CN1321742A - 细胞培养方法及培养细胞用灌装气体的装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的用灌装二氧化碳气体来培养动物细胞的方法和实现该方法所采用的细胞培养用灌装气体的装置。该方法是让二氧化碳气体减压,除菌,灌装入培养瓶,拧紧瓶盖,置温箱中培养。实现该方法的装置由内盛二氧化碳气体的耐压钢瓶16,减压阀15,耐压导管14,通气连接盖12和除菌灌气管11依次连结密封而成。用该方法并采用该装置,可提供无菌的二氧化碳气体和无菌的灌装气体的微环境条件,有效地减少细胞发生污染的概率,保证细胞质量。
Description
本发明涉及细胞培养方法，具体地说，本发明涉及动物细胞的培养方法和实现该方法所采用的细胞培养用灌装气体的装置。
现阶段常采用的动物细胞培养方法是将动物细胞连同盛装细胞和培养液的培养瓶，在瓶盖微松，细胞瓶内与瓶外的气体能自由交换的状态下，放入湿度为60％-100％，二氧化碳浓度为5％的培养箱中恒温培养(R.Ian Freshney.Culture ofAnimal Cells,Alan R.Liss.Inc.,New York.1990；黄培堂译，D.L.斯佩克特著细胞实验指南科学出版社2001)。由于培养箱内的高湿度和合适的温度(20℃-45℃)，适宜微生物特别是霉菌生长，这样易造成处于培养中的细胞发生污染，尤其是反复开关培养箱的门时，环境中存在的微生物易进入培养箱，细胞发生污染的概率加大；另外购置与经常维修培养箱费用极其昂贵。
本发明的目的是提供新的细胞培养的方法，此方法克服了常规细胞培养方法的上述问题，而且应用此方法不需购置与维修二氧化碳培养箱，费用低廉。
本发明的另一个目的是提供一种细胞培养用灌装气体的装置，使用该装置，可使气体在无菌状态下进入细胞培养瓶。
一种细胞培养方法，其步骤是：
A 让高压二氧化碳气体减压成为低压气体，
B 低压气体经除菌灌气管过滤除菌成无菌二氧化碳气体，
C 细胞培养瓶口对着除菌灌气管的喷嘴，并置瓶口在除菌灌气
管的钟形罩内，
D 灌装二氧化碳气体入细胞培养瓶内，并
E 拧紧瓶盖，置细胞培养瓶于温箱中培养。
本发明所说的细胞培养瓶是指含有在细胞培养上认为的适量的细胞和适宜的细胞完全培养基的细胞培养瓶，这种的细胞培养瓶还带有瓶盖或瓶塞，瓶盖或瓶塞可以对细胞培养瓶进行完全的气密封，阻止瓶内和瓶外气体交换。这种细胞培养瓶可在市场上购得，如NUNCLONR牌T-25或T-75细胞培养瓶。
本发明所说的二氧化碳气体是指二氧化碳与空气的混合气体。二氧化碳气体体积占总气体体积的4.5-5.5，余量为空气。最佳配比为二氧化碳气体体积占总气体体积的5.0，余量为空气。本发明所说的二氧化碳气体在50-80公斤力/厘米2压力下贮藏在耐压钢瓶中，使用时，通过减压阀，在低压表压力指针为0.05-1.0公斤力/厘米2压力下，低压气体经除菌灌气管的过滤除菌腔中的填充物过滤除菌成无菌二氧化碳气体，再灌装入细胞培养瓶中，细胞培养瓶内的空气由二氧化碳气体置换。
灌装了二氧化碳气体的细胞培养瓶经拧紧瓶盖，置细胞至细胞所需温度的温箱中培养，温箱可以是普通水溶温箱如上海跃进医疗器械一厂生产的隔水式电热恒温培养箱或广东省医疗器械厂生产的生化培养箱。培养箱的温度调至细胞所需适宜的温度20℃-45℃之间，如常用的28℃或37℃。灌装二氧化碳气体来培养动物细胞的方法可培养所有的离体动物细胞如悬浮生长的细胞和贴壁生长的细胞。
正如二氧化碳培养箱中二氧化碳气体在细胞培养中所起的作用一样，灌装入细胞培养瓶内的二氧化碳气体起着同样的维持细胞培养瓶内微环境的PH值稳定和促进细胞代谢中气体交换的作用，瓶盖的拧紧阻止瓶内二氧化碳气体的外溢并防止微生物侵入培养瓶内。另外由于细胞培养瓶置于普通温箱内，这种温箱内没有潮湿的环境，不利微生物特别是霉菌在培养箱中的生长，这样也减少了培养的细胞发生污染的概率。
一种培养细胞用灌装二氧化碳气体的装置，由内盛二氧化碳气体的耐压钢瓶，减压阀，耐压导管，通气连接盖和除菌灌气管依次连结密封而成，其特征是：除菌灌气管11由喷嘴1，钟形罩2，通气管9和过滤除菌腔13组成，过滤除菌腔13内填装脱脂棉17，过滤除菌腔13通过通气管9与喷嘴1相通，喷嘴1置于钟形罩2内；通气连接盖12一端塞入过滤除菌腔13内，另一端依次连着耐压导管14，减压阀15和内盛二氧化碳气体的耐压钢瓶16。
钢瓶内的二氧化碳气体在高压压力为50-80公斤力/厘米2状态下贮存，随着使用，压力逐步降低，直至为0公斤力/厘米2。灌装气体时，二氧化碳气体通过减压阀，如氧气减压阀，在减压阀低压表指针为0.1-1.0公斤力/厘米2时，最好为0.3公斤力/厘米2压力时，使二氧化碳气体通过除菌灌气管11的过滤除菌腔13内的无菌脱脂棉17，气体变成无菌的二氧化碳气体，通过喷嘴1，进入细胞培养瓶，置换瓶内已存在的空气。除菌灌气管11在使用时，最好置于正在工作的生物安全台或称超净工作台的无菌区上。
除菌灌气管11最好由玻璃制造，这样可反复高压蒸气灭菌并易于观察。过滤除菌腔13内盛的脱脂棉17可随时更换，并可随除菌灌气管一同高压灭菌，成为无菌脱脂棉，在二氧化碳气流通过时起过滤除菌作用。
作为本发明的改进，置于钟形罩2内的喷嘴1离钟形罩2外围有1-5厘米距离，钟形罩2与通气管9融为一体。钟形罩2在灌装二氧化碳气体时保护喷嘴微区间和细胞培养瓶口的无菌环境，以免污染正在灌气中的细胞培养物。
作为本发明的进一步改进，除菌灌气管11还带有一个阀门8，该阀门8位于过滤除菌腔13和喷嘴1之间的通气管9中。阀门8由锥形旋塞3和与之大小吻合，形状相匹配的锥形活塞套5组成，旋塞3的锥顶部为螺纹10，并伸出活塞套5外，垫圈6和螺帽7将旋塞3固定在活塞套5内，在旋塞上有导气孔4，在导气孔4与通气管9水平时，导气孔4与通气管9相通。活塞套5与除菌灌气管11一样由玻璃制造，并与通气管9连成为一个整体；旋塞4，垫圈6，螺帽7由塑料制造，以利气体密封。
在一个细胞培养瓶灌装二氧化碳气体完毕转换另一细胞培养瓶时，将旋塞3旋转90度，导气孔4与通气管9垂直，阀门关闭，阻止二氧化碳气体通过导气孔4，以节约二氧化碳气体，浪费减少。
采用灌装气体来培养细胞的方法可最大限度地避免培养中的细胞发生细菌、放线菌、真菌污染，特别是霉菌污染，而灌装入细胞培养瓶内的二氧化碳气体又调节着密封培养瓶内微环境中PH值的恒定，即调节着细胞瓶内培养液的PH值恒定，满足培养中的细胞对二氧化碳的需求。
采用本发明提供的二氧化碳灌气装置，可提供无菌的二氧化碳气体和无菌的灌装气体的微环境条件。除菌灌气管中的过滤除菌腔内的无菌脱脂棉，可对二氧化碳气体过滤除菌，而钟形罩有效地遮挡着外界的气流可能造成的污染，保护喷嘴与培养瓶的无菌环境。
采用灌装气体方法培养细胞，无污染发生，细胞质量稳定，且费用减少50％。
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明灌装气体的装置示意图
图2是本发明灌装气体的装置中除菌灌气管结构的剖视图。
图3是本发明灌装气体的装置的除菌灌气管中阀门的结构示意图。
图4是本发明灌装气体的装置的除菌灌气管中阀门的结构另一示意图。
本发明灌装气体的装置如图1所示，由内盛二氧化碳气体的耐压钢瓶16，减压阀15，耐压导管14，通气连接盖12和除菌灌气管11依次连结密封而成。本发明的除菌灌气管11结构如图2所示，除菌灌气管11由喷嘴1，钟形罩2，通气管9和过滤除菌腔13组成，过滤除菌腔13内填装脱脂棉17，过滤除菌腔13通过通气管9与喷嘴1相连，喷嘴1置于钟形罩2内。通气连接盖12一端塞入过滤除菌腔13内，另一端依次连着耐压导管14，减压阀15和内盛二氧化碳气体的耐压钢瓶16。钢瓶内的二氧化碳气体在高压压力为50-80公斤力/厘米2状态下贮存，随着使用，压力逐步降低，直至为0公斤力/厘米2。使用时，二氧化碳气体通过减压阀15，如氧气减压阀，在减压阀低压表指针为0.1-1.0公斤力/厘米2时，最好为0.3公斤力/厘米2压力时，使气体通过除菌灌气管11的过滤除菌腔13内的无菌脱脂棉17，二氧化碳气体变成无菌的二氧化碳气体，通过喷嘴1，进入细胞培养瓶，置换瓶内已存在的空气。除菌灌气管11在使用时，最好置于正在工作的生物安全台内或超净工作台的无菌区间内。
作为本发明的改进，置于钟形罩2内的喷嘴1离钟形罩2外围有1-5厘米距离，钟形罩2与通气管9融为一体。钟形罩2在灌装二氧化碳气体时保护喷嘴微区间和细胞培养瓶口的无菌环境，以免污染正在灌气中的细胞培养物。
作为本发明的进一步改进，除菌灌气管11还带有一个阀门8，阀门结构如图3和图4所示，该阀门8位于过滤除菌腔11和喷嘴1之间的通气管9中。阀门8由锥形旋塞3和与之大小吻合，形状相匹配的锥形活塞套5组成，旋塞3的锥顶部为螺纹10，并伸出活塞套5外，垫圈6和螺帽7将旋塞3固定在活塞套5内，在旋塞3上有导气孔4，导气孔4与通气管9相通。活塞套5与除菌灌气管11一样由玻璃制造，并与通气管9连成为一个整体；旋塞3，垫圈6，螺帽7由塑料制造。
在一个细胞培养瓶灌装二氧化碳气体完毕转换另一细胞培养瓶时，将旋塞3旋转90℃，如图4所示，导气孔4与通气管9方向垂直，阀门关闭，阻止二氧化碳气体通过导气孔4，以节约二氧化碳气体，浪费减少。
当灌装二氧化碳气体时，可按如下顺序操作：
1)打开二氧化碳钢瓶16的高压阀门；
2)调整减压阀15的低压阀值为0.1-1.0公斤力/厘米2，最好为0.3公斤力/厘米2；
3)在超净工作台无菌区打开细胞培养瓶盖；
4)将细胞培养瓶口对着除菌灌气管11的喷嘴1，且瓶口置于钟形罩2内；
5)二氧化碳气体灌入细胞培养瓶内，持续时间15-60秒；
6)立即拧紧瓶盖，常规培养；
7)降低低压阀值至0；
8)关闭高压阀门。
当连续灌装2个或多个细胞培养瓶时，可在上述步骤6后将旋塞3旋转90度，关闭阀门8，以阻止二氧化碳气体通过，再打开另一培养瓶瓶盖，并将旋塞3再旋转90度，重复上述步骤3-6，实现多次灌装二氧化碳气体又节约二氧化碳气体的目的。
采用灌装气体的方法培养动物细胞，可有效地减少细胞发生污染的概率，保证培养过程中的细胞质量。与常规方法相比，因不需购置与维修二氧化碳培养箱，费用低廉。
可对本发明稍加改进，可对工业化大规模动物细胞培养所使用的容器如转瓶等进行灌装二氧化碳气体，并起到类似二氧化碳培养箱的作用。
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步说明：
实施例1
将除菌灌气管用牛皮纸包裹或置牛皮纸袋内，118℃蒸汽灭菌20分钟，即得到无菌的除菌灌气管，脱脂棉也为无菌脱脂棉。
实施例2
将内盛二氧化碳气体的耐压钢瓶，减压阀，耐压导管，通气连接盖和实施例1中已无菌处理的除菌灌气管依次连结密封，除菌灌气管置于正在工作的生物安全台内的无菌区间内，成为培养细胞用灌装气体的装置。
实施例3
带有阀门的除菌灌气管取代实施例2中的除菌灌气管，其它部件和连接相同，除菌灌气管置于正在工作的生物安全台内的无菌区间内，成为培养细胞用灌装气体的装置。
实施例4
利用实施例2的装置，打开二氧化碳钢瓶的高压阀门，高压阀值为75公斤力/厘米2，调整减压阀的低压阀值为0.5公斤力/厘米2，在超净工作台无菌区打开内含总数为5×105个的急性白血病细胞系HL-60(CCTCC GDC028)细胞的培养瓶盖，将细胞培养瓶口对着除菌灌气管的喷嘴，且瓶口置于钟形罩内，二氧化碳气体灌入细胞培养瓶内，持续时间30秒，立即拧紧瓶盖，常规培养；降低低压阀值至0公斤力/厘米2，关闭高压阀门。
实施例5
利用实施例2的装置，打开二氧化碳钢瓶的高压阀门，高压阀值为25公斤力/厘米2，调整减压阀的低压阀值为0.05公斤力/厘米2，在超净工作台无菌区打开内含总数为3×105个的人乳腺癌细胞系MCF-7(CCTCC GDC055)细胞的培养瓶盖，将细胞培养瓶口对着除菌灌气管的喷嘴，且瓶口置于钟形罩内，二氧化碳气体灌入细胞培养瓶内，持续时间60秒，立即拧紧瓶盖，常规培养；降低低压阀值至0公斤力/厘米2，关闭高压阀门。
实施例6
利用实施例3的装置，打开二氧化碳钢瓶的高压阀门，高压阀值为55公斤力/厘米2，调整减压阀的低压阀值为1.0公斤力/厘米2，在超净工作台无菌区打开含总数为5×105个的人乳腺癌细胞系MCF-7(CCTCC GDC055)细胞的培养瓶盖，将细胞培养瓶口对着除菌灌气管的喷嘴，且瓶口置于钟形罩内，二氧化碳气体灌入细胞培养瓶内，持续时间15秒，立即拧紧瓶盖，常规培养；将旋塞旋转90℃，在超净工作台无菌区打开另一内含细胞总数为6.8×105个的猴肾细胞VREO(CCTCCGDC029)的培养瓶盖，将细胞培养瓶口对着除菌灌气管的喷嘴，且瓶口置于钟形罩内，将旋塞逆方向旋转90℃，二氧化碳气体灌入细胞培养瓶内，持续时间20秒，立即拧紧瓶盖，常规培养；降低低压阀值至0公斤力/厘米2，关闭高压阀门。
实施例7
取2×105个的人血液单核细胞THP-1(CCTCC GDC100)至T-25的细胞培养瓶内，并含8mL培养基，一瓶充装5％二氧化碳气体后紧瓶盖置37℃恒温箱培养(A组，灌气培养)，另一瓶微松瓶盖置37℃、5％CO2。80-100％湿度的二氧化碳培养箱中培养(B组，常规培养)，72小时后，倒置显微镜下观察细胞生长状况，并对每瓶细胞内总细胞数计量，A组：细胞生长良好，细胞总数1.3×106个；B组：细胞生长良好，细胞总数1.35×106个。
实施例8
按实验例7的方法，取5×105个的昆虫细胞SF9(CCTCC GDC009)，培养温度为25℃，分A,B二组，96小时后，倒置显微镜下观察细胞生长状况，并对每瓶细胞内总细胞数计量，A组：细胞生长良好，细胞总数1.5×106个；B组：细胞生长良好，细胞总数1.4×106个；
实施例9
按实验例7的方法，取1×105个的细胞的大鼠肝癌细胞系H4-IIE(CCTCCGDC104)，培养温度为37℃，消化液为0.25％的胰蛋白酶，分A,B二组，72小时后，倒置显微镜下观察细胞生长状况，并对每瓶细胞内总细胞数计量，A组：细胞生长良好，细胞总数2.3×106个；B组：细胞生长良好，细胞总数2.3×106个。
实施例10
按实验例7的方法，取3×105个的人血液单核细胞THP-1，分A、B二组，各取10瓶，每72小时传代细胞一次，连续传代10次，A组污染为0,B组污染率为50％。
Claims (5)
1．一种细胞培养方法，其步骤是：
A 让高压二氧化碳气体减压成为低压气体，
B 低压气体经除菌灌气管过滤除菌成无菌二氧化碳气体，
C 细胞培养瓶口对着除菌灌气管的喷嘴，并置瓶口在除菌灌气
管的钟形罩内，
D 灌装二氧化碳气体入细胞培养瓶内，
E 拧紧瓶盖，置细胞培养瓶于温箱中培养。
2．根据权利要求1所述的细胞培养方法，其特征是：二氧化碳气体是二氧化碳与空气的混合气体，二氧化碳气体体积占总气体体积的4.5-5.5，余量为空气。
3．根据权利要求2所述的细胞培养方法，其特征是：二氧化碳气体体积占总气体体积的5.0，余量为空气。
4．一种培养细胞用灌装二氧化碳气体的装置，由内盛二氧化碳气体的耐压钢瓶，减压阀，耐压导管，通气连接盖和除菌灌气管依次连结密封而成，其特征是：除菌灌气管(11)由喷嘴(1)，钟形罩(2)，通气管(9)和过滤除菌腔(13)组成，过滤除菌腔(13)内填装脱脂棉(17)，过滤除菌腔(13)通过通气管(9)与喷嘴(1)相连，喷嘴(1)置于钟形罩(2)内。通气连接盖(12)一端塞入过滤除菌腔(13)内，另一端依次连着耐压导管(14)，减压阀(15)和内盛二氧化碳气体的耐压钢瓶(16)。
5．根据权利要求4所述的培养细胞用灌装二氧化碳气体的装置，其特征是：除菌灌气管(11)还带有一个阀门(8)，该阀门(8)位于过滤除菌腔(13)和喷嘴(1)之间的通气管(9)中。阀门(8)由锥形旋塞(3)和与之大小吻合，形状相匹配的锥形活塞套(5)组成，旋塞(3)的锥顶部为螺纹(10)，并伸出活塞套(5)外，垫圈(6)和螺帽(7)将旋塞(3)固定在活塞套(5)内，在旋塞上有导气孔(4)，在导气孔(4)与通气管(9)水平时，导气孔(4)与通气管(9)相通。活塞套(5)与除菌灌气管(11)一样由玻璃制造，并与通气管(9)连成为一个整体。
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