
本发明所述的酸是硫酸。
本发明所述的硫酸的浓度是3％-12％。
本发明所述的硫酸的浓度是5％-9％。
本发明所述的酸水解的反应温度是60℃-90℃。
本发明所述的酸水解的反应温度是65℃-85℃。
本发明所述的酸水解的反应时间是8小时-12小时。
本发明所述的酸水解的反应时间是10小时。
本发明所述的测定酸水解产物的HPLC和MS的检测条件是：
色谱条件：
色谱柱：C18，5μm，2.1mm×5.0cm；
流动相是：
乙腈 20-40体积份
甲醇 35-55体积份
1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液 20-30体积份
上述流动相中较为优秀的是：
乙腈 30体积份
甲醇 50体积份
2％的醋酸水溶液或2％磷酸水溶液 20体积份
流速0.2ml/min；定量进样体积20μl。
质谱条件：
离子源为涡流离子喷雾；
喷射电压为4000V，
扫描方式为多反应监测，
正离子检测，
用于检测的离子为人参三醇和或人参二醇的二级离子
上述技术方案中流动相还可以是：
甲醇 60-80体积份
1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液 20-30体积份
上述技术方案中流动相还可以是：
乙腈 60-80体积份
1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液 20-30体积份
有益效果
本发明采用将含有微量三七总皂苷的样品进行酸水解，使样品中的人参皂苷Rg1转化为人参三醇，经高效液相/电喷雾串联二级质谱系统进行分析证明能准确地测定人参三醇的浓度，从而准确地反映人参皂苷Rg1的血药浓度。该方法适合于含有人参皂苷Rg1的药物的动物和临床试验中人参皂苷Rg1的血药浓度的检测，对评价生物体对人参皂苷Rg1生物吸收和作用机理有着重要的作用。
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的详细说明。
附图说明
图1是空白硅烷化溶剂的GC色谱图。
图2是人参二醇对照品硅烷化后的GC色谱图。
图3是人参三醇对照品硅烷化后的GC色谱图。
图4是水解样品硅烷化后的GC色谱图。
图5是空白血浆样品的HPLC色谱图。
图6是对照品人参三醇的HPLC色谱图。
图7是血浆样品的HPLC色谱图。
图8是人参三醇浓度的标准曲线。
图9是犬口服三七总皂苷普通片后平均血药浓度-时间曲线。
图10是犬口服三七总皂苷普通片后的折算的血浆三七总皂苷浓度-时间曲线
具体实施方式
实施例1
三七总皂苷酸水解方法的建立(李云华等.超临界流体色谱法测定三七及云南白药中人参二醇和人参三醇的含量.药学学报，1991，26(10)：764。杨崇仁等.三七中达玛甾烷型皂甙的热不稳定性及酸水解产物.云南植物研究，1986，8(1)：87)
高效液相/电喷雾串联二级质谱测定血浆样品的第一步是三七总皂苷的酸水解，水解产率直接影响测定结果，因此我们对酸水解条件进行了优化。将水解产物中的人参三醇和人参二醇硅烷化后用气相色谱仪测定含量，以水解产率为评价指标优化了三七总皂苷酸水解条件。
1仪器、试药
1.1仪器
恒温水浴：GSY-II型，北京医疗设备厂
气相色谱仪(配有氢火焰离子检测器)：HP3398A，Beckman公司。
1.2试药
衍生化试剂：双-(三甲基硅烷基)乙酰胺：BSA，迪马公司
三甲基一氯硅烷：TMCS，迪马公司
三甲基硅烷咪唑：TMSI均为分析纯，迪马公司
人参二醇：购自中国药品生物制品检定所，批号：0701-9908
人参三醇：购自中国药品生物制品检定所，批号：0702-9908
其它试剂均为国产分析纯。
2方法、结果
2.1.1样品衍生化条件：
在含有水解产物人参三醇和人参二醇的干燥试管中加入混合衍生化试剂200μl，密塞，混匀，置70℃恒温水浴中反应20分钟，取出，放至室温，即得人参三醇(pt)和人参二醇(pd)的硅烷化衍生物。混合衍生化试剂为BSA∶TMCS∶TMSI＝3∶2∶1。
2.1.2气相色谱条件
填充石英毛细管柱：Bp5型，320μm×15m，膜厚0.25μm。
柱温：初始温度150℃；程序升温，最终温度300℃。
载气：高纯N2或氦气或氩气，流速2.0ml/min；
进样条件：进样室温度200-300℃，进样体积1μl；
检测器条件：氢火焰离子检测器(FID)或热导检测器，温度150-300℃，
2.1.3样品测定
定量吸取衍生化后的样品1μl，注入进样室，测定峰面积，同时以衍生化后的对照品溶液作对照，计算含量。
根据上面色谱条件测定的色谱图见图1、2、3、4。
2.2酸水解条件的探讨
根据文献，确定酸水解的基本条件，在此基础上，我们对水解的具体条件进行了优化。
2.2.1温度对水解反应产率的影响
固定反应液为5％硫酸(50％)乙醇溶液，反应时间为10小时，以100μg三七总苷为样品，调整反应温度分别为70℃、80℃、90℃、98℃(近沸腾)。通过测定反应后产物中人参三醇(pt)和人参二醇(pd)的量，来比较反应温度对产率的影响。结果见表1。
表1 温度对水解反应产率的影响(n＝3)
| 温度(℃) | 水解产物 | 峰面积 | 相应的量(μg) |
| 70809098 | 人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇 | 4017375±1105217905883±2055539328964±20057212741866±5960916771265±4604469625378±6834026208502±4532214589765±293745 | 4.2148.4899.78513.6837.10210.3366.5114.928 |
2.2.2反应时间对水解反应产率的影响
固定反应液为5％硫酸(50％)乙醇溶液，反应温度为80℃，以100μg三七总皂苷为样品，调整反应时间分别为5h、7h、10h、15h。来比较反应时间对产率的影响。结果见表2。将反应介质改为5％硫酸(50％)甲醇溶液，其他条件同上，结果见表3。
表2 5％硫酸(50％)乙醇溶液中反应时间对水解反应产率的影响(n＝3)
| 时间(h) | 水解产物 | 峰面积 | 相应的量(μg) |
| 571015 | 人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇 | 6388693±37693311629944±8373567460555±38794911035885±4855799328964±20057212741866±5960918114374±55177710638925±861753 | 6.70012.4887.82511.8519.78513.6838.51111.424 |
表3 5％硫酸(50％)甲醇溶液中反应时间对水解反应产率的影响(n＝3)
| 时间(h) | 峰面积 | 相应的量(μg) | |
| 571015 | 人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇 | 6346489±3363649205878±4510886667407±4533849203171±6902388153538±49736610304669±7316317924205±3882868166636±228665 | 5.9279.0646.2279.0627.61510.1477.4018.041 |
2.2.3硫酸浓度对水解反应产率的影响
固定反应时间为10小时，反应温度为80℃，以100μg三七总苷为样品，调整反应液中硫酸浓度分别为1％、5％、7％、10％。来比较反应液中硫酸浓度对产率的影响。结果见表4。
表4 反应液中硫酸浓度对水解反应产率的影响(n＝3)
| 浓度(％) | 峰面积 | 相应的量(μg) | |
| 15710 | 人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇人参二醇人参三醇 | 几无峰几无峰9328964±20057212741866±5960918126859±56075311998647±5639365445708±5282348376413±804136 | ----9.78513.6838.52412.8855.7128.995 |
通过以上实验，确定酸水解条件为：
三七总皂苷一定量(10mg以下)加入20ml具胶塞试管中，加入3ml 5％硫酸(50％)乙醇溶液，混匀，密塞，置80℃恒温水浴中反应10小时，60℃水浴中氮气吹至无醇味，用1ml水稀释，用水饱和的氯仿萃取三次(1.5ml/次)，合并氯仿层，用氯仿饱和的水洗涤两次(1.5ml/次)，将氯仿层转移至5ml具塞试管中，60℃水浴中氮气吹干，即得人参三醇(pt)和人参二醇(pd)。
实施例2
人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1的水解产率的测定
绝对加样回收率(萃取率)、Rb1和Rg1的水解产率考察
取约20μg人参二醇，加入相应溶剂，经萃取后，吹干溶剂，衍生化后测定峰面积A；取等量人参二醇，不经萃取而直接衍生化后测定峰面积B。人参三醇同样处理，测得峰面积A′、B′。根据峰面积比求得绝对加样回收率(萃取率)，结果见表5。
表5 绝对加样回收率(萃取率)结果(n＝5)
| 平均峰面积 | 人参二醇19.44μg | 人参三醇19.12μg |
| 萃取后直接测定回收率(％) | 18094259±41616720877188±37578986.7 | 20251031±48602523183779±39412487.35 |
分别取50μg Rb1和Rg1，按照确立的酸水解条件进行水解、萃取，衍生化后测定相应峰面积，并计算产物中人参二醇和人参三醇的量，与理论产量相比较，计算水解产率，结果见表6。
表6 Rb1和Rg1的水解产率(n＝5)
| Rb1 50μg | Rg1 50μg | |
| 平均峰面积测得量μg理论得量μg水解率(％) | 13626075±35427814.639529.712949.3 | 10764397±30140310.163220.758149.0 |
实施例3
人参皂苷Rg1生物体内样品“酸水解/高效液相/电喷雾串联二级质谱”测定方法的建立
1仪器、试药
1.1仪器及HPLC/MS/MS条件
恒温水浴：GSY-II型，北京市医疗设备厂。
液相色谱--质谱联用仪：API 3000，美国ABI公司
液相色谱条件：
液相色谱仪：Agilent 1100 series；
色谱柱：C18，5μm，2.1mm×5.0cm；
流动相：乙腈-甲醇-1％的醋酸水溶液(30∶45∶25)；
流速0.2ml/min；定量进样体积20μl。
质谱条件：
离子源为涡流离子喷雾；喷射电压为4000V。扫描方式为多反应监测，正离子
检测，用于检测的离子为人参三醇的二级离子m/z477.4→423.4。
1.2试药
人参三醇：购自中国药品生物制品检定所，批号：0702-9908
乙腈、甲醇均为色谱纯，其它试剂均为分析纯。
2方法
2.1血浆样品的处理、测定
沉淀蛋白质：精密量取血浆样品1ml，置10ml离心管中，在涡旋状态下缓慢滴加4ml甲醇，混匀，4000r/min离心10min，将上清液尽可能完全地转移至20ml具胶塞试管(水解管)中，并用1ml甲醇将沉淀再萃取一次，上清液也并入水解管中将上清液在60℃水浴中氮气吹干；
水解：在含有样品的水解管中，加入3ml 5％硫酸(50％)乙醇溶液，混匀，密塞，置80℃恒温水浴中反应10小时；
萃取：将反应液在60℃水浴中氮气吹至无醇味，用1ml水稀释，用水饱和的氯仿萃取三次(1.5ml/次)，合并氯仿，用氯仿饱和的水洗涤两次(1.5ml/次)，将氯仿层转移至5ml具塞试管中，60℃水浴中氮气吹干，即得含有人参三醇的水解产物。
测定：用100μl流动相溶解萃取后吹干的水解产物，进样20μl，以人参三醇的二级离子m/z477.4→423.4为检测信号，测定峰面积，代入标准曲线计算人参三醇的量。
2.2标准曲线建立
配制系列浓度的人参三醇标准甲醇溶液：7.8ng/ml、15.6ng/ml、31.2ng/ml、62.5ng/ml、125.0ng/ml、250.0ng/ml；分别精密量取每个浓度的标准液各100μl分别加入含有1ml空白犬血浆的10ml离心管中，混匀，相当于血浆中人参三醇浓度为0.78ng/ml、1.56ng/ml、3.12ng/ml、6.25ng/ml、12.50ng/ml、25.00ng/ml；以下处理同“血浆样品的沉淀蛋白质、水解(仅仅加入相应溶剂，不水浴)、萃取、测定方法”中的步骤。测定峰面积，以峰面积为纵坐标，血浆中人参三醇的浓度为横坐标，绘制标准曲线，并拟合直线回归方程。
2.3测定方法的考察
2.3.1日内和日间精密度考察
取标准曲线项下，相当于血浆浓度分别为0.78ng/ml、6.25ng/ml、25.00ng/ml的三个样品，一日内测定5次，计算日内精密度；连续5日每日测定一次，计算日间精密度。
2.3.2相对回收率(方法回收率)、绝对回收率(萃取率)考察
取空白犬血浆1ml，分别定量加入人参三醇0.78ng、6.25ng、12.50ng，按照“血浆样品的沉淀蛋白质、水解(仅仅加入相应溶剂，不水浴)、萃取、测定方法”中的步骤，测定峰面积；并将相同量的人参三醇直接测定峰面积。平行测定三份，根据测得结果计算相对回收率和绝对回收率：
相对回收率＝(萃取后测得量/加入量)×100％
绝对回收率＝(萃取后测得峰面积/直接测定的峰面积)×100％
2.3.3 Rg1水解产率的考察
取空白犬血浆1ml，分别定量加入Rg1 50ng、100ng、150ng，按照“血浆样品的沉淀蛋白质、水解、萃取、测定”方法中的步骤，测定峰面积，代入标准曲线计算人参三醇的量。平行测定三份，通过与理论产量的比较，计算水解产率。
人参三醇理论得量＝Rg1的量×476/801
Rg1水解率(％)＝(人参三醇测得量/理论得量)×100％
3结果
3.1根据确定的质谱条件，测得人参三醇对照品的二级扫描质谱图。
3.2按照确定的色谱条件测得的空白血浆、人参三醇对照品、血浆样品色谱图见图5、6、7。
由图5、6、7、可以看出，人参三醇对照品保留时间为3min，空白样品在此处无杂峰干扰，血浆样品峰形良好。
3.3人参三醇的标准曲线结果见图9。
对标准曲线进行直线回归，回归方程为：S＝488+2.41×103C r＝0.9935 n＝6线性范围0.78ng/ml～25.00ng/ml，最低检测限0.5ng/ml(S/N＝3)。
3.4方法考察的日内精密度和日间精密度结果，见表7、8。
表7 日内精密度测定结果(峰面积)
| 浓度ng/ml | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均 | SD | RSD(％) |
| 0.786.2525.00 | 21131583053019 | 24171521354561 | 25281499054667 | 23941607257381 | 26321625455464 | 24171567255018 | 1955481590 | 8.13.52.9 |
表8 日间精密度测定结果(峰面积)
| 浓度ng/ml | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均 | SD | RSD(％) |
| 0.786.2525.00 | 21131583053019 | 23541448354493 | 27231704357391 | 23701532855498 | 26101697053174 | 24341593154715 | 23910941808 | 9.86.93.3 |
由表6、7可以看出，日内精密度RSD％在3.1％～7.8％之间，日间精密度RSD％在5.2％～13.3％之间。即精密度均小于15％。
3.5人参三醇的加样回收率：相对回收率和绝对回收率结果，见表9。
表9 人参三醇的加样回收率(n＝3)
| 低浓度 | 中浓度 | 高浓度 | ||
| 加入量萃取后测定直接测定相对回收率绝对回收率 | (ng)峰面积测得量(ng)峰面积(％)(％) | 0.7802428±1670.8053207±192103.275.7 | 6.25015310±9616.15019503±83598.478.5 | 12.50029680±124412.11336915±115896.980.4 |
由表10可知，人参三醇的相对回收率(方法回收率)在96.9％～103.2％之间，绝对回收率(萃取率)在75.7％～80.4％之间，回收率比较稳定。
3.6人参皂苷Rg1水解产率结果，见表10。
表10 Rg1水解产率结果(n＝3)
| Rg1 50ng | Rg1 100ng | Rg1 150ng | |
| 平均峰面积测得量(ng)理论得量(ng)水解率(％) | 38297±179115.688429.712852.8 | 81689±391733.693859.425756.7 | 119286±620349.293889.138655.3 |
注：最后样品是用200μl流动相溶解。
由表10可知，Rg1水解产率在52.8％～56.7％之间，水解产率比较稳定。
实施例4
2.3.4三七总皂苷水解后人参三醇得率考察
取空白犬血浆1ml，分别定量加入三七总苷20.0ng、60.0ng、120.0ng，按照“血浆样品的沉淀蛋白质、水解、萃取、测定“方法中的步骤，测定峰面积，代入标准曲线计算人参三醇的量。平行测定三份，根据结果计算人参三醇的得率。
人参三醇得率(％)＝(测得的人参三醇量/加入总苷的量)×100％
三七总皂苷水解后人参三醇得率结果，见表11。
表11 三七总皂苷水解后人参三醇得率(n＝3)
| 总苷加入量(ng) | 测得量(ng) | 人参三醇的得率(％) | 平均得率(％) |
| 20.060.0120.0 | 2.75±0.228.39±0.5716.57±0.84 | 13.7513.9813.80 | 13.84 |
由表11可知，三七总皂苷水解后人参三醇得率为13.84％，比较稳定，可以用水解后人参三醇的量来推算三七总皂苷的量。
实施例5
犬口服三七总苷普通片的体内实验
1仪器、试药
三七总皂苷普通片，市售糖衣片：血塞通片(三七总皂苷片)，云南金泰得制药
总公司，批号：010502
犬：3只，杂种，健康，体重17.2±2.4kg。
其它同前。
2方法
2.1给药、采血方法
3只犬实验前禁食24小时，口服三七总皂苷普通片，按体重给药，剂量90mg/kg。
采血时间为：服药前5min、服药后0.5、1、2、6、8、12、16、24h，从前肢采静脉血3ml，肝素抗凝，以4000r/min离心10min，分离血浆，冷冻，备用。
2.2血浆样品的测定
按照血浆样品的“沉淀蛋白质、水解、萃取、测定”方法，测定采集的血浆样品中的人参三醇含量。
2.3结果处理
2.3.1药时曲线的绘制和相关参数的计算
以血浆中人参三醇浓度为纵坐标，采血时间为横坐标，以点到点的连接方式，绘制血药浓度-时间曲线，计算峰浓度Cmax、达峰时Tmax、药时曲线下面积AUC、平均驻留时间MRT等参数。
Cmax、Tmax用非房室模型法求得，AUC用梯形法求得，MRT＝AUMC/AUC，AUMC是以ct对t作图，所得的曲线下面积，用梯形法求得。
3结果
3.1以三只犬的平均血药浓度对时间作图，见图10。
3.2将每只犬的血药浓度对时间作图，采用点到点连接，得到药时曲线，计算相关药代动力学参数，3只犬血药浓度非房室模型法分析结果，见表12。
表12 3只犬血药浓度非房室模型法分析结果
| 1 | 2 | 3 | 平均 | SD | ||
| 普通制剂 | Cmax(ng/ml)Tmax(h)MRT(h)AUC0～24(h·ng/ml) | 13.94210.49190.40 | 11.1629.04132.83 | 12.6329.90117.07 | 12.5829.81146.77 | 1.3900.7338.60 |
Cmax(ng/ml)为峰浓度，Tmax(h)为达峰时，MRT(h)为平均驻留时间，AUC0～t(h·ng/ml)为0～t时间的药时曲线下面积。
3.3三七总皂苷的药时曲线
根据三七总皂苷水解后人参三醇的得率(13.84％)，将3只犬的平均血药浓度折算成三七总皂苷浓度，绘制药时曲线，以推算血浆中三七总皂苷的情况，结果见图11。三七总皂苷浓度＝人参三醇浓度/0.1384。
Claims (9)
1、一种含有微量三七总皂苷的样品的检测方法，其特征在于所述三七总皂苷的次生苷元为人参二醇和/或人参三醇，采用如下步骤进行：
a水解样品中的微量三七总皂苷，水解条件为：反应介质是30％-70％ 醇水溶液，硫酸的浓度是3％-12％，水解的反应温度是60℃-90℃，酸水解的反应时间是8小时-12小时；
b萃取水解产物，采取高效液相/电喷雾串联二级质谱系统测定水解产物中的人参二醇和/或人参三醇，其中，色谱条件：
流动相是：
乙腈 20-40体积份
甲醇 35-55体积份
1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液 20-30体积份
流速0.2ml/min；定量进样体积20μl；
质谱条件：
离子源为涡流离子喷雾；
喷射电压为4000V，
扫描方式为多反应监测，
正离子检测，
用于检测的离子为人参三醇和/或人参二醇的二级离子；
c以人参二醇和/或人参三醇的含量高低来代表样品中三七总皂苷的含量。
2、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的样品是含有微量的三七总皂苷和/或其代谢物的血浆、尿液、粪便、唾液、胆汁、肠液、胃液和其他体液。
3、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的三七总皂苷包括以下：
三七皂苷-A、三七皂苷-B、三七皂苷-C、三七皂苷-D、三七皂苷-K、人参皂苷-Ra3、人参皂苷-Rb1、人参皂苷-Rb2、人参皂苷-Rd、三七皂苷-Fa、三七皂苷-R4、绞股蓝皂苷-XVII，西洋参皂苷-R1，三七皂苷-RE、三七皂苷-RG、人参皂苷-F1、人参皂苷-Re、人参皂苷-Rg1、人参皂苷-Rg2、人参皂苷-Rh1、三七皂苷-R1、三七皂苷-R2、三七皂苷-R3、三七皂苷-R6、20-O-葡萄糖人参皂苷-Rf、三七皂苷-RH、三七皂苷-RI、三七皂苷-RJ。
4、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述水解条件中硫酸的浓度是5％-9％。
5、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述的酸水解的反应温度是65℃-85℃。
6、根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于所述的酸水解的反应时间是10小时。
7、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于采用高效液相/电喷雾串联二级质谱系统测定酸水解产物，检测条件中的流动相是：
甲醇 60-80 体积份
1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液 20-30 体积份。
8、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于采用高效液相/电喷雾串联二级质谱系统测定酸水解产物，检测条件中的流动相是：
乙腈 60-80 体积份
1-5％的醋酸水溶液或1-5％磷酸水溶液 20-30 体积份。
9、根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于采用高效液相/电喷雾串联二级质谱系统测定酸水解产物，检测条件中的流动相是：
乙腈 30体积份
甲醇 50体积份
2％的醋酸水溶液或2％磷酸水溶液 20体积份。
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