CN1322015C - 一种提取荒漠藻多糖的方法 - Google Patents

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本发明公开了一种提取荒漠藻多糖的方法。首先是配制荒漠藻培养液：采用硝酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬酸铁铵、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)、碳酸钠，微量元素溶液A5按比例配制；其次是荒漠藻的培养：控制温度、光强、光质、培养液通气条件；第三是荒漠藻粉的制备；第四是荒漠藻多糖的提取；第五是荒漠藻多糖的纯化、收获与干燥。本发明方法易行、操作方便、设备简单、产量高、产品质量好、安全可靠，适用于工业化规模生产。

Description

一种提取荒漠藻多糖的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种利用荒漠藻提取多糖的方法。
背景技术
目前，对荒漠藻的利用一般只停留在进行人工藻结皮上，对荒漠藻的其他应用开发几乎还是一片空白，涉足荒漠藻多糖的应用开发就更少了。荒漠藻之所以用于形成人工藻结皮进行荒漠治理，主要的是由于其富含藻多糖，多糖含量一般都在其干重的25％以上，有些甚至达到45％以上。
藻类多糖可以改变溶液流动学特征，增加溶液的粘度，形成稳定凝胶，可以作为絮凝剂；多糖大分子的亲水性和疏水性，可以作为乳化剂或生物凝聚剂，其结合电荷的能力，可用于去除废水中的重金属离子。因此，它们可以用于食品工业、制药工业、化妆品工业、纺织品工业和石油工业等。
国内的藻多糖大都是从螺旋藻和大型海藻中提取得到，它们的多糖含量大都比荒漠藻的要低，另外，培养螺旋藻和大型海藻的成本远比培养荒漠藻的成本要高。该方法避免了以往提取藻多糖的繁琐和产品质量的不稳定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取荒漠藻多糖的方法，此方法易行、操作方便、设备简单、安全可靠，成本低，产品质量好，适宜于工业化生产。
提取荒漠藻多糖的具体实施步骤如下：
I、培养液的配制：
按每升水加入硝酸钠0.8-2.5g、磷酸氢二钾0.02-0.05g、硫酸镁0.06-0.09g、氯化钙0.02-0.05g、柠檬酸0.004-0.008g、柠檬酸铁铵0.004-0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0.001-0.003g、碳酸钠0.01-0.04g，微量元素溶液A50.5-2ml，加入的同时最好搅匀；
II、荒漠藻的培养：
1、一级培养：由试管原种接入三角瓶(150-200ml)，静止培养或通气培养，通气培养时，调节气流大小在1.5-3.5L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在65-85μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃。当培养5-10天后，转入到二级培养。
2、二级培养：将一级培养所得的培养物接入到培养瓶(500-1000ml)，通气培养，调节气流大小在2.5-5L.min-1，无菌处理，光强控制在75-95μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃。当培养5-10天后，转入到三级培养。
3、三级培养：将二级培养所得的培养物接入到培养瓶(5000-20000ml)，通气培养，调节气流大小在3-6L.min-1，无菌处理，光强控制在70-100μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃。当培养5-10天后，为继续培养的接种种源。
4、继续培养：
(1)小循环培养池(1-2m3)培养：采用三级培养后所得的藻种，接入小的开放式跑道循环培养池，按每升培养液0.2-0.5g湿重的比例接入。采用玻璃温棚控制温度在22-35℃，利用自然光进行光照，采用遮荫网控制光照强度在120-1 80μE.m-2.s-1，叶轮或潜水泵搅动培养基。
(2)大循环培养池(40-60m3)培养：将小循环培养池中培养5-10天的荒漠藻转接到大循环培养池中，按小、大循环培养池中培养液的体积比为1∶20-25进行扩大。其他培养条件与小循环培养池的培养条件相同。
III、荒漠藻粉的制备：
将培养10-20天后的荒漠藻用泵抽到过滤装置——振动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得荒漠藻藻浆，然后将藻浆经过离心机离心，获得荒漠藻藻泥。经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到荒漠藻粉。
IV、荒漠藻多糖的抽提：
向荒漠藻粉中加入7-10倍重量的蒸馏水，充分搅匀。然后在70-90℃下，利用搅拌器不停地搅拌抽提3-5小时。在离心机中，5000-8000g离心10-15min，收集上清液。向上清液中加入等体积的氯仿-正丁醇(4-7∶1，v/v)溶液，振荡20-30min，5000-8000g离心10-15min。下层为有机溶剂，中层为藻蛋白沉淀，上层即为藻多糖溶液。收集藻多糖溶液，加入3-5倍体积的预先冷冻到0-4℃的无水乙醇，摇匀，静置10-20min，析出的白色絮状沉淀物即为荒漠藻多糖。5000-8000g离心5-10min收集多糖。
V、纯化、收获与干燥：
纯化：将上述所得粗多糖溶于4-6倍蒸馏水(w/v)中，用10-15倍(w/v)0℃冷的无水乙醇洗涤；
收获：将上述溶液在离心机中12000-15000g离心5-10min，收集沉淀物；
干燥：将收集到的多糖沉淀物在-60--110℃下冷冻干燥，得多糖产品。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和卓著的效果：方法易行、经济快捷、操作方便、设备简单、产量高、产品质量好、安全可靠，适用于工业化规模生产。
具体实施方式
提取荒漠藻多糖的具体实施步骤如下：
A、培养液的配制：
按每升水加入硝酸钠1.5g、磷酸氢二钾0.04g、硫酸镁0.075g、氯化钙0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬酸铁铵0.006g、乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)0.001g、碳酸钠0.02g，微量元素溶液A5lml；
B、荒漠藻的培养：
荒漠藻的培养情况，是其多糖产率高低的一个很重要的决定条件。因此，荒漠藻的整个生长过程，最好按照以下条件进行培养。
(1)一级培养：由试管原种接入三角瓶(150-200ml)，静止培养或通气培养，通气培养时，调节气流大小在2.5L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在70μE.m-2.s-1，温度控制在30℃。当培养7-10天后，转入到二级培养。
(2)二级培养：将一级培养所得的培养物接入到培养瓶(500-1000ml)，通气培养，调节气流大小在3L.min-1，无菌处理，光强控制在80μE.m-2.s-1，温度控制在30℃。当培养7-10天后，转入到三级培养。
(3)三培养：将二级培养所得的培养物接入到培养瓶(5000-20000ml)，通气培养，调节气流大小在5L.min-1，无菌处理，光强控制在90μE.m-2.s-1，温度控制在30℃。当培养7-10天后，便可作为大量培养的接种种源。
(4)继续培养：
①小循环培养池(1-2m3)培养：采用三级培养后所得的藻种，接入小的开放式跑道循环培养池，按每升培养液0.2-0.5g湿重的比例接入。采用玻璃温棚控制温度在30℃，利用自然光进行光照，采用遮荫网控制光照强度在120-180μE.m-2.s-1，叶轮或潜水泵搅动培养基。
②大循环培养池(40-60m3)培养：将小循环培养池中培养4-7天的荒漠藻转接到大循环培养池中，按小、大循环培养池中培养液的体积比为1∶20-25进行扩大。其他培养条件与小循环培养池的培养条件相同。
C、荒漠藻粉的制备：
将培养15-20天后的荒漠藻用泵抽到过滤装置——振动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得荒漠藻藻浆，然后将藻浆经过离心机离心，获得荒漠藻藻泥。经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到荒漠藻粉。
D、荒漠藻多糖的抽提：
向荒漠藻粉中加入7-10倍重量的蒸馏水，充分搅匀。然后在80℃下，利用搅拌器不停地搅拌抽提3-5小时。在离心机中，5000-8000g离心10-15min，收集上清液。向上清液中加入等体积的氯仿-正丁醇(5∶1，v/v)溶液，振荡20-30min，5000-8000g离心10-15min。下层为有机溶剂，中层为藻蛋白沉淀，上层即为藻多糖溶液。收集藻多糖溶液，加入3-5倍体积的预先冷冻到0-4℃的无水乙醇，摇匀，静置10-20min，析出的白色絮状沉淀物即为荒漠藻多糖。5000-8000g离心5-10min收集多糖。
E、纯化、收获与干燥：
纯化：将上述所得粗多糖溶于4-6倍蒸馏水(w/v)中，用10-15倍(w/v)0℃冷的无水乙醇洗涤；
收获：将上述溶液在离心机中12000-15000g离心5-10min，收集沉淀物；
干燥：将收集到的多糖沉淀物在-100℃下冷冻干燥，得多糖产品。

Claims (1)

1、一种提取荒漠藻多糖的方法，包括如下步骤：
A、培养液的配制：按每升水加入硝酸钠0.8-2.5g、磷酸氢二钾0.02-0.05g、硫酸镁0.06-0.09g、氯化钙0.02-0.05g、柠檬酸0.004-0.008g、柠檬酸铁铵0.004-0.008g、乙二胺四乙酸二钠盐0.001-0.003g、碳酸钠0.01-0.04g，微量元素溶液A50.5-2ml；
B、荒漠藻的培养：首先是一级培养，由试管原种接入三角瓶中，通气培养时，调节气流在1.5-3.5L.min-1，气流经过棉花球进行无菌处理，光强控制在65-85μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃，当培养5-10天后，转入到二级培养；其次是二级培养，将一级培养所得的培养物接入到培养瓶中，通气培养，调节气流在2.5-5L.min-1，无菌处理，光强控制在75-95μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃，当培养5-10天后，转入到三级培养；第三是三级培养，将二级培养所得的培养物接入到培养瓶中，通气培养，调节气流在3-6L.min-1，无菌处理，光强控制在70-100μE.m-2.s-1，温度控制在22-35℃，当培养5-10天后，为继续培养的接种种源；第四是继续培养，首先是循环培养池培养，采用三级培养后所得的藻种，接入开放式跑道循环培养池，按每升培养液0.2-0.5g湿重的比例接入，采用玻璃温棚控制温度在22-35℃，利用自然光进行光照，采用遮荫网控制光照强度在120-180μE.m-2.s-1，叶轮或潜水泵搅动培养基；其次是循环培养池培养，将循环培养池中培养4-7天的荒漠藻转接到循环培养池中，按循环培养池中培养液的体积比为1∶20-25进行扩大；
C、荒漠藻粉的制备：将培养10-20天后的荒漠藻用泵抽到过滤装置——振动斜面筛上，经过振动斜面筛后，收得荒漠藻藻浆，然后将藻浆经过离心机离心，获得荒漠藻藻泥，经浓缩、脱水、干燥、粉碎后得到荒漠藻粉；
D、荒漠藻多糖的抽提：向荒漠藻粉中加入7-10倍重量的蒸馏水，搅匀，然后在70-90℃下，利用搅拌器不停地搅拌抽提3-5小时，在离心机中，5000-8000g离心10-15min，收集上清液，向上清液中加入等体积的氯仿—正丁醇4-7∶1v/v溶液，振荡20-30min，5000-8000g离心10-15min，收集藻多糖溶液，加入3-5倍体积的预先冷冻到0-4℃的无水乙醇，摇匀，静置10-20min，析出的白色絮状沉淀物即为荒漠藻多糖，5000-8000g离心5-10min收集多糖；
E、纯化、收获与干燥：首先是纯化，将上述所得粗多糖溶于4-6倍蒸馏水中，用10-15倍0-4℃冷的无水乙醇洗涤；其次是收获，将上述溶液在离心机中12000-15000g离心5-10min，收集沉淀物；第三是干燥，将收集到的多糖沉淀物在-100℃下冷冻干燥，得多糖产品。
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